Name: 면역 반응의 생체 내에 다중 광자 이미징을위한 마우스 귀 피부에 유도 허혈 - 재관류 손상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 학습하세요 마우스 귀 피부 허혈-재관류 손상 모델을 이용한 다중 광자 생체 내 이미징으로 면역 세포 반응을 실시간 관찰하는 방법. 이 기술은 피부 염증 및 선천성 면역 연구에 활용됩니다.

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LysM-eGFP 마우스를 제공해 주신 Thomas Graf에게 감사드립니다.

살아있는 동물을 다루는 모든 실험은 모든 관련 동물 사용 및 관리 지침 및 규정에 따라 실시 하였다. 형광 리포터 생쥐 1. 선택 <ol><li> 6 ~ 12 주 된 LysM-eGFP는 11 마우스 (남성 또는 여성 중 하나에 대한 더 선호)를 사용합니다. 주 : 다양한 세포 관련 형광 리포터 생쥐의 사용은 생체 내에서 서로 다른 면역 세포의 가시화를 가능하게한다. 이 균주에 가시화 될 수있다 단핵 세포 (GFP 싸다 세포), 및 피부 식세포 (GFP 싸다 세포)를 순환, 호중구 (GFP 안녕 세포)를 순환. 촬상 파라미터 사용으로, GFP 양성 호중구에서만 밝은 신호를 검출한다. 주 : 피부 촬상 연구의 이러한 유형에 적합한 면역 세포 특이 형광 리포터 생쥐 균주의 목록은 참고 8에서 찾을 수있다. 참고 :이 매우 pigmen로, 흰둥이 마우스 이미징에 사용하는 것이 좋습니다테드 마우스는 광 손상에 더 경향이 있습니다. 색소 귀 피부 (조직 연소 나타내는) 레이저 유발 반점에 더 민감하기 때문이다. 그 결과, 호중구 채용 축적에도 정상 상태 8,12 동안 관찰 될 수있다. </li><li> 12 시간 명암주기와 특정 병원균이없는 (SPF) 상태에서 마우스를 유지합니다. </li></ol> 2. 마우스 마취 <ol><li> 멸균 물에 녹여 15 mg의 용액의 혼합물 -1 케타민 1 mg의 용액 -1 자일 라진 구성 케타민 - 자일 라진 (8 μL의 g -1 체중)의 복강 내 주사로 마우스를 마취. </li><li> 제조 과정에 걸쳐 37 ℃의 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 마우스를 놓는다. 발가락 핀치 반사의 부재를 관찰하여 충분한 마취를 확인합니다. 참고 : 첫 번째 시간 후 마취의 다음 분기 투여는 피하 관리되는해야합니다D는 약 0.5 시간마다 지속됩니다. 수염 또는 꼬리 경련은 마취 오프 입고 있고 상부 업이 필요하다고 표시 할 수있다. </li><li> 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 윤활제를 사용합니다. </li></ol> 3. 탈모 <ol><li> 조심스럽게면 팁 어플리케이터를 사용하여 지느러미 마우스 귀 상부 3 분의 2에 제모 크림을 적용합니다. </li><li> 철저한하지만 부드러운 방식으로 젖은 솜 팁 어플리케이터를 사용하여 크림을 제거하기 전에 3 분 - 2 기다립니다. 참고 : 염증 (13, 14)을 유도 할 수 있으므로 제모 크림, 너무 오래 마우스 귀에서 체류하는 것을 허용하지 않습니다. </li></ol> 허혈 및 재관류 손상 4. 유도 <ol><li> 마우스 귀 피부에 허혈을 유도하기 위해 12 mm 직경 × 2 mm 두께의 금 도금, N42 등급의 네오디뮴 자석을 사용하여 약 3,000 가우스 등급. 주의 : 이러한 경우에, 자석의 딤플 얼굴 denoTES는 북극. </li><li> 개별 플라스틱 가이드로 자석 슬롯. 주 : 플라스틱 가이드 고강도 자석의 배치 및 분리를 용이하게하는 역할을한다. 때문에 강한 자력 파손 아직 낮은 저항에 서로 다른 금속에 근접 개별 자석을 배치하지 않습니다. 그들은 서로를 향해 당기면 파손과 분열이 발생할 수 있습니다. </li><li> 에지 부분 만이 상기 제 (복부) 자석 (도 3a)에 접촉되도록 상기 제 (등쪽) 자석을 배치 참고 :이 그들이 제대로 배치되기 전에 함께 스냅에서 자석을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 복부 자석 귀 (그림 3a)에 평평하게되도록 모두 자석을 배치합니다. 주 : 허혈 유도 전에, 마우스를 37 ℃로 유지하고, 충분한 마취 (단계 2.2 참조) 유지되는 것을 보장한다. </li><li> 준비가되면, 조심스럽게 (그림 3a 자석 함께 오게 </강한&gt;). 주 : 촬상 목적 들어, IR 및 비 IR 영역이 관찰 될 수 있도록 귀 절반 클램프. </li><li> 허혈 1.5 시간 후 재관류가 일어날 수 있도록 자석 서로 떨어져 왜곡 플라스틱 가이드를 사용하여 자석을 제거한다. 주 :주의가 자석이 배치 될 때 주름로부터 귀를 방지하기 위해주의해야한다. 자석을 제거한 후, 육안으로 보이는 주요 혈관 (즉, 혈액 즉시 용기를 채우고) - 관류 즉시 다시 경우 불완전 허혈은 명백하다. 재관류 자석의 제거 직후에 발생하지 않지만, 혈관 폐색는 과도하다. 이와 같이,은 신속 가능한 이미징 마우스 귀를 제조하는 것이 필수적이다. </li></ol> 혈관 라벨 에이전트 5. 주입 <ol><li> 즉시 자석을 제거한 후, 에반스 블루 (10 mg의 용액 (레트로 궤도 또는 꼬리 정맥 주사를 통해) 정맥 투여 -1PBS 또는 식염수에; 1 μL의 g -1 체중) 또는 선택의 다른 혈관 라벨 에이전트. 참고 : 주입하기 전에 충분한 마취가 여전히 완만 한 발가락 끼를 수행하여 유지되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 이미징 플랫폼에 귀 6. 배치 <ol><li> 테이프를 길이 1.5 cm, 폭 1.8 cm 마스킹의 두 조각을 잘라. </li><li> 접착면은 그 폭에 따라 접착제의 약 1mm를 떠나 동안 함께 스틱 할 수 있습니다. </li><li> 귀 플랫폼에 슬릿 내 배치를 수용하기 위해, 길이, 두 마스킹 테이프를 잘라. </li><li> 접착면이 위를 향하도록, 슬릿을 통해 중간에 대해이 마스킹 테이프를 삽입합니다. </li><li> 가열 패드에 마우스를 놓고 이미지화 할 수있는 귀는 마스킹 테이프 스트립 옆 등이다. </li><li> 이 PBS-적신 솜 팁 어플리케이터를 사용하여 부드럽게 접착 스트립에 대해 귀를 누릅니다. </li><li> 가이드로서 상기 스트립을 사용하여, 마우스의 귀에 가져슬릿을 통해 동시에 가까운 무대를 향해 마우스를 조정하면서. </li><li> 끈적 끈적한 테이프를 제거하려면, 먼저 테이프의 접착을 줄이기 위해 PBS 한 방울을 추가합니다. </li><li> 미세 페인트 브러시를 사용하는 것과 부드럽게 가능한 마스킹 테이프에서 마우스 귀를 분리합니다. </li><li> 부드럽게 귀를 통해 촉촉한면 팁 어플리케이터를 압연하여 귀 플랫폼에 대해 귀를 평평하게. </li><li> (그리스을 사용하여 커버 슬립 홀더 위치에 유지도 2) 커버 슬립 아래 PBS 한 방울을 넣고 부드럽게 귀 위에 놓습니다. 필요한 경우 더 PBS와 최고. 주 : 커버 슬립 홀더 이미징 동안 안정성을 증가시킨다. </li><li> 직장 온도 프로브를 삽입하고 제조업체의 지침에 따라 가열 시스템에 와이어를 연결합니다. 참고 : 37 ° C에 대한 신체 가열 패드의 온도와 35 ° C에 귀 단계 플랫폼을 설정합니다. </li></ol> 7. 다중 광자 현미경 세트위 영상 매개 변수 참고 :이 프로토콜은 가변으로, 광자 현미경을 하나의 빔을 사용하여 (680 - 1080 ㎚)의 Ti : 사 레이저 (3.3 W nm의 800에서 140 FS의 펄스 길이 80 MHz의 반복 속도)는 20 배 물 목적으로 수 (NA = 1.0) 생체 내에 이미징 연구. <ol><li> 이미징 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 레이저를 맞 춥니 다. </li><li> 950 nm의 여기 파장을 조정한다. 참고 : GFP와 에반스 블루는 950 nm에서 동시에 흥분이 될 수 있습니다. </li><li> 500 μm의 2 scanfield, 505 X 505 픽셀 해상도, 단일 라인 스캔 800 Hz의 스캔 주파수 : 미리보기 위해, 다음과 같은 설정을 사용합니다. &quot;미리보기&quot;를 클릭하십시오. </li><li> 감쇠기 (레이저) 전원을 전환합니다. 모든 필수 신호가 열 손상을 유도 할 수 레이저 파워의 과도한 양에 이미징 필드를 노출하지 않고 포착되어 있는지 확인합니다. 참고 : 낮은 감쇠기 전력에서 시작하고 시그나 경우 증가난 희미한이다. 초기 시점에서 간질 포스트 - 재관류 포인트에서 호중구가 존재하는 바와 같이 전자가 호중구보다 어둡게 한, 대 식세포, 필요한 최소한의 전력을 결정 게이지로 사용될 수있다. 주 :이 단계는 처음 수행 할 경우, 본래의 혈관 완전성이 예상되는 비 - 허혈 영역의 설정을 조정하고 전력 감쇠기의 설정을 용이하게한다. 레이저 파워가 불안정 않는 후속 실험에서, 이러한 설정은 많은 변경을 요구하지 않는다. </li><li> PMT를 설정을 조정합니다. 참고 : PMT의 최대 최적의 이득 전압의 제조업체에 문의하십시오. 권장 임계 값을 넘어 PMT 전압을 설정하면, 높은 신호 대 잡음비가 발생할 것이다. 일반적인 권장은 권장 임계 값과 PMT 이득 전압을 설정하고, 신호는 너무 어둡되어야 필요한 감쇠기 전력을 증가시키는 것이다. </li><li> 가까이에 촬상 영역을 선택대규모 에반스 블루 누설 특징 허혈의 가장자리. </li><li> GFP 각각 50분의 525 대역 통과 (BP) 및 655/40 BP 필터를 사용 에반스 푸른 신호를 수집합니다. 진피 구획 내의 콜라겐 섬유의 차 고조파 발생 (SHG) 신호 들어 42분의 475 BP 필터를 사용한다. </li><li> 사용 가능한 이미지 분석 소프트웨어 호환되는 형식으로 이미지를 저장하는 폴더를 만듭니다. </li><li> 500 μm의 2 scanfield, 505 X 505 픽셀 해상도, 그리고 하나의 라인 스캔에서 스캔 주파수 400 Hz에서 : 취득하려면 다음 설정을 사용합니다. </li><li> 4 ㎛의 스텝 크기 100 ㎛의 z를 스택은 호중구 침윤을 모니터링하는, 1 분 간격으로, 시간의 경과를 반복해서 취득 할 수있다. 주 : 특히 높은 이동성 속도, 세포 추적 분석시 어려움이 발생할 수 있습니다 이상 1 분입니다 간격으로 백혈구 (예를 들면, 호중구)합니다. 이 경우, 사용자가 어느 교류의 두께를 감소시킬 수있다quisition는 스택 또는 스캔 주파수를 증가. 주 : 허혈 영역의 획득 요구 스택 (또는 높은 SHG 세기 특징) 압축의 결과로서 작게 나타날 수 있지만, 이후의 재관류 귀 팽윤시킨다 대규모 염증이 발생할 것이다. Z 방향 현저한 감도가 기대된다. 이와 같이, 큰 Z 스택 인수 드리프트를 수용 할 필요가있다. </li><li> 이미징 동안 촉촉한 물에 침지 대물 렌즈 귀를 유지하기 위해 정기적으로 PBS와 물을 위로. 참고 : 전형적인 실험은 일반적으로 2 지속 - 4 시간. 실험 디자인에 따라, 그리고 영상의 지속 시간을 연장하는 것이 가능하고, 잘 제어 된 마취 정권과 결합된다. </li></ol> 8. 실험을 종료 <ol><li> 홍보 기관의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 이산화탄소 질식하여 마우스를 안락사ocedures. 주 : 기관의 규칙, 규정 및 지침의 결정에 따라 항상 승인 된 방법으로 마우스를 안락사. 반복 화상이 필요한 경우 마취가 닳아까지 가열 패드에 마우스를 유지한다. 마우스가 충분한 의식을 회복 모바일입니다되면, 그 케이지에 마우스를 반환합니다. </li></ol> 9. 이미지 분석 주 : 촬상 실험에서 생성 된 데이터가 다른 소프트웨어 패키지에 의해 시각화 될 수있다. <ol><li> 상기 영상 분석 소프트웨어를 연다. </li><li> 아래의 파일을 가져 모드를 능가 (→ 열기는 &quot;열기&quot;를 클릭하여 원하는 폴더 →에서 모든 파일을 선택합니다). </li><li> 편집 의사 색상을 기본 색상이 적용되지 않는 경우 (채널 탭에서 편집 → 디스플레이 조정 →, 색상 팔레트에서 원하는 색상을 선택). </li><li> 밝기, 대비 및 배경 (토글 최대 및 최소 값 → 편집 → 디스플레이 조정)을 조정합니다. </l난&gt; <li> 파일 크기가 올바른지 확인합니다 (편집 → 이미지 속성 → 형상 탭에서, 복셀의 크기를 확인합니다.이 프로토콜에서, X = 0.99, Y = 0.99, 및 Z = 4). 참고 : 픽셀 해상도에 의해 scanfield 치수를 분할하여 X와 Y를 유도. Z는 각각의 슬라이스의 두께이다. 주 : 이들 데이터 세트의 출력은 최대 투영 동영상으로 표시 될 수있다. 주 : 추적 분석 완전히 생체 내에서의 기능을 이해하기 위해 셀룰러 활동 및 상호 작용을 특성화하기 위해 요구된다. 소프트웨어에서 이용 가능한 스폿 기능을 사용하여 셀 추적의 상세한 설명은 참조 번호 (15) 내의 프로토콜에서 찾을 수있다. 참고 : 참조 (16)의 리뷰 기사에서 발견 될 수있는 많은 정량화 백혈구 마이그레이션하는 방법, 세부 사항이 있습니다. </li></ol>

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의미 IR 피부 욕창의 주요 원인 중 하나이다. (배후 피하 조직 및 근육에 비해) 욕창의 초기 단계 (I 및 II)은 인간의 피부의 상태를 설명한다. 그러나, 면역 학적 원인에 대한 이해는 여전히 부족하다. 여기서,이 간극을 해결하기 위하여 마우스 귀 피부에 간단하고 강력한 IR 모델을 제시한다. 우리는 자석 제거 (재관류) 후 하류 면역 반응을 연구 두 개의 자석과 이후의 마우스 귀를 클램핑하여 허혈을 시뮬레이션 할 수 있습니다. 허혈을 유도, 일정 시간마다 귀에 일정한 압력을 생성하기 위해 자석을 이용함으로써, 실험 사이의 재현성 및 일관성을 보장 할 수있다. 이 비 침습적 IR 모델의 강도는 또한 생체 내에 imagin의 잘 확립 된 모델을 이용하여 생체 내 면역 반응에 실시간으로 입증 할 수있는 능력에 달려피부 플랭크 절차에 비해 촬상시 안정감을 제공 귀 피부의 g. 현재 피부 플랭크 모델...

과도 저산소증 인해 조직 (재관류)의 후속 재 - 산소화이어서 혈류 (허혈)의 폐색에있을 때의 허혈 - 재관류 손상 (IRI)가 발생한다. 피부, 허혈 재관류 (IR)의 연장 상 나머지 부상 장기 입원 환자 걸리기 욕창의 병태 생리에 기여 요인 중 하나라고 생각된다. 이러한 환자에서 피부와 기본 근육 모두 지속적으로 치료 왼쪽 경우, 괴사 하나가 될 수 지역화 부상의 결과로, 뼈 굴지의 영역에 걸쳐 작용 무게 압력에 노출되어있다. IRI에 관련된 손해 배상은 두 가지입니다. 허혈, 혈관 폐색 조직 산소 전달의 급격한 저하로 연결. 이것은 세포 대사에 관여 -ATPase를 불 활성화 ATP 및 산도의 감소를 초래한다. 차례로, 세포의 칼슘 농도는 스파이크, 그리고 스트레스 또는 c를 손상ELL 학생은 세포 사멸 또는 괴사 (2)를받을. 세포 내 내용이나 손상 관련 분자 패턴 (DAMP)의 출시, HMGB1 같은 염증 반응 3에 기여한다. 두 번째 모욕은 재관류시에 발생합니다. 산소와의 pH 수치가 재관류 기간 동안 복원되지만,이 세포 내 지질, DNA 및 단백질의 산화를 유도 활성 산소 종의 발생 (ROS)을 초래한다. 따라서, 염증성 매개 물질은 염증 사이트 2 면역 세포의 채용을 포함하는 이차 염증 반응을 설정하는 활성화됩니다. 염증 반응에 이르기까지의 생화학 적 사건의 케스케이드 잘 설명 하였지만, 면역 세포 활동의 시공간적 조절은 잘 이해되지 않는다. 여기서 우리는 간단한 자석 클램프를 사용하여 마우스 귀 피부에 강력한 IR 모델에 대해 설명합니다. 광자 생체 내에 영상 (MP-IVM)와 결합하여, 우리재관류가 발생 후 발생하는 생체 내 염증 반응을 연구하는 모델을 설립했다. 이 기술의 개발과 사용의 뒤에 이론적 근거는 간질 및 침투 세포가 모두 실시간으로 IR에 어떻게 반응하는지 이해하려고 노력하는 것입니다. 그들은 면역 연구 4 이하보다 유용하게 활용할 피부 측면에서 강판의 외과 적 이식을 필요로 피부 측면에 클램핑 기술을 사용하여 IR 기존의 모델은 매우 침습적이다. 유사한 비 침습적 클램핑 기술은 마우스 피부 플랭크 5,6- 설명되었다. 이 호흡에 의한 움직임을 회피하고 -7,8- 촬상시 안정성을 제공하지만,이 때문에 방법에서 생체 내에 이미징 성분의 혼입, 우리는 대신, 표적 IR 사이트와 귀의 피부를 선택 하였다. 또한, 간질 걸쳐 백혈구의 서브 세트는 있지만, 귀 피부와 피부 사이의 동일 측면숫자와 비율은 약간 9 다를 수 있습니다. 따라서, 귀 피부 이상적인 촬상 부위를 나타낸다. 또한, 이러한 IRI 모델에서 검색 대부분의 데이터는 거시적 평가 (궤양의 등급) 및 엔드 포인트 염증 지표 (10)의 현미경 분석에 제한됩니다. 이 모델을 사용하여, 형광 리포터 마우스 피부 재관류 후 호중구의 세포 반응의 실시간 시각화를 사용할 수있다. 이전에 출판 생체 내에 귀 이미징 모델은 추가 수정 (도 1, 2)와 (8) 사용된다.

<table><tbody><tr><td colspan = "4 ">< 강력 > 마우스 균주< / 강력</td></tr> <tr><td>> Lysozyme-GFP C57BL / 6</td><td>Thomas Graf, 게놈 조절</td><td></td><td></td>센터</tr><tr><td>C57BL / 6-C2J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000058</td><td>피부 이미징을위한 알비노 Lysozyme-GFP를 생성하기 위해 Lysozyme-GFP와 교차 할 예정</td></tr> <td colspan ="4 "> 시약PBS <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viaflex 0.9%(wt/vol) 식염수</td><td>Baxter Healthcare</td><td>F8B1323</td><td></td></tr><tr><td>케타민(100mg mL&minus; 1 케타민 하이드로클로</td>라이드 <td>파넬</td><td></td><td>케타민은 통제 약물이며 모든 관련 지역 규정을 따라야 합니다</td></tr><tr><td>. Ilium Xylazil-20 (20&nbsp; 마그네슘&nbsp; mL&minus; 1 xylazine hydrochloride)</td><td>Troy Laboratories</td><td></td><td>Xylazil-20은 규제 약물이므로 모든 관련 현지 규정을 따라야 합니다.</td></tr><tr><td>에반스 블루(10&nbsp; 마그네슘&nbsp; mL&minus; 1 PBS 또는 식염수)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46160</td><td></td></tr><tr><td>초정제수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Insulin syringe with needle</td><td>BD</td><td>328838</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Biologix Research Company</td><td>30-0135</td><td></td></tr><tr><td>3 M 종이 마스킹 테이프</td><td>3M</td><td>2214</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaser 현미경 커버 유리 (22mm &times; 32mm)</td><td>Paul Marienfeld</td><td>101112</td><td></td></tr><tr><td>곡선 파편 집게</td><td>Aesculap, B. Braun Melsungen</td><td>BD312R</td><td></td></tr><tr><td>Veet 제모 크림</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medical 면 팁 애플리케이터</td><td>Puritan Medical Products Company</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>C-fold towels</td><td>Kimberly-Clark</td><td>20311</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 섬세한 작업 와이프</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>금도금, N42 등급 네오디뮴 자석, 직경 12mm, 두께 2mm&nbsp;</td><td>first4magnets</td><td>F656S</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 가이드, 10cm x 1.5cm(폴리염화비닐 소재)</td><td></td><td></td><td>세로로 반으로 접고 마스킹 테이프와 슬롯 자석으로 묶</td></tr>습니다. <tr><td>고진공 그리스</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">T현미경</td></tr><tr><td>TriM Scope II 단일 빔 이광자 현미경</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>조정 가능 (680&ndash; 1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (&ge; 800nm에서 3.3W; 펄스 길이 140fs, 80MHz 반복률)</td><td>코히어런트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수침 대물렌즈(20&times;, NA = 1.0)</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN20xW</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Miscroscope 필터 및 미러 세트(GFP, SHG, Evans Blue 이미징용)</td></tr><tr><td>495 장역</td><td>T495LPXR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>560 lomg-pass</td><td>크로마</td><td>T560LPXR</td><td></td></tr><tr><td>475/42 대역 통과</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/42-25</td><td></td></tr><tr><td>525/50 대역 통과</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td></td></tr><tr><td>655/40 대역 통과</td><td>Chroma</td><td>NC028647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">피부 이미징 스테이지 플랫폼(조립 다이어그램 참조)</td></tr><tr><td>A 금속 베이스 플레이트(126mm &times; 126mm &times; 1mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>귀용 황동 플랫폼(79mm &times; 19mm; 측면 두께 1mm, 중간 두께 0.5mm, <강한>그림 1) 슬릿(1.7mm &times; 1mm, 긴 가장자리에서 1.5mm 거리)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>두 개의 플라스틱 블록(높이 10mm)&mdash; 단열</td><td></td><td></td><td></td>용</tr><tr><td>곡선형 홀더, 제어 서미스터를 귀 플랫폼에</td><td></td><td></td><td></td>배치하기 위한</tr><tr><td>DIN 커넥터 및 서미스터가 있는 인터페이스 케이블 CC-28, 하나는 온도 제어용이고 다른 하나는 온도 모니터</td><td>용(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640106</td><td>인터페이스 케이블을 35°C로 설정된 두 저항 히터 블록에 연결합니다. C</td></tr><tr><td>저항 히터 블록 RH-2</td><td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640274</td><td>저항 히터 블록은 황동 귀 플랫폼을 최대 100°C까지 가열할 수 있습니다; C는 몇 분 안에 가능합니다. 과열을 방지하기 위해 제어 서미스터가 홀더에 제대로 고정되었는지 확인하십시오.</td></tr><tr><td>귀 플랫폼용 온도 조절기 TC-344B</td><td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640101</td><td></td></tr><tr><td>마우스 가열 패드용 온도 조절기 TR-200</td><td>Fine Science Tools</td><td>21052-00</td><td>장치는 더 이상 판매되지 않습니다. 제조업체에 대안 요청</td></tr><tr><td>TR-200</td><td>Fine Science Tools</td><td>21051-00</td> 장치의 전원 공급 <td>장치는 더 이상 판매되지 않습니다. 제조업체에 대안 요청</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Fine Science Tools</td><td>21060-00</td><td>장치는 더 이상 판매되지 않습니다. 제조업체에 대안을 요청하십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>동물 직장 프로브&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>21060-01</td><td>Unit은 더 이상 판매되지 않습니다. 제조업체에 대안을 요청하십시오. 직장 프로브와 가열 패드를 온도 컨트롤러 TR-200에 연결한 후 온도를 37°C로 설정합니다. C</td></tr><tr><td colspan="4">커버슬립 홀더</td></tr><tr><td>2 플라스틱 막대, 직경 1cm, 길이</td><td></td><td></td><td></td>10cm</tr><tr><td>막대를 수용할 수 있도록 구멍이 뚫린 플라스틱 어댑터 1개(다이어그램 참조)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 막대를 제자리에</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>고정하기 위한 플라스틱 조임 나사 3개1 금속판, 6cm x 2.5cm, 1 끝에서 2cm 정사각형 절단, 짧은 가장자리</td><td></td><td></td><td></td>에서 2mm 가장자리</tr> 플라스틱 <tr><td>막대</td><td></td><td></td><td></td>에 금속판을 부착하기 위한 너트 및 볼트 1쌍</tr><tr><td>피부 이미징 무대 플랫폼의 커버슬립 홀더를 고정하기 위한 자석이 있는 아크릴 베이스(4cm x 5cm x 1.5cm) 1개.1개의 막대가 베이스에 영구적으로 고정됩니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">이미징 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Imaris v8.1.2</td><td>비트플레인</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

면역 반응의 생체 내에 다중 광자 이미징을위한 마우스 귀 피부에 유도 허혈 - 재관류 손상

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI)는 혈류 차단으로 인한 일시적인 저산소증(ischemia)이 발생한 후 조직의 재산소화(재관류)가 있을 때 발생합니다. 피부에서 허혈-재관류(IR)는 욕창의 병태생리학에 기여하는 주요 요인입니다. 염증 반응으로 이어지는 일련의 사건은 잘 연구되어 왔지만, IR 손상에 대한 면역 세포의 다양한 하위 집합의 공간적 및 시간적 반응은 잘 알려져 있지 않습니다. 피부 측면에 클램핑 기술을 사용하는 기존 IR 모델은 매우 침습적이며 손상에 대한 면역 반응을 연구하는 데 적합하지 않으며, 피부 측면에 대한 유사한 비침습적 자석 클램핑 연구는 생체 내 이미징 연구에 적합하지 않습니다. 이 프로토콜에서는 마우스 귀 피부에 개발된 강력한 비침습적 IR 모델을 설명하며, MP-IVM(Multiphoton intravital imaging)을 통해 재관류 후 면역 세포의 세포 반응을 실시간으로 시각화하는 것을 목표로 합니다.

그림 1과 같이이 프로토콜은 맞춤형 귀 피부 이미징 플랫폼을 사용합니다. 이 플랫폼의 몇 가지 기능은 특히 생리 설정을 유지하면서 영상을 용이하게하기 위해 설계되었습니다. 가열 황동 플랫폼에 귀를 배치하는 것은 35 ° C의 온도에서 생리 귀에 유지뿐만 아니라 호흡으로 인해 불가피 움직임로부터 귀를 분리. 황동 플랫폼에 금속 클립을 첨가하여 중단 혈류를 유지 귀에 중량을 발휘으로부터 홀더 커버 슬립을 방지하기위한 간격을 만든다. 스테이지 플랫폼은 또한 이미징 과정에 걸쳐 37 ℃에서 마우스를 유지 가열 패드를 수용하도록 설계된다. 커버 슬립 홀더 (도 2)은 커버 슬립 진공 GREA의 도움으로, 상기 금속 홀더에 부착 될 수 있도록 설계그 자체. 커버 슬립 홀더 어댑터의 도움으로 수직 및 수평 축에 ...

이 프로토콜은 자석 클램프를 사용하여 마우스 귀 피부에 허혈 - 재관류 (IR) 모델의 유도를 설명합니다. 맞춤 제작 된 생체 내에 이미징 모델을 사용하여, 우리는 생체 내 염증 반응 후 재관류에서 공부합니다. 이러한 기술의 발달 배후의 이론적 근거는 백혈구 IR 피부 손상에 반응하는 방법에 대한 이해를 확장하는 것이다.

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

본 실험의 전반적인 목표는 마우스 귀 피부의 생체 내 다광자 이미징(intravital multiphoton imaging)을 통해 허혈 재관류에 대해 면역 세포가 어떻게 반응하는지 이해하는 것입니다. 이 방법은 면역 세포의 동적인 행동을 이해함으로써 면역학 및 피부과학 분야의 매우 중요한 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 염증 상태 또는 휴지 상태의 피부 내 세포 활동을 연구하기 위한 강력한 이미징 모델을 제공한다는 점입니다.이 방법은 허혈 재관류 손상에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 과민 반응 및 감염과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 준비 과정 동안 마우스의 체온을 37 °C로 유지할 수 있도록 가열 패드 위에 놓으십시오. 발가락 꼬집기 반사가 없는 것을 확인하여 마취 깊이를 검증하십시오.다음으로, 마취 상태 동안 안구 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 안구 윤활제를 도포합니다. 그 후, 귀 등쪽의 상단 2/3 영역에 제모 크림을 조심스럽게 바르고 2~3분 동안 기다립니다. 그런 다음, 젖은 면봉을 사용하여 크림을 꼼꼼하면서도 부드럽게 닦아냅니다.이제 네오디뮴 자석을 사용하여 마우스 귀 피부에 허혈을 유도합니다. 이를 위해 먼저 자석을 각각의 플라스틱 가이드에 끼웁니다. 자석 하나를 배치하여 그 가장자리만 두 번째 복측 자석과 접촉하게 하며, 두 번째 자석은 귀가 그 위에 평평하게 놓인 상태에서 귀의 복측 아래에 배치해야 합니다.준비가 되면 자석이 서로 맞닿도록 조심스럽게 움직여 줍니다. 허혈 상태로 1.5시간이 지나면, 플라스틱 가이드를 사용하여 자석을 서로 반대 방향으로 틀어 제거함으로써 재관류가 일어나게 합니다. 자석을 제거한 직후, Evans Blue 또는 선택한 다른 혈관 표지제를 정맥 주사합니다.이 단계에서는 마스킹 테이프 두 조각을 자릅니다. 접착면끼리 서로 붙이되, 너비 방향을 따라 약 1mm의 접착면이 남도록 합니다. 그런 다음, 귀 플랫폼의 슬롯 안에 배치할 수 있도록 마스킹 테이프를 반으로 자릅니다.마스킹 테이프의 접착면이 위를 향하도록 슬릿의 중간 정도까지 삽입합니다. 그 다음, 촬영할 귀가 마스킹 테이프 스트립 옆에 오도록 마우스를 가열 패드 위에 위치시킵니다. PBS를 적신 면봉 두 개를 사용하여, 귀를 접착 스트립 쪽으로 부드럽게 누릅니다.스트립을 가이드로 사용하여, 마우스 귀를 슬릿 사이로 통과시

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 마우스 모델에서 혈전 형성을 연구하기 위한 생체 내 형광 현미경 검사 기술을 보여줍니다. 마우스는 혈액 순환을 모니터링하기 위해 형광단이 표지된 다당류를 주입합니다. 고강도의 빛으로 조명을 비추면 귀의 미세 혈관 구조에서 손상의 광독성 유도가 혈전을 형성하게 되며, 이는 혈류의 방해를 시각화하여 확인됩니다.

미세혈관 혈전 형성을 연구하기 위한 Intravital Fluorescence Microscopy

세포 외 기질은 상처 치유, 염증과 종양 발생시 상당한 개조를 겪는다. 우리는 섬유의 역학뿐만 아니라 표면 형광 또는 이광자 현미경을 사용하여 높은 공간 및 시간 해상도를 가진 메쉬 형상의 매트릭스 성분을 시각화하는 신규의 intravital 면역 형광 현미경 방식을 제시한다.

표면 형광을 가진 조직 매트릭스 구성 요소 및 두 개의 광자 현미경의 장기의 intravital 면역 형광 이미징

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

이 현재 프로토콜은 형광 리포터, 생체 내 라벨링 및 생체 내 이미징 기술을 사용하여 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 동적 과정을 모니터링할 수 있습니다.

IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

털이없는 SKH1 - 시간의 시간 마우스의 귀 모델은 검토 미세 혈관 침대에서 사전 수술 준비없이 미세과 광독성 혈전 유도의 생체 내에 형광 현미경을 할 수 있습니다. 따라서 털이 마우스의 귀는 미세 혈관 혈전 형성, 혈전 진화 및 혈전 용해시 복잡한 상호 작용을 연구하는 생체 모델의 우수합니다.

털이 마우스의 귓불에서 생체 내에 현미경 및 혈전 유도

우리는 최소한의 침공과 라이브 쥐 간 2 광자 영상에 대 한 새로운 수술 프로토콜을 설립. 이 기술을 우리 lipopolysaccharide 유도 endotoxemia 동안 간의 상세한 구조를 확인 할 수 있습니다. 우리는이 방법을 간 백혈구 이동에 다양 한 시 약 처리의 효과 결정 하기 위해 활용 될 수 있습니다 예상.

Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

호중구 이동은 화학 유인 물질 및 세포 외 미세 환경과의 상호 작용에 대한 반응으로 원형질막의 빠르고 지속적인 리모델링에 의존합니다. 본원에서는 마취된 마우스의 귀에 주입된 호중구에서 막 리모델링의 역학을 조사하기 위한 Intravital Subcellular Microscopy에 기초한 절차가 설명됩니다.

생리학적 조건에서 세포하막 리모델링을 조사하기 위해 마우스 피부의 호중구 이동을 이미징합니다.

이 프로토콜은 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 생체 내 이미징을 단순화하는 새로운 도구를 제공합니다.

도립 컨포칼 현미경에서 상피 조직 역학의 장기 모니터링을 위한 간소화된 생체 내 이미징 접근 방식

본 연구는 생 체 내 2광자 영상 접근법을 통해 쥐의 앞발 피부에서 저역계 기계수용체(LTMR) 축삭 말단 구조를 시각화하는 방법을 제시합니다. 개별 축삭의 반복적이고 고해상도 영상을 사용하여 이 방법은 발달 과정과 성인에서 피부 감각 회로의 구조와 기능을 연구할 새로운 플랫폼을 제공합니다.

마우스 피부의 촉각 감각 축삭 형태의 생명체 내 2광자 영상

학습하세요 마우스 귀 피부 허혈-재관류 손상 모델을 이용한 다중 광자 생체 내 이미징으로 면역 세포 반응을 실시간 관찰하는 방법. 이 기술은 피부 염증 및 선천성 면역 연구에 활용됩니다.

면역 반응의 생체 내에 다중 광자 이미징을위한 마우스 귀 피부에 유도 허혈 - 재관류 손상

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