인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할

이 프로토콜의 전반적인 목표는 주어진 대상의 대체 접합을 구체적으로 조작할 수 있는 인공 접합 계수를 엔지니어링하는 것입니다. 이 방법은 암세포에서 대체 스플라이싱의 조절 및 오조절과 같은 RNA 처리 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유연성입니다.

우리는 주어진 유전자에서 다른 유형의 대체 접합을 촉진하거나 억제하는 인공 요인을 설계할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구원인 Huan-Huan과 제 연구실의 박사후 연구원인 Qianyun입니다. Wild-type PUF DNA는 맞춤형 PUF 도메인 스캐폴드를 생성하기 위한 템플릿으로 사용됩니다.

각 위치에서 서로 다른 RNA 뉴클레오티드를 특이적으로 인식하는 PUF 염기서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용합니다. 각 PUF 반복에 대해 4개의 다른 프라이머를 사용하여 각 위치에서 다른 베이스를 인식합니다. 1차 PCR에서 표시된 프라이머 쌍을 사용하여 4개의 PUF 반복, 범용 브리지 단편 및 캡 단편에 대한 코딩 서열을 생성합니다.

2라운드에서는 마지막 단계에서 생성된 PCR 산물을 표시된 프라이머 조합과 함께 템플릿으로 사용하여 RNA 인식 코드 R-1 - R-4 및 R-5 - R-8에 대한 코딩 서열을 생성합니다. 3라운드에서는 2라운드의 제품을 사용하여 R-one 포워드 프라이머 및 R-8 리버스 프라이머를 사용하여 캡 없이 R-1에서 R-8에 대한 코딩 시퀀스를 생성합니다. 4차 PCR에서 R-1 - R-8, 5-프라임 엔드 캡 및 3-프라임 엔드 캡을 템플릿으로 사용하여 전체 PUF 도메인에 대한 코딩 염기서열을 생성합니다.

HEK-293T 세포의 transfection을 시작하려면 병을 부드럽게 뒤집어 리포솜 transfection 시약을 혼합합니다. 그런 다음 2마이크로리터의 리포솜 형질주입 시약을 형질주입당 50마이크로리터의 환원된 혈청 배지에 희석합니다. 부드럽게 섞은 다음 실온에서 5분 동안 배양합니다.

다음으로, 04μg의 glycine-rich domain 발현 벡터와 0.2μg의 모듈식 스플라이싱 리포터 플라스미드를 50μm의 환원된 혈청 배지에 넣어 멸균 튜브에 희석합니다. 그런 다음 0.4μg의 RS-effector 도메인 발현 벡터와 0.2μg의 PGZ-three 리포터 플라스미드를 50μl의 환원된 혈청 배지에 희석합니다. 마지막으로, 0.4μm의 PGL-RS-PUF 발현 벡터와 0.2μg의 PEZ-1B 또는 PEZ-2F 리포터 플라스미드를 멸균 튜브의 환원된 혈청 배지 50μm에 희석합니다.

실온에서 5분 동안 배양한 후, 희석된 리포솜 형질주입 시약을 희석된 플라스미드 혼합물과 부드럽게 혼합합니다. 최종 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 HEK-293 세포가 파종된 24웰 플레이트의 각 웰에 발현 벡터를 포함하는 형질주입 혼합물을 첨가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소의 가습된 인큐베이터에서 최소 12시간 동안 배양합니다.

12시간의 배양 후, 트립신화(trypsinization)와 원심분리(centrifugation)를 통해 형질주입된 세포를 수확합니다. 원심분리 후 배지를 버리고 튜브당 0.5ml의 RNA 추출 버퍼를 추가합니다. 각 샘플에 RNA 추출 버퍼 0.5ml당 0.1ml의 클로로포름을 추가합니다.

배양 후 12, 000회 G 및 섭씨 4도에서 15분 동안 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 수성 염기를 새 튜브로 옮깁니다. 초기 균질화에 사용된 RNA 추출 완충액 0.5ml당 0.25ml의 이소프로판올을 추가합니다.

볼텍싱으로 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 이전과 같이 원심분리 후 RNA 침전물은 일반적으로 튜브 바닥에서 볼 수 있습니다. 상등액을 버리고 RNA 추출 완충액 0.5ml당 75% 에탄올 0.5ml로 RNA 펠릿을 세척합니다.

격렬하게 와류, 그 후에 7, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 500 시간 G에 원심 분리기. 스핀 후 상층액을 제거하고 RNA 펠릿을 자연 건조합니다. RNase가 없는 물 50마이크로리터에 RNA를 용해시킵니다.

다음으로, 각 50마이크로리터 RNA 용액에 마이크로리터 DNase-one당 5개 단위씩 2마이크로리터, 10X 완충액 7마이크로리터, 물 11마이크로리터를 추가합니다. 배양 후 용액을 섭씨 70도에서 15분 동안 가열하여 DNase를 비활성화합니다. 역전사효소 반응을 수행하여 각 샘플에서 cDNA를 합성한 후, PCR 반응이라고 표시된 본체의 성분을 화면에 표시된 순서대로 PCR 튜브에 추가합니다.

샘플당 하나의 반응을 준비합니다. 열 순환기에서 RT-PCR 프로그램을 실행합니다. 마지막으로, TBE 완충액이 있는 10% 폴리아크릴아미드 겔을 통해 전기영동으로 PCR 산물을 분해합니다.

형광 스캐너를 사용하여 산물을 시각화하고 밀도 측정 소프트웨어를 사용하여 각 접합된 동형의 양을 측정합니다. 면역형광 분석법에서 세포사멸(apoptosis)을 측정하기 위해서는 앞서 보여준 바와 같이 글리신이 풍부한 도메인 발현 플라스미드를 포함하는 transfection mix를 준비하고, 폴리리신으로 코팅된 유리 커버 슬립에서 성장한 HeLa 세포를 6웰 플레이트에서 transfection합니다. transfection 후 24시간 후, 실온에서 20분 동안 1x PBS에 4%파라포름알데히드 1ml로 커버 슬립의 세포를 고정합니다.

그런 다음 5분 동안 1x PBS 2밀리리터로 커버 슬립의 세포를 부드럽게 씻습니다. 다음으로, 1x PBS에서 0.2%Triton X-100으로 세포를 10분 동안 투과시킵니다. 이전과 같이 1x PBS로 3회 세척한 후 10분 동안 1x PBS에서 3% 소 혈청 알부민으로 비특이적 결합을 차단합니다.

PBS에서 3%BSA에 플래그 항체를 1에서 1, 000으로 희석하고, 희석된 플래그 항체 30마이크로리터를 파라필름 시트에 피펫팅합니다. 집게를 사용하여 커버 슬립을 제거합니다. 실험실 물티슈로 여분의 버퍼를 조심스럽게 건조시킨 다음 커버 슬립 셀 면이 아래로 향하게 하여 플래그 방지 용액에 놓습니다.

실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 약 500마이크로리터의 1x PBS를 용액 위에 떠오를 때까지 커버 슬립의 세포 쪽에 추가합니다. 웰에 1x PBS가 있는 6웰 플레이트로 다시 넣습니다.

이전과 같이 파라필름에 2차 항체를 15분 동안 배양합니다. 이전과 같이 세척한 다음 DAPI가 포함된 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 형광 현미경을 사용하여 세포를 시각화하고 디지털 카메라를 사용하여 사진을 촬영합니다.

면역형광 현미경을 사용하여 Gly-PUF-531을 발현하는 많은 세포가 핵 DNA를 단편화하여 세포사멸을 진행하고 있음을 나타냅니다. 대조군으로서, Gly-PUF 야생형을 발현하는 세포는 Gly-PUF-531 형질주입된 세포에 비해 단편화된 핵 DNA가 적었습니다. 여기서, DAPI 염색 세포와 결합된 안티 플래그 항체를 사용한 면역형광 현미경 검사는 Gly-PUF-531이 주로 형질 주입된 세포의 핵에 국한되어 있음을 보여줍니다.

Gly-PUF wild-type은 또한 형질주입된 세포의 핵에 국한되어 있으며, 이는 완전히 접합된 mRNA가 세포질로 운반될 때 이러한 ESF가 표적에서 해리됨을 시사합니다. 단편화된 핵 DNA를 가진 세포사멸 세포의 비율은 무작위로 선택된 형광 현미경 이미지 영역에서 측정되었습니다. 일단 마스터하면 RNA 결합 특이성을 가진 PUF 스캐폴드의 구축이 제대로 수행되면 2일 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 인공 요인을 엔지니어링하여 인간 세포의 대체 스플라이싱을 구체적으로 조작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.