면역 반응의 생체 내에 다중 광자 이미징을위한 마우스 귀 피부에 유도 허혈 - 재관류 손상

이 실험의 전반적인 목표는 쥐 귀 피부의 생체 내 다광자 이미징을 통해 면역 세포가 허혈 재관류에 어떻게 반응하는지 이해하는 것입니다. 이 방법은 면역학 및 피부과 분야에서 면역 세포의 역동적인 행동을 이해하기 위해 매우 중요한 몇 가지 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 염증이 있거나 휴식 상태인 피부의 세포 활동을 연구하기 위한 강력한 이미징 모델을 제공한다는 것입니다.

이 방법은 허혈성 재관류 손상에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 감염뿐만 아니라 과민 반응과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 준비 절차 동안 체온을 섭씨 37도로 유지하기 위해 마우스를 가열 패드에 올려 놓습니다. 발가락 핀치 반사가 없는 것으로 마취 깊이를 확인합니다.

다음으로, 마취 상태에서 건조함을 방지하기 위해 동물의 눈에 안과 윤활제를 바르십시오. 그런 다음 등쪽 귀의 위쪽 2/3에 제모 크림을 조심스럽게 바르고 2-3분 동안 기다립니다. 그런 다음 젖은 면 팁 어플리케이터를 사용하여 철저하고 부드럽게 크림을 제거합니다.

이제 네오디뮴 자석을 사용하여 마우스 귀 피부에 허혈을 유도합니다. 이렇게 하려면 먼저 자석을 개별 플라스틱 가이드에 끼워 넣으십시오. 가장자리만 두 번째 복부 자석과 접촉하도록 하나의 자석을 배치하고, 귀는 자석에 평평하게 놓인 상태에서 귀의 복부 쪽 아래에 배치해야 합니다.

준비가 되면 자석을 조심스럽게 함께 모으십시오. 허혈 1.5시간 후 플라스틱 가이드를 사용하여 자석을 서로 비틀어 제거하여 재관류가 일어나도록 합니다. 자석을 제거한 직후 Evans Blue 또는 선택한 다른 혈관 라벨링 에이전트를 정맥 주사합니다.

이 단계에서는 마스킹 테이프 두 개를 자릅니다. 접착면이 서로 달라붙도록 하면서 너비를 따라 약 1mm의 접착제를 남깁니다. 그런 다음 마스킹 테이프를 둘로 잘라 귀 플랫폼의 슬릿 내에 배치할 수 있도록 합니다.

이 마스킹 테이프를 슬릿의 절반 정도에 삽입하여 접착면이 위를 향하도록 합니다. 그런 다음 이미징할 귀가 마스킹 테이프 스트립 옆에 오도록 가열 패드에 마우스를 놓습니다. PBS 촉촉한 면 팁 어플리케이터 두 개를 사용하여 접착 스트립에 귀를 부드럽게 누릅니다.

스트립을 가이드로 사용하여 슬릿을 통해 마우스 귀를 가져오는 동시에 마우스를 스테이지 쪽으로 더 가깝게 조정합니다. 귀 피부는 매우 연약하기 때문에 준비로 인한 부상을 방지하기 위해 이 단계를 매우 신중하게 수행해야 합니다. 끈적한 테이프를 제거하려면 먼저 PBS 한 방울을 떨어뜨려 테이프의 접착력을 줄이십시오.

그런 다음 미세한 페인트 브러시를 사용하여 마스킹 테이프에서 마우스 귀를 가능한 한 부드럽게 분리합니다. 촉촉한 면 팁 어플리케이터를 귀 위로 부드럽게 굴려 귀 플랫폼에 귀를 평평하게 만듭니다. 그런 다음 커버슬립 아래에 PBS 한 방울을 떨어뜨리고 귀에 부드럽게 올려 놓습니다.

그런 다음 직장 온도 프로브를 삽입하고 제조업체의 지침에 따라 전선을 난방 시스템에 연결합니다. 이미지를 획득하려면 동물을 다광자 현미경 아래에 놓습니다. 대규모 Evans Blue 누출을 특징으로 하는 허혈의 가장자리에 근접한 이미징 영역부터 시작합니다.

여기 개략도는 자석의 위치를 보여줍니다. 이 두 사진은 자석 클램핑 후 허혈 전 귀와 허혈 후 귀를 보여줍니다. 이 귀 회로도에서 귀는 자석이 배치된 위치와 관련하여 이미지화된 영역을 나타냅니다.

최대 투영의 이 타임 랩스 시퀀스는 허혈 1.5시간 후 LysM-eGFPM 알비노 마우스 귀 피부에서 재관류에 반응하는 호중구 침투를 보여줍니다. 이전 시점에서 Evans Blue 신호가 없다는 것은 허혈 후 일시적인 혈관 폐색을 나타냅니다. 일단 숙달되면 이미징을 위한 허혈성 재관류 귀 준비는 적절하게 수행되면 30분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행하는 동안 마취 깊이와 마우스의 온도를 지속적으로 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 마우스 귀 피부의 전체 마우스 염색과 같은 다른 방법을 수행하여 세포 국소화에 대한 전체적인 관점을 가질 수 있습니다. 이 프로토콜의 개발 이후, 면역학 및 피부과 분야의 연구자들이 쥐의 귀 피부에서 선천성 면역을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 허혈성 재관류 손상을 연구하기 위해 마우스 귀 피부 이미징 모델을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 다중 사진 현미경으로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 그리고 레이저 안전 교육과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.