목초의 군 유전체학 분석

이 실험의 전반적인 목표는 사일리지 샘플 내에 존재하는 박테리아 군집을 이해하는 것이지만 이러한 절차는 다양한 샘플 유형에 적용할 수 있습니다. 이 방법은 여기에 제시된 사례와 같이 동물 사료용 사일리지와 같이 복잡한 미생물 시스템 내에서 발견되는 원핵생물 군집을 식별할 때 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존의 16S 앰플리콘 염기서열분석 대신 샷건 염기서열분석이 사용되어 마이크로바이옴을 분류할 때 훨씬 더 높은 정확도를 제공한다는 것입니다.

이 방법은 인간의 장, 피부 표면, 물 샘플 또는 사무실 커피 머신 주변과 같이 복잡한 소우주가 형성될 수 있는 광범위한 다른 샘플에 적용할 수 있습니다. 사일리지 샘플에서 DNA를 추출하기 위해 상용 키트가 사용됩니다. 제공된 용해 튜브에 100-400mg의 샘플을 978마이크로리터의 인산나트륨 완충액과 122마이크로리터의 토양 용해 완충액에 추가하여 이 절차를 시작합니다.

사일리지 샘플이 없는 음성 대조군을 포함합니다. 용해 튜브를 초당 6.0미터의 속도로 40초 동안 균질화기에 넣어 샘플을 균질화합니다. 용해물을 15분 동안 원심분리합니다.

상층액을 250마이크로리터의 단백질 침전액이 들어 있는 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 10회 뒤집어서 용액을 혼합합니다. 그런 다음 5분 동안 원심분리기를 합니다. 상등액을 1ml의 DNA 결합 매트릭스가 들어 있는 깨끗한 15ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.

튜브를 3분 동안 지속적으로 뒤집어 용액을 혼합합니다. 혼합물이 3분 동안 가라앉을 때까지 기다린 다음 500마이크로리터의 상층액을 버리고 나머지 상층액을 피펫팅으로 혼합합니다. 현탁액의 600 마이크로 리터를 스핀 필터와 원심 분리기로 1 분 동안 14, 000 번 G로 옮깁니다.

여과액을 버리고 나머지 현탁액으로 이 과정을 반복합니다. 여과액을 버린 후 스핀 필터 내의 DNA 결합 매트릭스에 500 μl의 세척 완충액을 첨가하고 피펫팅으로 혼합한 후 1분 동안 14, 000회 G로 원심분리합니다. 여과액을 버리고 탈수 필터를 2분 동안 원심 분리하여 모든 세척 버퍼가 제거되었는지 확인합니다.

탈수 필터를 섭씨 23도에서 5분 동안 건조시킵니다. 예열된 DNase가 없는 물 100마이크로리터를 DNA 결합 매트릭스에 추가하고 스핀 필터를 깨끗한 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. DNA를 용리하기 위하여 1분 동안 14, 000배 G에 분리기.

추가 분석이 필요할 때까지 DNA를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 사일리지 샘플에서 추출한 DNA는 DNA 정제 비드를 사용하여 정제됩니다. 냉장고에서 구슬을 꺼내 사용하기 최소 30분 전에 섭씨 23도로 두십시오.

각 DNA 샘플에 두 부피의 비드를 추가하고 용액을 섭씨 23도에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 분리 자석에 5분 동안 놓고 상층액을 버립니다. 200마이크로리터의 신선한 80% 에탄올로 구슬을 두 번 씻습니다.

비드를 10분 동안 자연 건조합니다.비드는 충분히 건조되어야 하지만 과도하게 건조되어서는 안 되므로 계속하기 전에 비드를 육안으로 검사하는 것이 중요합니다. 분리 자석에서 샘플을 제거하고 50마이크로리터의 용리 완충액을 첨가한 후 피펫팅으로 혼합합니다. 현탁액을 섭씨 23도에서 5분 동안 배양한 다음 샘플을 다시 분리 자석에 3분 동안 놓습니다.

DNA가 들어있는 상등액을 깨끗한 튜브에 옮기고 비드를 버립니다. 이 절차를 시작하려면 199:1의 버퍼 대 시약을 사용하여 작업 용액을 준비합니다. 190마이크로리터의 작업 용액에 각 DNA 표준물질 10마이크로리터를 추가합니다.

10마이크로리터의 정제된 DNA를 190마이크로리터의 작업 용액에 첨가합니다. 표준물질 및 DNA 샘플을 섭씨 23도에서 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 화면의 지시에 따라 형광계의 DNA 샘플 전에 표준을 분석합니다.

정제된 DNA는 품질이 양호하고 정확하게 정량화되어야 하므로 DNA의 품질과 농도에 대해 의심이 가는 경우 DNA 추출을 반복해야 합니다. Shotgun 염기서열분석 라이브러리는 상용 라이브러리 준비 키트를 사용하여 준비됩니다. 용리 완충액을 사용하여 DNA 샘플을 마이크로리터당 0.2나노그램으로 희석합니다.

정제된 DNA 5마이크로리터를 10마이크로리터의 태그멘테이션 완충액 및 5마이크로리터의 태그멘테이션 효소 혼합물과 혼합합니다. 샘플을 섭씨 55도에서 5분 동안 배양합니다. 각 샘플에 5마이크로리터의 중화 완충액을 추가하고 용액을 섭씨 23도에서 5분 동안 배양합니다.

다음으로, 각 샘플별 염기서열분석 지표 5마이크로리터와 PCR 마스터믹스 15마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 thermocycler에 넣고 PCR을 수행합니다. 앞서 설명한 바와 같이 비드 정제 방법을 사용하여 준비된 DNA를 정제하되 최종 용출 완충액 30마이크로리터

그 후, DNA의 염기서열을 분석하고 다양한 생물정보학 도구를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 염기서열 데이터를 분석합니다. 박테리아 마이크로바이옴의 분류학적 분류는 Kracken 소프트웨어로 수행한 다음 CHROMA 소프트웨어로 시각화했습니다. 사일리지 메타게놈에 존재하는 대부분의 박테리아 종은 4개의 프로핵생물 필라에서 발견되며, 피르미쿠테스는 34%, 악티노박테리아는 28%, 프로테오박테리아는 27%, 베타로이티스는 7%입니다.

조립된 판독에서 수행된 기능 주석은 추정 탄수화물 활성 효소와 탄수화물 활성 효소 데이터베이스를 구성하는 5개의 효소 클래스 중 하나로 주석이 달린 6,357개의 예측 단백질로 귀결되었습니다. 이 벤 다이어그램은 하나 이상의 효소 종류 주석을 포함하는 단백질 주석의 분포를 보여줍니다. 이 중 3,591명은 배당체 가수분해효소 활성을 갖는 것으로 예측되었습니다.

일단 마스터하면 DNA 염기서열분석 라이브러리의 준비는 적절하게 수행되면 하루 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플 간에 교차 오염이 없는지 확인하고 항상 블랭크와 같은 적절한 제어 장치를 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 Kracken이 만든 분류를 검증하기 위해 다른 생체 초점 분석을 수행할 수 있습니다.

이러한 메타유전체학(metagenomic) 기술을 통해 연구자들은 많은 복잡한 시스템에서 마이크로바이옴을 탐구할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 메타유전체 DNA 염기서열분석 라이브러리를 준비하고 얻은 DNA 염기서열 판독에 대해 생물정보학 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. DNA 결합 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 및 실험실 가운과 같은 예방 조치를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.