Name: 원심 중력에 의해 지방이 유래 줄기 세포의 연골 분화 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 지방 유래 줄기 세포의 연골 분화 유도 방법을 원심 중력을 이용하여. 사이토카인 없이 SOX9 상향 조절을 통해 연골 재생 치료에 활용할 수 있는 기술입니다.

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본 연구는 보건복지부(보조금번호: HI14C2116)의 지원을 받은 한국보건산업진흥원(KHIDI)의 한국보건기술연구개발사업(Korea Health Technology R&D Project)의 지원금과 가톨릭대학교 서울성모병원 연구기금의 지원을 받았다.

이 연구 프로토콜은 NIH 지침에 따라 가톨릭 대학교 (KC16EAME0162)의 기관 검토위원회의 승인을 수행 하였다. 모든 조직은 서면 통보 동의를 얻었다. 1. 원심 중력로드 및 펠렛 문화 <ol><li> 세포 배양 및 수확 <ol><li> 배양의 ASC (P2-P3, 자재 목록 참조), 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 배지 낮은 글루코즈 (DMEM-LG)에서 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터있다. </li><li> 세포가 80 % 합류에 도달했을 때, 배지를 버리고 1X 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)으로 세포를 세척 하였다. </li><li> PBS 함유 1mM의 EDTA 1 ㎖를 첨가하고, 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 2 분간 배양한다. </li><li> 에 세포를 전송, 부드럽게 문화 판을 눌러 새로운 배지 4 mL를 넣고15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기 실온에서 2 분 (RT) 250 × g에서 세포. </li></ol></li><li> 원심 중력 하중 <ol><li> 원심 분리 (단계 1.1.4) 후, 펠렛을 교란시키지 않고 상층 액을 제거하고, 10 % FBS와 DMEM-LG 10ml에 펠렛을 재현 탁. 혈구 세포를 사용하여 계산. </li><li> CG로드를 들어, 15 분 동안 2,400 × g에서 새로운 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 2.5 × 10 5 세포를 전송합니다. </li></ol></li><li> 펠렛의 문화 <ol><li> 즉시 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 정의 연골 분화 배지 500 μL를 추가 (CDM은 고 글루코스 DMEM는 1 % FBS, 1 % ITS + 프리믹스, 100 나노 덱사메타손, 1X MEM 비 필수 아미노산 용액, 50 μg의 보충 / ㎖ L - 프롤린, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신). 모든 매체 변화에 새로 제조 된 L- 아스 코르 빈산 2- 인산의 50 μg의 / ML을 추가합니다. 양성 대조군으로, 연골 유도 differentiati추가하여 원심 분리하지 않은 세포에 CDM은 10 NG / mL의 TGF-β1을 포함. </li><li> 서 위치 펠렛을 함유하는 튜브를 캡핑 느슨하게 삽입하고, 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 삼주 위해 매일 매체를 변경합니다. </li></ol></li><li> Micromass 문화 <ol><li> 즉시 원심 분리 (단계 1.2.2 15 분 동안 2,400 ×의 g) 후, 뜨는을 대기음 및 CDM의 10 μL에 펠렛을 재현 탁. </li><li> micromass을 형성하기 위해, 24- 웰 플레이트의 웰의 중앙에 재현 탁하고 세포를 배치했다. </li><li> 2 시간 후, 조심스럽게 micromass을 방해하지 않도록 접시의 벽에 잘 피펫에 CDM 1 mL를 넣어. 양성 대조군으로, 10 NG / ㎖ TGF-β1을 포함하는 CDM을 첨가하여 원심 분리하지 않은 세포와 micromass 배양을 수행한다. </li><li> 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 배양 한 micromass. </li><li> 매체 EV 변경삼주에 대한 다른 일 ERY. </li></ol></li></ol> 2. 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 연골 세포 분화 마커 전사 상향 조절을 검출하도록 <ol><li> 14 일에, 1X PBS에서 그들을 새로운 1.5 ML의 튜브에 회전 타원체 펠렛을 전송하고 씻어 피펫을 사용합니다. </li><li> 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 페놀 - 클로로포름 추출 방법 (9)를 사용하여 펠렛에서 총 RNA를 추출합니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 역전사 효소를 이용하여 총 RNA로부터 2 μg의 cDNA의 합성 (1 시간 동안 42 ° C에서 부화 한 다음 5 분 동안 70 ℃에서 효소를 실활). </li><li> 연골 분화 마커 (10)에 대한 특정 프라이머로 PCR을 수행합니다. </li></ol> 3. 염색은 연골 분화 마커 단백질의 과발현을 감지하는 <ol><li> 파라핀 포함 세포 펠렛 <ol><li> 21 일에,회전 타원체 펠렛을 수확하고 1X PBS로 씻어 피펫을 사용합니다. </li><li> 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 침수에 의한 회전 타원체의 알약을 수정합니다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 매우 독성이다. 눈, 피부 또는 점막과의 접촉을 피하십시오. 노출을 최소화하고 준비하는 동안 흡입을 피하십시오. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. </li><li> 정착액을 취소하고 탈 이온수 (DW)와 세포 펠렛을 씻어. </li><li> 카세트에 거즈의 한 층을 삽입하고 피펫을 사용하여 고정 된 펠렛을 전송합니다. 거즈를 접어 펠렛을 덮고 카세트 뚜껑을 닫습니다. </li><li> 펠렛을 탈수. <ol><li> RT에서 5 분 동안 70 % 에탄올 (EtOH 중)의 펠릿을 담근다. </li><li> RT에서 5 분 동안 80 % EtOH로의 알약을 담가. </li><li> RT에서 5 분 동안 95 % EtOH로의 알약을 담가. </li><li> RT에서 5 분 동안 100 %의 EtOH의 알약을 담가. 두 번 반복합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 100 % 크실렌의 알약을 담가. 반복 트위어가전. </li></ol></li><li> 금형에 56 ° C에서 파라핀에 고정 된 세포 펠렛을 포함; 펠릿 전문 자동화 조직 처리 시스템을 사용하여 파라핀에 매립 될 수있다. </li><li> 회전 마이크로톰을 이용하여 파라핀 세포 펠릿으로부터 두께 5㎛의 부분을 잘라. </li><li> 50 %의 EtOH의 섹션 플로트 다음 슬라이드를 사용하여 50 ℃의 수조로 옮긴다. </li><li> 슬라이드에 떠있는 섹션을 배치합니다. </li></ol></li><li> Safranin O 및 알 시안 블루 염색 <ol><li> 파라핀 섹션 재수. <ol><li> 15 분 동안 크실렌의 슬라이드를 담가. 두 번 반복합니다. </li><li> 5 분 동안 100 % EtOH 중 슬라이드를 담근다. 두 번 반복합니다. </li><li> 5 분 동안 90 %의 EtOH에 슬라이드를 담근다. </li><li> 5 분 동안 80 %의 EtOH에 슬라이드를 담근다. </li><li> 5 분 동안 70 % EtOH로의 슬라이드를 담가하고 1X PBS에서 그들을 씻는다. </li></ol></li><li> 1 % Safranin O 솔루션 3 % 알 시안 블루 용으로 재수 섹션을 얼룩30 분. </li><li> 염색 솔루션을 취소하고 DW와 섹션을 씻어. </li><li> 1 분 동안 헤 마톡 실린 / 에오신 용액 (Counterstain과)와 섹션을 얼룩. </li><li> 염색 솔루션을 취소하고 DW와 섹션을 씻어. </li><li> 잔여 물을 제거 한 후 커버 슬립에 장착 매체의 드롭을 놓습니다. 조심스럽게 장착 매체를 포함하는 커버 슬립에 슬라이드 (아래 셀 측)을 배치합니다. </li><li> 슬라이드는 실온에서 2 ~ 3 시간 동안 건조하도록 허용합니다. </li><li> 밝은 필드 현미경 (자동화 직립 현미경, 50X 및 200X)를 사용하여 이미지를 캡쳐. </li></ol></li><li> 면역 형광 분석 <ol><li> 섹션 3.2.1에 설명 된대로 섹션을 재수. </li><li> 시트르산 나트륨 완충액에서 슬라이드 (10 mM의 시트르산 나트륨, 0.05 % 트윈 20, pH를 6.0)에 담가하고, 마이크로파를 이용하여 10 분 동안 서브 끓는 온도들을 유지한다. </li><li> 실온에서 20 분 동안 슬라이드를 냉각 한 후 수돗물로 씻어. </li><li> 3 %에서 슬라이드를 부화H 2 O 다음 15 분 동안 (1X PBS)에 2, 15 분 11 수돗물로 씻는다. </li><li> 1 시간 동안 완충액 (PBS 중 10 % 정상 염소 혈청)을 차단와 슬라이드 블록. </li><li> 블로킹 용액을 흡인하고 슬라이드 상 5 % 정상 염소 혈청으로 희석 차 항체를 적용한다. </li><li> 4 ℃에서 밤새 슬라이드를 품어. </li><li> 5 분마다 1X PBS에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 5 % 정상 염소 혈청으로 희석하고, 형광 접합 된 이차 항체의 슬라이드를 부화. </li><li> 어둠 속에서 5 분마다 1X PBS에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오. </li><li> 10 분 동안 DAPI (1 μg의 / mL)으로 슬라이드를 품어하고 5 분마다 1X PBS에서 그들에게 두 번 씻는다. </li><li> 잔여 물을 제거 한 후 커버 슬립에 장착 매체의 드롭을 놓습니다. 조심스럽게 설치 매체에 슬라이드 (아래 셀 측)을 배치합니다. </li><li> 슬라이드 2-3에 대한 건조하도록 허용실온에서 어둠 속에서 시간. </li><li> 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 시각화 (594 nm의 DAPI : 루비로드 340 nm의, 60X 및 200X 배율) 12. </li></ol></li></ol>

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</ol>

우리는 이 작업과 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.

세포의 stemness 상태는 SOX9의 CG에 의한 과잉 발현에 매우 중요합니다. 우리의 연구에서, SOX9 표현은 아니지만 나중에-통로의 ASC에서, 초기 통로의 ASC (2-3)에서 CG에 의해 유도 될 수있다. 배양 동안의 ASC 3 통로 (16)까지 CD34 + 세포를 포함하는 것으로보고되었다. 의 ASC는 세포가 CG로 낮은 반응의 결과로 계대 CD34의 발현을 상실하는 경향이있다. 원심 중력으로, 수압은 CG 자극하는 동안 세포에로드 할 수 있습니다. 따라서, 매질의 부피 SOX9의 유도에 영향을 미치는 하나의 요인 일 수있다. 각 실험에 대한 짝수 정수압 환경을 유지하기 위해, 배지 1 ㎖를 15 ㎖의 튜브에 1 × 105 세포 당 사용 하였다. 또한, 스윙 버킷 로터가 균일 (직각을 형성함으로써) 세포에 CG를 적용 하였다. TGF-β1에 비해 C...

관절 연골의 결함은 자연적으로 치유되지 않습니다. 따라서, 세포 이식이 손상 연골의 수리를 위해 유망한 방법으로 제안 된 줄기. 그러나,이 방법은 줄기 세포의 충분한 수의 취득 및 연골 분화를 받아야하는 이러한 세포의 유도를 모두 요구한다. 골수 (BM)은 널리 줄기 세포의 공급원으로서 사용되었지만, BM 세포의 분리는 두 가지 단점이있다 : 침입 불충분 수율. 때문에 취득 용이성, 지방 조직에서 줄기 세포의 바람직한 소스이다. 이전의 연구는 지방 조직으로부터 줄기 세포를 분리 및 TGF-β1 (1, 2)과 같은 사이토 카인을 사용하여 이들 세포의 연골 분화를 유도하는 가능성을 입증 하였다. 이러한 방법은 효과가 있지만 비싸다. 사이토킨에 대한 저비용 대안으로서, 기계적 응력에 사용될 수있다연골 분화를 유도한다. 기계적 부하는 관절 연골 (3)의 상태를 유지하는데 중요한 역할을하고, 여러 가지 세포의 연골 세포 표현형을 유도 할 수있다. 예를 들어, 수압은 MAP 키나아제 / JNK 경로 4를 통해 활막 유래 전구 세포의 연골 세포 표현형을 유도하고, 기계 압축비는 연골 세포의 유전자 5 상승 조절하여 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)에서 연골을 유도한다. 또한, 전단 응력은 인간 중간 엽 줄기 세포의 연골 6 관련된 세포 외 기질 (ECM)의 발현에 기여한다. 원심 중력 (CG)를 원심 분리에 의해 용이하게 생성 된인가 제어 기계적 응력은 셀 7에서 차등 유전자 발현을 유도 할 수있다. 예를 들어, 폐 상피 암종 세포에서 인터루킨 (IL) -1b의 발현을 원심 분리 (8)에 의해 상향 조절된다. 티herefore, 실험적으로 유도 기계적 응력으로서, CG는 줄기 세포의 연골 세포에서 유전자 발현을 유도 할 수있다. 그러나, CG는 줄기 세포의 연골 분화를 유도 할 수 있는지 불분명. 본 연구에서는 CG가 연골 세포 유전자의 과발현의 결과로, 인간의 ASC에서, SOX9의 상향 조절, 연골의 마스터 레귤레이터를 유도 한 것으로 나타났습니다. 또, TGF-β1의 것과 연골에 CG의 효과, 성장 인자는 가장 일반적으로 줄기 세포에서 시험 관내 연골을 유도하는 데 비해.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm 접시</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 접시</td><td>TPP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cornical 관</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Cornical 관</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 일회용 피펫</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 일회용 피펫</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">ASC Culture Media Materials</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 저당</td><td>Life Technologies</td><td>11885-084</td><td>성장 기반 매체</td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>10%</td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chondrogenic Differentiation Media Materials</td></tr><tr><td>DMEM High glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td>연골 생성 분화 기본 매체</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마 알드리치</td><td>D2915</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>생명 기술</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>생명 기술</td><td>16000-044</td><td>1%</td></tr><tr><td>아스코르베이트-2-인산염</td><td>시그마 알드리치</td><td>A8960</td><td>50 &#956; g/mL</td></tr><tr><td>L-프롤린</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P5607</td><td>50 &#956; g/mL</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td></td> 354352 <td>1%</td></tr><tr><td>Human TGF&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>18 mm 커버 유리</td><td>우수한</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알디히드</td><td>Tech & 혁신</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>벡터 랩</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>안티콜라겐 II 항체</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>염소 anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Molecular Probe</td><td>A-11037</td><td>1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probe</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass, 코팅</td><td>현일 Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마 알드리치</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>이소프리필알코올</td><td>밀리포어</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA 합성 키트</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>로딩 스타</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) DNA 래더 마커</td><td>효소학</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>인간 지방 유래 줄기 세포 (ASC)</td> <td>카톨릭 마스터 세포</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

원심 중력에 의해 지방이 유래 줄기 세포의 연골 분화 유도

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

손상된 연골은 자연적으로 치유될 수 없습니다. 현재 연골 결손증에 대한 가장 발전된 치료법은 사이토카인을 사용하여 줄기세포에서 분화된 연골세포를 이식하는 것입니다. 안타깝게도, 사이토카인에 의한 연골형성 분화는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며 in vitro 분화 중 오염 위험이 높습니다. 그러나 생체역학적 자극은 연골 형성에 대한 중요한 조절 요인으로도 작용합니다. 예를 들어, 기계적 스트레스는 줄기세포의 연골형성 분화를 유도할 수 있으며, 이는 손상된 연골을 복구하기 위한 잠재적인 치료법을 제시합니다. 본 연구에서는 원심분리에 의해 쉽게 가해지는 기계적 응력인 원심중력(CG, 2,400 × g)이 지방 유래 줄기세포(ASC)에서 성 결정 영역 Y(SRY)-box 9(SOX9)의 상향 조절을 유도하여 연골 생성 표현형을 발현하도록 한다는 것을 입증했습니다. 원심분리된 ASC는 아그레칸(ACAN), 콜라겐 유형 2 알파 1(COL2A1) 및 콜라겐 유형 1(COL1)과 같은 연골 형성 분화 마커의 수치가 더 높았지만, 비후성 연골 세포의 마커인 콜라겐 유형 10(COL10)의 수치는 더 낮았습니다. 또한, 연골형성의 전제 조건인 연골형성 응집체 형성이 원심분리된 ASC에서 관찰되었습니다.

원심 중력 지방 유래 줄기 세포의 연골 세포 분화 마커의 과다 발현을 유도한다. 연골 분화를 유도하기에 적합한 원심 중력의 정도를 결정하기 위해,의 ASC는 15 분 동안 다른 CG의도 (0, 300, 600, 1,200, 2,400 XG)로 자극 하였다. 자극 후, ASC를 배양 플레이트에 다시 접종하고 24 시간 동안 배양 하였다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, SOX9 mRNA 발현은 현저히 2400 XG 증가시켰다 이 약 (의 ASC는 CG로드되지 않음) 제어에 비해 2,400 XG에서 높은 1.5 배이었다. CG는 연골 분화를 유도 여부를 확인하기 위해, 우리는 CG로드 또는 TGF-β1 처리에 의해의 ASC를 자극. 음성 대조군으로는 ASC를 자극하지 않고 배양 하였다. 샘플은 14 일에 수확하고, QRT-PCR을 실...

기계적 스트레스는 줄기세포의 연골형성 분화를 유도하여 손상된 연골 복구를 위한 잠재적인 치료법을 제공할 수 있습니다. 원심 중력(CG)을 사용하여 지방 유래 줄기세포(ASC)의 연골 분화를 유도하는 프로토콜을 제시합니다. SOX9의 CG 유도 상향 조절은 연골 형성 표현형의 발달을 초래합니다.

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

이 절차의 전반적인 목표는 결함 있는 연골 복구를 위해 ASC의 연골 형성 분화를 유도하는 것입니다. 이 방법은 원심 중력을 사용하여 ASC의 prechondrogenic differentiation을 유도하는 것입니다. 이 방법은 ASC의 연골 분화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 골형성 및 섬유생성 분화와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.이 기술의 가장 큰 장점은 사이토카인을 처리하지 않고도 줄기세포에서 연골형성 분화를 쉽게 유도할 수 있다는 것입니다. 시연은 제 연구실의 Yeri Alice Rim과 Yoojun Nam이 시연할 것입니다. 100ml 배양 접시에서 80%confluent adipose 유래 줄기 세포를 배지를 버리고 5ml의 PBS로 세척하여 수확하는 것으로 시작합니다.그런 다음 1밀리몰 EDTA가 포함된 PBS 1ml를 추가하고 5%의 이산화탄소가 포함된 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2분 동안 배양합니다. 2분 후 배양 플레이트를 부드럽게 두드린 다음 4ml의 새 배지를 추가하고 세포를 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 실온에서 2분 동안 250배 g으로 세포를 원심분리합니다.원심분리 후 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 제거합니다. 그런 다음 펠릿을 10ml의 배지에 다시 현탁시킵니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오.원심력 중력 로딩의 경우, 2.5 곱하기 10을 다섯 번째 셀로 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 2400 곱 g에서 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 펠릿 또는 마이크로매스 배양을 진행합니다. 원심분리 직후, 상층액과 500마이크로리터의 연골 생성 분화 배지(CDM)와 갓 준비된 L-아스코르브산 2-인산염 50마이크로그램을 펠릿에 흡인합니다.양성 대조군은 연골 형성 분화를 유도하고 밀리리터 TGF-beta-1 당 10 나노 그램을 함유하는 CDM을 첨가하여 세포를 수집합니다. 튜브의 뚜껑을 느슨하게 닫고 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소가 포함된 3주 동안 배양합니다. 중력 로딩 원심분리 직후, 상층액을 흡입하고 펠릿을 10마이크로리터의 CDM에 다시 현탁시킵니다.마이크로매스를 형성하려면 다시 부유한 세포를 24웰 플레이트의 웰 중앙에 피펫팅한 다음 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 2시간 후 500마이크로리터의 CDM을 웰에 조심스럽게 첨가하고 마이크로매스가 중단되지 않도록 플레이트 벽에 피펫팅합니다. 양성 대조군으로, TGF-beta-1 밀리리터당 10나노그램을 함유한 CDM을 첨가하여 원심분리되지 않은 세포로 마이크로매스 배양을 수행합니다.마이크로매스를 3주 동안 배양합니다. 마이크로매스 형성 후 21일째에 피펫을 사용하여 스페로이드 펠릿을 수확한 다음 1X PBS로 세척합니다. 스페로이드 펠릿을 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 담가 고정합니다.다음날 정착제를 버리고 세포 펠릿을 탈이온수로 헹굽니다. 조직 카세트에 거즈 한 층을 놓고 피펫을 사용하여 고정 스페로이드 펠릿을 옮깁니다. 거즈를 접어 펠릿을 덮고 카세트 뚜껑을 닫습니다.다음으로, 실온에서 5분 동안 70% 에탄올에 침지하여 스페로이드 펠릿을 탈수합니다. 그런 다음 각각 5분 동안 일련의 에탄올 농도를 계속합니다. 그런 다음 펠릿을 100% 자일렌에 15분 동안 담그십시오.포매를 위해 스페로이드 펠릿을 섭씨 56도의 파라핀에 담그십시오. 다음으로, 회전식 마이크로톰을 사용하여 파라핀이 포함된 세포 펠릿에서 5미크론 두께의 절편을 절단합니다. 섹션을 50% 에탄올에 띄운 다음 섭씨 50도의 수조로 옮깁니다.플로팅 섹션을 슬라이드에 장착한 다음 면역 형광 염색을 위해 safranin o 및 alcian blue로 진행합니다. 적절한 원심 중력을 결정하기 위해 ASC를 0, 300, 600, 1, 200, 2, 400 배 g의 원심 중력에서 15 분 동안 회전시켰다. SOX9 mRNA 발현은 CG 자극 후 24시간에 평가되었습니다.2, 400배 g의 CG는 SOX9 mRNA 발현을 유의하게 유도했습니다. 연골 형성 관련 유전자의 발현을 평가하기 위해 자극되지 않은 ASC, 원심분리 또는 TGF-beta-one으로 처리된 ASC에서 총 RNA를 추출했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 CG 자극은 콜라겐 2형과 아그레칸 발현을 유도합니다.CG로 처리된 ASC에서 콜라겐 타입-2의 과발현은 Alexa Fluor 594 접합 2차 항체에서 콜라겐 타입-2에 대한 항체를 사용한 면역형광에 의해 확인되었습니다. 연골 형성 관련 ECM 과발현에 대한 CG의 효과를 결정하기 위해 ASC는 TGF-beta-one을 양성 대조군으로 처리했습니다. 음성 대조군은 CG 로딩 또는 TGF-beta-one 처리를 받지 않은 펠릿 배양이었습니다.연골 형성 관련 ECM의 과발현은 사프라닌 o 및 알시안 블루 염색을 사용하여 원심분리된 ASC로 구성된 스페로이드 펠릿에서 평가되었습니다. 관절 연골의 주요 구성 요소인 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan)은 알시안 블루(alcian blue)에 의해 파란색으로 염색되거나 사프라닌 o(safranin o)에 의해 주황색으로 염색되었습니다. 14일간의 마이크로매스 배양 후, 연골세포 응축을 응집체의 크기로 평가하였다.CG에 의해 생성된 각 골재의 크기는 약 0.5mm였습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 원심 중력을 사용하여 줄기세포의 연골 분화를 유도하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

chondrogenic-differentiation-induction-adipose-derived-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 다능성 검사를 통해 피하 지방 조직에서 돼지 지방 유래 줄기 세포(pADSC)를 분리하는 방법을 설명합니다. 다분성 pADSC는 지방 세포 분화 과정을 설명하고 재생 연구를 위해 중배엽 중간엽의 여러 세포 계통 또는 외배엽 및 내배엽의 추가 계통으로의 전분화를 연구하는 데 사용됩니다.

돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

여기서, 우리는 인간 탯줄 (UC)와 코드에 태아 태반 샘플 분리 용 (CL), 왓슨의 젤리 (WJ), 코드 - 태반 접합부 (CPJ) 태아 태반 (FP) 라이닝 박리를위한 프로토콜을 제시 상기 이식편 배양 기술을 이용하여 중간 엽 간질 세포 (MSC들)의 특성화.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

우리는 배아 체 형성 (EB) 형성, 섬유 아세포 세포 확장 및 연골 형성 유도를 포함하는 통합없는 방법을 사용하여 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 통해 인간 말초 혈액 (PB)으로부터 연골 세포 계통을 생성하는 프로토콜을 제시한다.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

여기, 우리는 제대혈 단핵 세포 유래 인간 유도 pluripotent 줄기 세포에서 연골 분화에 대한 프로토콜을 제안합니다.

제대혈 유래 다 능성 줄기 세포로부터 연골 형성 펠렛 형성

받는 dendrimer 기반 고르지 nanopatterns 로컬 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD) 표면 밀도의 나노 제어를 허용 하는 방법은 설명 하 고 세포 접착 및 chondrogenic 분화의 연구에 대 한 적용.

로컬 컨트롤 표면 점착을 고르지 Nanopatterns Dendrimer 기반: Chondrogenic 차별화 하는 방법

이 프로토콜의 목적은 여러 셀 혈통으로 차별 하는 인간의 혈관 주위 지방 조직에서 파생 된 조상 세포의 능력을 테스트 하는. 체형, osteocyte, 및 chondrocyte 혈통으로 차별화 하는 데 알려져 있다 인간의 골 수에서 파생 된 중간 엽 줄기 세포 분화와 비교 되었다.

인간의 대동맥 혈관 주위 지방 조상 세포의 분화 능력

우리는 Wnt-1 Cre+/-의경피적 지방 조직으로부터 신경 문장 유래 지방 유래 줄기 세포(NCADSCs)의 분리, 배양 및 지방 흡입을 위한 프로토콜을 제시한다. Rosa26RFP/+ 마우스. NCADSCs는 시험관내 지질 발생 또는 지방 형성을 모델링하기 위한 ADSC의 쉽게 접근할 수 있는 공급원이 될 수 있다.

신경 문장 원래 지방 유래 줄기 세포의 격리, 문화 및 지방 유도는 periaortic 지방 조직에서

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 훌륭한 공급원입니다. 여기에서는 스위스 생쥐 부고환 지방 조직에서 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)의 단계별 추출, 배양 및 특성 분석을 제공합니다.

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

본 연구는 중력을 이용하여 저접착 조건에서 세포를 스페로이드로 응집한 후 생성된 스페로이드를 미니 생물반응기에서 배양하여 연골세포 스페로이드를 생산하는 방법을 설명합니다.

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

배우세요 지방 유래 줄기 세포의 연골 분화 유도 방법을 원심 중력을 이용하여. 사이토카인 없이 SOX9 상향 조절을 통해 연골 재생 치료에 활용할 수 있는 기술입니다.

원심 중력에 의해 지방이 유래 줄기 세포의 연골 분화 유도

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