Name: 인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 배우세요 인공 스플라이싱 인자를 설계하여 인간 세포에서 선택적 스플라이싱을 조작하는 생명공학 방법을. PUF 도메인 스캐폴드를 활용한 이 기술은 RNA 처리 및 암 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 NIH 보조금 R01-CA158283 및 NSFC에 의해 ZWYW에 31,400,726는 젊은 천 인재 프로그램 및 국립 자연 과학 중국의 재단 (보조금 31471235 및 81422038)에 의해 자금 지원 허용 지원되었다. XY 중국의 박사후 과학 재단 (2015M571612)에 의해 지원된다.

<ol><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+regulation%3A+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> Rna. 14 (5), 802-813 (2008).</li>
<li>Matera, A. G., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+day+in+the+life+of+the+spliceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A day in the life of the spliceosome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).</li>
<li>Singh, R. K., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-mRNA+splicing+in+disease+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics.</a> Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).</li>
<li>Wang, G. -S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+in+disease%3A+disruption+of+the+splicing+code+and+the+decoding+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery.</a> Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).</li>
<li>Li, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+splicing+is+a+primary+link+between+genetic+variation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease.</a> Science. 352 (6285), 600-604 (2016).</li>
<li>Scotti, M. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mis-splicing+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA mis-splicing in disease.</a> Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).</li>
<li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).</li>
<li>Graveley, B. R., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine%2Fserine-rich+domains+of+SR+proteins+can+function+as+activators+of+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell%22%5BJournal%5D)">Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing.</a> Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).</li>
<li>Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hnRNP+A1+recruited+to+an+exon+in+vivo+can+function+as+an+exon+splicing+silencer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).</li>
<li>Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+binding+of+single-stranded+RNA%3A+is+there+a+code+for+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition.</a> Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).</li>
<li>Dong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+modular+binding+code+for+cytosine+recognition+in+Pumilio%2FFBF+%28PUF%29+RNA-binding+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains.</a> J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).</li>
<li>Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+code+for+RNA+recognition+by+PUF+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A universal code for RNA recognition by PUF proteins.</a> Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).</li>
<li>Wei, H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA-binding+proteins+with+diverse+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA-binding proteins with diverse activities.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+splicing+factors+with+designed+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering splicing factors with designed specificities.</a> Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).</li>
<li>Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA+endonucleases+with+customized+sequence+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities.</a> Nat Commun. 3, 1147(2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).</li>
<li>McCabe, B. C., Gollnick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+levels+of+trp+RNA-binding+attenuation+protein+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).</li>
<li>Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+splicing+enhancers%2C+cognate+splicing+factors+and+context-dependent+regulation+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).</li>
<li>Choudhury, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+splicing+activator+DAZAP1+integrates+splicing+control+into+MEK%2FErk-regulated+cell+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
<li>Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coevolutionary+networks+of+splicing+cis-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+and+specific+functions+of+exonic+splicing+silencers+in+splicing+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control.</a> Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).</li>
<li>Venables, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+and+alternative+splicing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant and alternative splicing in cancer.</a> Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).</li>
<li>Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+translational+regulation+using+the+PUF+protein+family+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).</li>
<li>He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+view+of+cancer-specific+transcript+variants+by+subtractive+transcriptome-wide+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis.</a> PloS one. 4 (3), 4732(2009).</li>
<li>Venables, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+alternative+splicing+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of alternative splicing markers for breast cancer.</a> Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).</li>
<li>Shapiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EMT-Driven+Alternative+Splicing+Program+Occurs+in+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer.</a> PLoS Genet. 7 (8), 1002218(2011).</li>
<li>David, C. J., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+pre-mRNA+splicing+regulation+in+cancer%3A+pathways+and+programs+unhinged%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged.</a> Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).</li>
<li>Ladomery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+alternative+splicing+is+another+hallmark+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+biol%22%5BJournal%5D)">Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer.</a> Int J Cell biol. 2013, (2013).</li>
<li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2%2FASF+is+a+proto-oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).</li>
<li>Anczukòw, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRSF1-regulated+alternative+splicing+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell%22%5BJournal%5D)">SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer.</a> Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 보고서는 구체적으로 표적 유전자의 대체 스 플라이 싱을 조작 할 수있는 인공 접합 요소의 설계 및 구성에 대한 상세한 설명을 제공한다. 이 방법은 사용자의 특이성을 갖는 RNA 결합 골격을 생성하기 위해 반복 PUF의 고유 모드 RNA 결합을 이용한다. 그것은 중 하나를 활성화하거나 접합을 억제하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 핵심 단계는 ESFs의 특이성을 정의 reprogramed PUF 도메인의 생성이다. PCR을 봉합 프로토콜 개발 및 PUF 지지체의 빠른 생성을 위해 최적화되었습니다. 1 : 성공을위한 열쇠는 1 서로 다른 중첩 템플릿의 비율을 조정하는 일. 정제되지 않은 제품은 마지막 라운드에서 프라이머 오염이있을 수 있으므로 각 라운드 후 PCR 제품의 정화도 중요하다. 다른 중요한 단계는 반 - 정량적 RT-PCR을 이용하여 접합 비율을 분석하는 것이다. 일반적으로, 너무 사람y 증폭주기는 PCR 반응을 포화시킬 수 있으므로 피해야합니다. 스 플라...

대부분의 인간 유전자는 스 플라이 싱 (AS)가 크게 게놈 (1, 2)의 부호화 복잡도를 증가 구별 활동 여러 이성체를 제조 겪는다. AS는 유전자의 기능을 조절하는 주요 메커니즘을 제공하며, 밀접 다른 셀룰러 및 발달 단계 3, 4에서 다양한 경로를 통해 조절된다. 접합 misregulation 인간의 질병 5, 6, 7, 8의 일반적인 원인이기 때문에, 접합 규제를 대상으로하는 것은 매력적인 치료 경로가되고있다. 주로 접합 촉진제 또는 대체 엑손 소음기로서 기능 mRNA의 사전에 규정 -Elements 시스 접합 (SRES)에 의해 제어되는 바와 같이, 스플 라이스 규제의 간략화 모델에 따라. 목SREs는 스 플라이 싱 반응을 촉진 또는 억제하는 다양한 트랜스 - 작용 단백질 인자 ( 즉, 스 플라이 싱 인자)를 구체적으로 모집한다 3 , 9 . 대부분의 trans- acting splicing factor는 splicing을 제어하기 위해 타겟과 이펙터 도메인을 인식하기 위해 별도의 서열 특이 적 RNA 결합 도메인을 가지고 있습니다. 가장 잘 알려진 예는 exon splicing enhancer를 결합하는 N- 말단 RNA 인식 모티프 (RRMs) 및 엑손 삽입을 촉진시키는 C- 말단 RS 도메인을 포함하는 세린 / 아르기닌이 풍부한 (SR) 단백질 군의 구성원이다 . 반대로, hnRNP A1은 RRM 도메인을 통해 엑소닉 스 플라이 싱 사일런서에 결합하고 C- 말단 글리신이 풍부한 도메인을 통해 엑손 삽입을 억제한다. 이러한 모듈 형 구성을 사용하여 연구자는 서로 다른 효과를 갖는 특정 RNA 결합 도메인 (RBD)을 결합함으로써 인공적인 접합 인자를 조작 할 수 있어야한다활성화 도메인을 TOR 또는 접합을 억제. 이러한 설계의 핵심은 동화 영역의 DNA 결합 모드 유사 프로그램 RNA 결합 특이성과 함께 대상을 인식하는 소정의 RBD를 사용하는 것이다. 그러나, 대부분의 천연 스플 라이스 인자는 RRM을 포함하거나 이와 친 화성이 약하고 짧은 RNA 요소를 인식하고 K 동성 (KH) 도메인, 예측 RNA 단백질 인식 &quot;코드&quot;(12)이 부족하다. PUF 반복 단백질의 RBD는 (즉, PUF 도메인) (14), 특히 다른 RNA를 인식하는 PUF 도메인의 재 설계를 허용, 독특한 RNA 인식 모드가 13 목표로하고있다. 정규 PUF 도메인은 각각 8 NT의 RNA 표적의 단일 염기를 인식하는 세 개의 α 나선 여덟 반복을 포함한다. t의 왓슨 - 크릭 가장자리 번째 α 나선 형태 특정 수소 결합의 특정 위치에서 아미노산의 측쇄그는 각각의 반복 ( 그림 1A )의 RNA 바인딩 특이성을 결정 RNA베이스. PUF 반복의 RNA 염기 인식을위한 코드는 놀라 울 정도로 간단하며 ( Figure 1A ), 가능한 8 염기 조합을 인식하는 PUF 도메인을 생성 할 수 있습니다 (Wei and Wang 15 ). 이 모듈 형 설계 원리는 맞춤화 된 PUF 도메인과 접합 변조 도메인 ( 예 : SR 도메인 또는 Gly- 풍부한 도메인)으로 구성된 공학적 접합 요소 (ESF)를 생성 할 수있게합니다. 이 ESFs는 스 플라이 싱 액티베이터 (splicing activator) 또는 다양한 유형의 스 플라이 싱 이벤트를 제어하기위한 억제제로서 기능 할 수 있으며, 인간 질병과 관련된 내인성 유전자의 스 플라이 싱을 조작하는 도구로서 유용하다. 예를 들어, Bcl-x 유전자의 스 플라이 싱을 구체적으로 변경하기 위해 PUF-Gly- 유형 ESF를 구축했다(Bcl-xL)을 프로 - 아폽토시스 (pro-apoptotic) 단 이소성 형태 (Bcl-xS)로 전환시키는 것을 특징으로하는 방법. Bcl-x isoform의 비율을 바꾸는 것은 여러 가지 암 세포를 여러 항암 화학 요법 약물에 민감하게 만들기에 충분했으며, 이러한 인공 인자가 잠재적 인 치료 시약으로 유용 할 수 있음을 시사한다. 공지 된 스 플라이 싱 이펙터 도메인 ( 예 : RS 또는 Gly- 리치 도메인)으로 스 플라이 싱을 제어하는 ​​것 외에도, 설계된 PUF 인자를 사용하여 새로운 스 플라이 싱 인자의 활성을 조사 할 수있다. 예를 들어,이 접근법을 사용하여 여러 SR 단백질의 C 말단 도메인이 다른 pre-mRNA 영역 18에 결합 할 때 접합을 활성화하거나 억제 할 수 있다는 것을 보여주었습니다. RBM4의 알라닌이 풍부한 주제는 접합 19 를 억제 할 수 있고, DAZAP1의 프롤린이 풍부한 모티프는 스 플라이 싱을 향상시킬 수있다 20 , 21 &lt;/ sup&gt;. 이러한 새로운 기능 영역은 추가적인 유형의 인위적 요인을 구성하여 접합을 미세 조정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>PCR 완충액이 있는 High-fidelity DNA 중합효소(Phusion High-Fidelity)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>DNA 리가제(T4 DNA 리가제)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>리포솜 형질주입 시약(Lipofectamine 2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>환원된 혈청 배지(Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>RNA 추출 완충액(TRIzol Reagent)</td><td>앰비온</td><td>15596018</td><td>TRIzol 시약에는 화상을 유발할 수 있는 페놀이 포함되어 있습니다. </td></tr><tr><td>PBS 취급 시 장갑 착용 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase (RT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-3 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>9668</td><td></td></tr><tr><td>PARP 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>9542</td><td></td></tr><tr><td>Bcl-x 항체</td><td>BD Bioscience</td><td>610211</td><td></td></tr><tr><td>beta-actin 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>알파-튜불린 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>FLAG 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4042</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>Amersham-Pharmacia</td><td>RPN203D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting detection 시약</td><td>Invitrogen</td><td>WP20005</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dCTP</td><td>GE 헬스케어</td><td>PA55021</td><td></td></tr><tr><td>형광 활성화 세포 분류기 (FACS)</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' 의 변형된 독수리' s Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7638-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-4832</td><td>필터 살균 및 보관 4°C; C</td></tr><tr><td>Vector pWPXLd</td><td>Addgene</td><td>12258</td><td></td></tr><tr><td>Vector pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Vector psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase-free)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)18 Primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO131&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>항-마우스 2차 항체 (Anti-mouse IgG, HRP-linked 항체)</td><td>세포신호전달 기술</td><td>7076S</td><td></td></tr></tbody></table>

인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

대부분의 진핵 생물 RNA의 프로세싱은 pre-mRNA target과 effector domain을 특이 적으로 결합시키는 RNA 인식 모듈을 포함하여 모듈 형 배열을 갖는 RNA Binding Protein (RBP)에 의해 매개된다. 이전에 우리는 인간 Pumilio 1의 PUF 도메인의 고유 한 RNA 결합 모드를 이용하여 RNA 신진 대사를 조작하기 위해 다양한 인공 RBP를 설계하는 프로그래밍 가능한 RNA 바인딩 스캐 폴드를 생성했습니다. 여기에는 세부적인 프로토콜이 구체적으로 표적 유전자의 선택적인 접합을 조절하도록 설계된 공학적 접합 인자 (ESF)를 구축하기 위해 기술되어있다. 이 프로토콜에는 특정 RNA 표적을위한 맞춤화 된 PUF 스캐 폴드를 설계하고 구성하는 방법, 디자이너 PUF 도메인과 이펙터 도메인을 융합시켜 ESF 발현 플라스미드를 구축하는 방법 및 ESF를 사용하여 표적 유전자의 접합을 조작하는 방법이 포함됩니다. 이 방법의 대표 결과에서, 우리는 또한 일반적인 assays를 설명했다스 플라이 싱 리포터를 사용한 ESF 활동, 배양 된 인간 세포에서의 ESF의 적용 및 스 플라이 싱 변화의 후속 효과. 이 보고서의 상세한 프로토콜을 따르면, 다른 유형의 Alternative Splicing (AS)의 조절을위한 ESF를 설계하고 생성 할 수 있으며, 접합 조절 및 다른 접합 이형의 기능을 연구하기위한 새로운 전략을 제공합니다. 또한, 설계된 PUF 영역과 다른 기능 영역을 융합시킴으로써 연구원은 RNA 공정의 다양한 단계를 조작하기 위해 특정 RNA를 표적으로하는 인공 인자를 설계 할 수있다.

이 보고서는 ESF 및 접합 기자의 설계 및 구성을위한 전체 프로토콜을 설명합니다. 또한 내인성 유전자의 AS 조작에있어 ESF의 추가 적용에 대해 설명한다. ESF 매개 스 플라이 싱 변경의 전형적인 결과를 설명하기 위해 이전 연구의 데이터를 예로 사용합니다. 상이한 기능성 영역을 갖는 ESF는 표적 카세트 엑손 ( 도 1D 및 E )의 포함을 촉진 또는 억제하는데 사용될 수있다. ESFs는 또한 리포터 시스템의 대체 5 '및 3'스플 라이스 사이트의 사용에 영향을 미칠 수 있습니다 ( 그림 1 F &amp; G ). 내인성 유전자의...

이 보고서는 특히 포유 동물 세포에서 표적 유전자의 스 플라이 싱을 조절하는 신규 한 인공 접합 인자 (ASFs)를 설계하고 구성하는 생명 공학 방법을 설명한다. 이 방법은 RNA 대사의 다른 측면을 조작하는 다양한 인공 요소를 엔지니어에게 확장 할 수 있습니다.

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 주어진 대상의 대체 접합을 구체적으로 조작할 수 있는 인공 접합 계수를 엔지니어링하는 것입니다. 이 방법은 암세포에서 대체 스플라이싱의 조절 및 오조절과 같은 RNA 처리 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유연성입니다.우리는 주어진 유전자에서 다른 유형의 대체 접합을 촉진하거나 억제하는 인공 요인을 설계할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구원인 Huan-Huan과 제 연구실의 박사후 연구원인 Qianyun입니다. Wild-type PUF DNA는 맞춤형 PUF 도메인 스캐폴드를 생성하기 위한 템플릿으로 사용됩니다.각 위치에서 서로 다른 RNA 뉴클레오티드를 특이적으로 인식하는 PUF 염기서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용합니다. 각 PUF 반복에 대해 4개의 다른 프라이머를 사용하여 각 위치에서 다른 베이스를 인식합니다. 1차 PCR에서 표시된 프라이머 쌍을 사용하여 4개의 PUF 반복, 범용 브리지 단편 및 캡 단편에 대한 코딩 서열을 생성합니다.2라운드에서는 마지막 단계에서 생성된 PCR 산물을 표시된 프라이머 조합과 함께 템플릿으로 사용하여 RNA 인식 코드 R-1 - R-4 및 R-5 - R-8에 대한 코딩 서열을 생성합니다. 3라운드에서는 2라운드의 제품을 사용하여 R-one 포워드 프라이머 및 R-8 리버스 프라이머를 사용하여 캡 없이 R-1에서 R-8에 대한 코딩 시퀀스를 생성합니다. 4차 PCR에서 R-1 - R-8, 5-프라임 엔드 캡 및 3-프라임 엔드 캡을 템플릿으로 사용하여 전체 PUF 도메인에 대한 코딩 염기서열을 생성합니다.HEK-293T 세포의 transfection을 시작하려면 병을 부드럽게 뒤집어 리포솜 transfection 시약을 혼합합니다. 그런 다음 2마이크로리터의 리포솜 형질주입 시약을 형질주입당 50마이크로리터의 환원된 혈청 배지에 희석합니다. 부드럽게 섞은 다음 실온에서 5분 동안 배양합니다.다음으로, 04μg의 glycine-rich domain 발현 벡터와 0.2μg의 모듈식 스플라이싱 리포터 플라스미드를 50μm의 환원된 혈청 배지에 넣어 멸균 튜브에 희석합니다. 그런 다음 0.4μg의 RS-effector 도메인 발현 벡터와 0.2μg의 PGZ-three 리포터 플라스미드를 50μl의 환원된 혈청 배지에 희석합니다. 마지막으로, 0.4μm의 PGL-RS-PUF 발현 벡터와 0.2μg의 PEZ-1B 또는 PEZ-2F 리포터 플라스미드를 멸균 튜브의 환원된 혈청 배지 50μm에 희석합니다.실온에서 5분 동안 배양한 후, 희석된 리포솜 형질주입 시약을 희석된 플라스미드 혼합물과 부드럽게 혼합합니다. 최종 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 HEK-293 세포가 파종된 24웰 플레이트의 각 웰에 발현 벡터를 포함하는 형질주입 혼합물을 첨가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소의 가습된 인큐베이터에서 최소 12시간 동안 배양합니다.12시간의 배양 후, 트립신화(trypsinization)와 원심분리(centrifugation)를 통해 형질주입된 세포를 수확합니다. 원심분리 후 배지를 버리고 튜브당 0.5ml의 RNA 추출 버퍼를 추가합니다. 각 샘플에 RNA 추출 버퍼 0.5ml당 0.1ml의 클로로포름을 추가합니다.배양 후 12, 000회 G 및 섭씨 4도에서 15분 동안 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 수성 염기를 새 튜브로 옮깁니다. 초기 균질화에 사용된 RNA 추출 완충액 0.5ml당 0.25ml의 이소프로판올을 추가합니다.볼텍싱으로 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 이전과 같이 원심분리 후 RNA 침전물은 일반적으로 튜브 바닥에서 볼 수 있습니다. 상등액을 버리고 RNA 추출 완충액 0.5ml당 75% 에탄올 0.5ml로 RNA 펠릿을 세척합니다.격렬하게 와류, 그 후에 7, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 500 시간 G에 원심 분리기. 스핀 후 상층액을 제거하고 RNA 펠릿을 자연 건조합니다. RNase가 없는 물 50마이크로리터에 RNA를 용해시킵니다.다음으로, 각 50마이크로리터 RNA 용액에 마이크로리터 DNase-one당 5개 단위씩 2마이크로리터, 10X 완충액 7마이크로리터, 물 11마이크로리터를 추가합니다. 배양 후 용액을 섭씨 70도에서 15분 동안 가열하여 DNase를 비활성화합니다. 역전사효소 반응을 수행하여 각 샘플에서 cDNA를 합성한 후, PCR 반응이라고 표시된 본체의 성분을 화면에 표시된 순서대로 PCR 튜브에 추가합니다.샘플당 하나의 반응을 준비합니다. 열 순환기에서 RT-PCR 프로그램을 실행합니다. 마지막으로, TBE 완충액이 있는 10% 폴리아크릴아미드 겔을 통해 전기영동으로 PCR 산물을 분해합니다.형광 스캐너를 사용하여 산물을 시각화하고 밀도 측정 소프트웨어를 사용하여 각 접합된 동형의 양을 측정합니다. 면역형광 분석법에서 세포사멸(apoptosis)을 측정하기 위해서는 앞서 보여준 바와 같이 글리신이 풍부한 도메인 발현 플라스미드를 포함하는 transfection mix를 준비하고, 폴리리신으로 코팅된 유리 커버 슬립에서 성장한 HeLa 세포를 6웰 플레이트에서 transfection합니다. transfection 후 24시간 후, 실온에서 20분 동안 1x PBS에 4%파라포름알데히드 1ml로 커버 슬립의 세포를 고정합니다.그런 다음 5분 동안 1x PBS 2밀리리터로 커버 슬립의 세포를 부드럽게 씻습니다. 다음으로, 1x PBS에서 0.2%Triton X-100으로 세포를 10분 동안 투과시킵니다. 이전과 같이 1x PBS로 3회 세척한 후 10분 동안 1x PBS에서 3% 소 혈청 알부민으로 비특이적 결합을 차단합니다.PBS에서 3%BSA에 플래그 항체를 1에서 1, 000으로 희석하고, 희석된 플래그 항체 30마이크로리터를 파라필름 시트에 피펫팅합니다. 집게를 사용하여 커버 슬립을 제거합니다. 실험실 물티슈로 여분의 버퍼를 조심스럽게 건조시킨 다음 커버 슬립 셀 면이 아래로 향하게 하여 플래그 방지 용액에 놓습니다.실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 약 500마이크로리터의 1x PBS를 용액 위에 떠오를 때까지 커버 슬립의 세포 쪽에 추가합니다. 웰에 1x PBS가 있는 6웰 플레이트로 다시 넣습니다.이전과 같이 파라필름에 2차 항체를 15분 동안 배양합니다. 이전과 같이 세척한 다음 DAPI가 포함된 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 형광 현미경을 사용하여 세포를 시각화하고 디지털 카메라를 사용하여 사진을 촬영합니다.면역형광 현미경을 사용하여 Gly-PUF-531을 발현하는 많은 세포가 핵 DNA를 단편화하여 세포사멸을 진행하고 있음을 나타냅니다. 대조군으로서, Gly-PUF 야생형을 발현하는 세포는 Gly-PUF-531 형질주입된 세포에 비해 단편화된 핵 DNA가 적었습니다. 여기서, DAPI 염색 세포와 결합된 안티 플래그 항체를 사용한 면역형광 현미경 검사는 Gly-PUF-531이 주로 형질 주입된 세포의 핵에 국한되어 있음을 보여줍니다.Gly-PUF wild-type은 또한 형질주입된 세포의 핵에 국한되어 있으며, 이는 완전히 접합된 mRNA가 세포질로 운반될 때 이러한 ESF가 표적에서 해리됨을 시사합니다. 단편화된 핵 DNA를 가진 세포사멸 세포의 비율은 무작위로 선택된 형광 현미경 이미지 영역에서 측정되었습니다. 일단 마스터하면 RNA 결합 특이성을 가진 PUF 스캐폴드의 구축이 제대로 수행되면 2일 안에 완료할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 인공 요인을 엔지니어링하여 인간 세포의 대체 스플라이싱을 구체적으로 조작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

engineering-artificial-factors-to-specifically-manipulate-alternative

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

선택적 접합 조절은 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 필수적인 세포 프로그램인 상피-중간엽 전이(EMT)에 기여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 EMT 중 선택적 접합을 감지하기 위해 유도 가능한 EMT 모델을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

여기에서 우리는 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열을 통해 부모와 체외에서 저항 모델의 transcriptomic 프로필을 분석 후보 유전자를 확인하기 위해 QRT-PCR 기반의 방법을 설립했다.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

현장에서 교 잡 (ISH) 사용 하는 프로토콜 짧은 센스 oligonucleotides 마우스 뇌 섹션에 대체 이전 mRNA 접합 패턴을 감지 하는 설명 되어 있습니다.

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

우리는 원형 RNA를 생성하는 리포터 유전자를 복제하고 분석합니다. 이러한 리포터 유전자는 선형 접합을 분석하고 Alu 요소를 포함하는 구성물보다 큽합니다. 원형 RNA를 조사하기 위하여는, 구조물은 세포로 형질 감염되고 결과 RNA는 선형 RNA의 제거 후에 RT-PCR를 사용하여 분석됩니다.

원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 Alu 요소 사용

이 프로토콜은 근막세포로 피부 섬유아세포의 변환과 근투로의 분화를 설명합니다. 세포주 신경 근육 장애를 가진 환자에서 파생 되 고 병리학 적 메커니즘을 조사 하 고 치료 전략을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

이 프로토콜은 화학 요법 치료 후 대체 접합 조절에서 특징이 없는 기능을 가진 단백질의 역할을 평가하기 위한 신속하고 유용한 도구를 제공합니다.

E1A 미니진 도구를 사용하여 mRNA 접합 변화를 연구합니다.

대체 스플라이싱(AS) 및 대체 폴리아데닐화(APA)는 전사체 이소형과 그 생성물의 다양성을 확장합니다. 여기에서는 실험 조건에 따라 다양한 AS 및 APA를 검출하고 시각화하기 위해 벌크 RNA-seq 및 3' 말단 시퀀싱 분석을 분석하는 생물정보학 프로토콜을 설명합니다.

RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화 식별

이 프로토콜은 5'splice 사이트 돌연변이가 접합에 미치는 영향을 모니터링하기 위한 미니유전자 기자 분석체를 설명하고 돌연변이 유발 접합 억제를 위한 억제기 U1 snRNA를 개발한다. 리포터 및 억제기 U1 snRNA 구조는 HeLa 세포에서 발현되고, 접합은 프라이머 확장 또는 RT-PCR에 의해 분석된다.

접합 효율 모니터링을 위한 기자 기반 셀룰러 분석

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 체세포 돌연변이를 충실하게 모델링하는 새로운 전략은 조혈 줄기 세포 생물학 및 혈액 악성 종양을 더 잘 연구하는 데 필요합니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9의 사용과 이중 rAAV 공여체 형질도입을 결합하여 HSPC에서 이형접합체 기능 획득 돌연변이를 모델링하는 프로토콜이 설명됩니다.

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

이 프로토콜은 효과적으로 격리 갓 인간 융모 cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 감염 microporation을 사용하여 이들 세포의 DNA 단백질 복합체를 식별하는 방법을 설명한다. 형질 감염된 세포는 웨스턴 블롯에 의해 모니터링 될 수 있고, EMSA는 4 일간의 배양 기간 동안 분석한다.

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

배우세요 인공 스플라이싱 인자를 설계하여 인간 세포에서 선택적 스플라이싱을 조작하는 생명공학 방법을. PUF 도메인 스캐폴드를 활용한 이 기술은 RNA 처리 및 암 연구에 활용됩니다.

인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할

더 많은 동영상 탐색