2017년 2월 24일
기계적 스트레스는 줄기세포의 연골형성 분화를 유도하여 손상된 연골 복구를 위한 잠재적인 치료법을 제공할 수 있습니다. 원심 중력(CG)을 사용하여 지방 유래 줄기세포(ASC)의 연골 분화를 유도하는 프로토콜을 제시합니다. SOX9의 CG 유도 상향 조절은 연골 형성 표현형의 발달을 초래합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 결함 있는 연골 복구를 위해 ASC의 연골 형성 분화를 유도하는 것입니다. 이 방법은 원심 중력을 사용하여 ASC의 prechondrogenic differentiation을 유도하는 것입니다. 이 방법은 ASC의 연골 분화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 골형성 및 섬유생성 분화와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.
이 기술의 가장 큰 장점은 사이토카인을 처리하지 않고도 줄기세포에서 연골형성 분화를 쉽게 유도할 수 있다는 것입니다. 시연은 제 연구실의 Yeri Alice Rim과 Yoojun Nam이 시연할 것입니다. 100ml 배양 접시에서 80%confluent adipose 유래 줄기 세포를 배지를 버리고 5ml의 PBS로 세척하여 수확하는 것으로 시작합니다.
그런 다음 1밀리몰 EDTA가 포함된 PBS 1ml를 추가하고 5%의 이산화탄소가 포함된 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2분 동안 배양합니다. 2분 후 배양 플레이트를 부드럽게 두드린 다음 4ml의 새 배지를 추가하고 세포를 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 실온에서 2분 동안 250배 g으로 세포를 원심분리합니다.
원심분리 후 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 제거합니다. 그런 다음 펠릿을 10ml의 배지에 다시 현탁시킵니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오.
원심력 중력 로딩의 경우, 2.5 곱하기 10을 다섯 번째 셀로 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 2400 곱 g에서 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 펠릿 또는 마이크로매스 배양을 진행합니다. 원심분리 직후, 상층액과 500마이크로리터의 연골 생성 분화 배지(CDM)와 갓 준비된 L-아스코르브산 2-인산염 50마이크로그램을 펠릿에
흡인합니다.양성 대조군은 연골 형성 분화를 유도하고 밀리리터 TGF-beta-1 당 10 나노 그램을 함유하는 CDM을 첨가하여 세포를 수집합니다. 튜브의 뚜껑을 느슨하게 닫고 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소가 포함된 3주 동안 배양합니다. 중력 로딩 원심분리 직후, 상층액을 흡입하고 펠릿을 10마이크로리터의 CDM에 다시 현탁시킵니다.
마이크로매스를 형성하려면 다시 부유한 세포를 24웰 플레이트의 웰 중앙에 피펫팅한 다음 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 2시간 후 500마이크로리터의 CDM을 웰에 조심스럽게 첨가하고 마이크로매스가 중단되지 않도록 플레이트 벽에 피펫팅합니다. 양성 대조군으로, TGF-beta-1 밀리리터당 10나노그램을 함유한 CDM을 첨가하여 원심분리되지 않은 세포로 마이크로매스 배양을 수행합니다.
마이크로매스를 3주 동안 배양합니다. 마이크로매스 형성 후 21일째에 피펫을 사용하여 스페로이드 펠릿을 수확한 다음 1X PBS로 세척합니다. 스페로이드 펠릿을 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 담가 고정합니다.
다음날 정착제를 버리고 세포 펠릿을 탈이온수로 헹굽니다. 조직 카세트에 거즈 한 층을 놓고 피펫을 사용하여 고정 스페로이드 펠릿을 옮깁니다. 거즈를 접어 펠릿을 덮고 카세트 뚜껑을 닫습니다.
다음으로, 실온에서 5분 동안 70% 에탄올에 침지하여 스페로이드 펠릿을 탈수합니다. 그런 다음 각각 5분 동안 일련의 에탄올 농도를 계속합니다. 그런 다음 펠릿을 100% 자일렌에 15분 동안 담그십시오.
포매를 위해 스페로이드 펠릿을 섭씨 56도의 파라핀에 담그십시오. 다음으로, 회전식 마이크로톰을 사용하여 파라핀이 포함된 세포 펠릿에서 5미크론 두께의 절편을 절단합니다. 섹션을 50% 에탄올에 띄운 다음 섭씨 50도의 수조로 옮깁니다.
플로팅 섹션을 슬라이드에 장착한 다음 면역 형광 염색을 위해 safranin o 및 alcian blue로 진행합니다. 적절한 원심 중력을 결정하기 위해 ASC를 0, 300, 600, 1, 200, 2, 400 배 g의 원심 중력에서 15 분 동안 회전시켰다. SOX9 mRNA 발현은 CG 자극 후 24시간에 평가되었습니다.
2, 400배 g의 CG는 SOX9 mRNA 발현을 유의하게 유도했습니다. 연골 형성 관련 유전자의 발현을 평가하기 위해 자극되지 않은 ASC, 원심분리 또는 TGF-beta-one으로 처리된 ASC에서 총 RNA를 추출했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 CG 자극은 콜라겐 2형과 아그레칸 발현을 유도합니다.
CG로 처리된 ASC에서 콜라겐 타입-2의 과발현은 Alexa Fluor 594 접합 2차 항체에서 콜라겐 타입-2에 대한 항체를 사용한 면역형광에 의해 확인되었습니다. 연골 형성 관련 ECM 과발현에 대한 CG의 효과를 결정하기 위해 ASC는 TGF-beta-one을 양성 대조군으로 처리했습니다. 음성 대조군은 CG 로딩 또는 TGF-beta-one 처리를 받지 않은 펠릿 배양이었습니다.
연골 형성 관련 ECM의 과발현은 사프라닌 o 및 알시안 블루 염색을 사용하여 원심분리된 ASC로 구성된 스페로이드 펠릿에서 평가되었습니다. 관절 연골의 주요 구성 요소인 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan)은 알시안 블루(alcian blue)에 의해 파란색으로 염색되거나 사프라닌 o(safranin o)에 의해 주황색으로 염색되었습니다. 14일간의 마이크로매스 배양 후, 연골세포 응축을 응집체의 크기로 평가하였다.
CG에 의해 생성된 각 골재의 크기는 약 0.5mm였습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 원심 중력을 사용하여 줄기세포의 연골 분화를 유도하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 기사는 원심력(CG)을 사용하여 지방 유래 줄기 세포(ASCs)의 연골 분화 유도 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 기계적 스트레스가 연골 수복에 미칠 수 있는 잠재력을 강조하여 SOX9의 상향 조절을 촉진하고 연골 분화 표현형의 발달로 이어집니다.
Mechanical induction of chondrogenic differentiation offers a cytokine-free alternative for cartilage repair, reducing contamination risks and process complexity in stem cell-based therapies. This approach supports target validation by enabling functional assessment of chondrogenic potential in adipose-derived stem cells under defined biomechanical conditions. The method provides a scalable, reproducible system for early-stage de-risking of cartilage regeneration strategies.
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical modeling by providing a biomechanical induction system for chondrogenesis.