Name: 비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 학습하세요 비계 리포좀을 활용한 체외 지질 근위 단백질 상호작용 재구성 방법입니다. 이 기술은 미토콘드리아 분열 기계에서 보조 지질이 단백질 상호작용에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 미국심장협회(SDG12SDG9130039)로부터 받은 기금에 감사를 표합니다.

1. 비계 리포좀의 제조 참고 : 이상적으로, 초기 실험은 DOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 또는 PC)와 DGS-NTA (니켈 2 +) (1,2-dioleoyl로 구성된 비교적 간단하고 특색 발판을 (사용해야합니다 - SN -glycero -3 - [(N은 - (5- 아미노 -1- 카르복시) 이미 노디 아세트산) 숙시 닐]. (니켈 염)) 건축 실험 오프 지질 전하, 유연성 및 굴곡 개별 요소로서 도입 될 수있다 잠재적으로 막 근위 상호 작용을 변경한다. 이러한 변경 또는 포스파티딜 리핀 (CL), 포스파티딜 에탄올 아민 (DOPE 또는 PE) 또는 락토 (β) 세라미드 지질 성분을 포함한 특정의 한정된 양의 첨가에 의해 달성 될 수있다. <ol><li> 깨끗한 유리 시험관에 클로로포름 지질 결합. 얇은 지질막을 형성하도록 튜브를 회전시키면서 건조 질소 가스에 용제를 증발시켰다. centrifuga와 잔류 용매를 제거37 ° C에서 1 시간 동안 L 증발기. 참고 : 다양한 리포좀 제제는 프로토콜에 사용되는 아래에 설명 : 비계 리포좀 (3.3 몰 % DGS-NTA (니켈 2 +) / 96.7 몰 %의 DOPC), 카디오 리핀과 비계 리포좀 (3.3 몰 % DGS-NTA 니켈 (Ni 2+) / 10 몰 %의 리핀 / 86.7 몰 %의 DOPC), 카디오 리핀 유연한 골격 리포솜 (3.3 몰 % DGS-NTA (니켈 2+) / 10 몰 %의 리핀 / 35 몰 %의 DOPE / 51.7 몰 %의 DOPC) 및 농축 된 지지체 리포좀 (10 몰 % DGS-NTA (니켈 2+) / 35 몰 % DOPE / 40 몰 %의 DOPC / 15 몰 %의 리핀). </li><li> 37 ° C로 예열 완충액 A (25 mM의 HEPES (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산) KOH 7.5로 조정 한 150 mM의 KCl을, 산도)를 추가, 최종 지질 농도는 1이되도록 - 2 mm이다. 완전히 지질 혼합물 (도 1a)에 재현 탁하는 비정기 텍싱 37 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> 완전히 냉동 (roug 때까지 액체 질소에 튜브, 플라스틱 시험관에 이동 배치hly 30 초), 완전히 해동 (약 1까지 37 ° C의 물을 욕조에 장소 - 2 분). 4 동결 해동 사이클 (그림 1b)의 총 반복합니다. </li><li> 4 필터 지원 및 버퍼의 폴리 카보네이트 필터를 몸을 담글 및 제조업체 지침에 따라 압출기를 조립하여 지질 압출기를 준비합니다. 필터를 통해 21 회 지질 용액을 돌출. 균일 한 크기 분포 (그림 1C)을 보장하기 위해 부드러운, 일정한 압력을 사용합니다. 주 :이 프로토콜에 기재된 모든 실험의 경우, 1.0 ㎛의 폴리 카보네이트 필터를 압출 하였다. 음이온 성 지질로 Drp1 개입 50 nm 내지 400 nm의 12 이상 13 범위 리포솜 다양한 직경으로 관찰 할 수있다. 따라서, 1 ㎛의 필터 사이즈 모두는 GTPase 활성 및 전자 현미경에 적합하도록 선택되었다. 다른 리포좀 직경은 원하는 경우 거대한 단일 층 소포 14, 15 (GUVs) 또는 작은 unilamell의 준비아칸소 사용할 수 있습니다 (16) (포드 SUV)을 소포. 동적 광산란 리포좀 크기 이질성 (13)을 평가하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 4 ° C에서 압출 리포좀을 저장하고 3 후 폐기 - 5 라. </li></ol> 단백질 바인딩 분석을위한 발판 리포좀의 2. <ol><li> 샘플 준비 <ol><li> 적어도 15 분 동안, 비계 리포좀 (50 μM 최종 40 몰 %의 PC / 35 몰 %의 PE / 15 몰 % CL / 10 몰 % DGS-NTA 니켈 (Ni 2+))와 (5 μm의 최종) MffΔTM을 그의 - 태그 품어 버퍼 A + BME에 실온에서 (25 mM의 HEPES, 150 밀리미터의 KCl, 10 MM의 β-머 캅토 에탄올 (BME)는, pH는 KOH 7.5로 조정). MFF없는 제어를 위해, NTA 니켈 (Ni 2+)에 노출 된 자신의 태그가 제어 결합하는 (예 : GFP)을 단백질과 방패 리포좀을 품어. 주 :이 이전의 연구에서 설명 된 바와 같이 MffΔTM은 발현시키고 정제 하였다. GFP를 유사한 방식으로 정제되었지만, 이온 교환 공정을 생략 하였다. BME이 experimen 필요했다TS Drp1는 활동 및 조립 특성을 변경할 수 있습니다 산화에 민감하기 때문이다. </li><li> Drp1 (최종 2 μM)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양. 주 :이 이전의 연구에서 설명 된 바와 같이 Drp1은 발현시키고 정제 하였다. Drp1과 부화 후, 막 변형을 구속 염기의 효과가 2 밀리미터의 MgCl 2, 중 1 ㎜ GTP, 1 mM의 GMP-PCP, 또는 버퍼 A + BME를 하나의 추가 시간을 배양하여 조사 할 수있다. </li></ol></li><li> 네거티브 얼룩 투과 전자 현미경 (EM) 분석 <ol><li> 전사 5 실험실 필름의 시트 샘플 μL, 시료에 카본 코팅 구리 / Rh를 그리드 누워. 샘플의 그리드 1 분을 품어 필터 종이에 여분의 액체를 멀리 오 점, 2 %의 우라 닐 아세테이트 한 방울로 전송합니다. 1 분을 품어 필터 종이에 여분의 얼룩을 지워, 및 그리드 상자로 전송할 수 있습니다. 진공 O / N에서 스토어 전체 탈수을 보장합니다. </li><li> 투과형 전자 microsc를 사용하여 이미지 샘플18,500에서 OPE - 30,000X 배율은 단백질과 리포좀 모폴로지 (17)의 미세 구조 변화를 관찰합니다. 참고 : 미세 구조의 변화가 그러한 ImageJ에 (13), 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화 할 수있다 (http://imagej.nih.gov/ij/). 단백질은 장식 벗은 지질 템플릿과 비교하여 측정 할 수있다. 또한, 관형 부분의 직경은 어셈블리 (13)의 최 외곽 부분에서 측정 할 수있다. 보다 상세한 분석은 극저온 전자 현미경 (17)을 사용하여 수행 될 수있다. 이 방법은 코팅 샘플의 중금속 오염을 사용하지 않고 용매 이미지 천연 단백질 지질 어셈블리에 사용될 수있다. 이와 같이, 기본 형태의 지질의 변화를 포함한 음극 얼룩 명백하지 상세한 구조적 특징은 검사하고 정량화 할 수있다. </li></ol></li></ol> 효소 분석을위한 발판 리포좀의 3. 참고 : 로리를통계는 GTPase 분석 (18)는 GTP 가수 분해를 통해 인산 해방을 측정하는 데 사용되었다. 대체는 GTPase 세이 19 사용할 수 있으며, 필요에 따라 구현 될 수있다. <ol><li> (150 μM 최종) 비계 리포좀 버퍼 A + BME (부피 = 30 μL)에 실온에서 15 분간와 그의-태그 MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1), 또는 GFP가 (모두 5 μm의 최종) 품어. Drp1 (500 nM의 최종)를 추가하고 RT (부피 = 80 μL)에 추가로 15 분을 품어. 참고 Fis1 MFF는 2와 유사한 방식으로 정제되었지만, 이온 교환 크로마토 그래피 단계는 생략 하였다. 그 태깅 된 GFP의 목적은 NTA (니켈 2+) headgroups 실드와 다른 단백질과의 비특이적 상호 작용의 전하를 방지하기위한 것이다. 효과는 GFP의 부재하에 관찰되지 않으면,이 제어가 필요하지 않을 수도있다. (관심있는 단백질에 필적하는 크기의) 대안 차단 단백질도 사용할 수 있지만, GFP는 SCAF와의 상호 작용의 직접적인 시각화를 허용리포좀을 접어주십시오. </li><li> 열 순환기로 전송 튜브는 37 ° C로 설정하고, GTP와의 MgCl 2를 첨가하여 반응을 개시 (각각 1 ㎜, 2 mM의 결승전을, 부피 = 120 μL를). </li><li> 목적하는 시점 (즉, T = 5, 10, 20, 40, 60 분)에서의 Mg 킬레이트 2+하고 반응을 정지 0.5 M EDTA 5 μL를 포함하는 미세 적정 플레이트의 웰에 반응 20 μL 옮긴다. </li><li> 결과를 보정 버퍼 A + BME에서 KH 2 PO 4를 희석하여 인산 표준 세트를 준비합니다. 표준 유용한 집합은 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 0 μM이다. 0.5 M EDTA의 5 μL를 포함하는 우물에 각 20 μL를 추가합니다. </li><li> 각 웰에 150 μL 말라카이트 그린 시약 (1 mM의 말라카이트 그린 카비 놀, 10 mM의 몰리브덴 산 암모늄 수화물, 1 N 염산)을 추가하고 OD를 첨가 한 후 650 5 분을 참조하십시오. 주 : GTP는 산 불안정성이며, 말라카이트 그린 시약의 존재 하에서 가수 분해된다. 그 t 확인공작석 시약을 추가하고 읽기 사이에 그는 시간이 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 일정하다. </li><li> 인산염 농도의 함수로서 표준 OD 650 플로팅하여 표준 곡선을 생성한다. 샘플의 OD 650 인산염 농도 사이의 관계를 결정하기 위해 선형 회귀 분석을 사용한다. </li><li> 선형 회귀를 이용 μM 인산염 단백질 반응 시료의 OD 650으로 변환. 시간의 함수로서 인산 농도를 플로팅하여 각각의 반응 액에 대한 포스페이트 생성 속도를 결정하고 Drp1 농도 (0.5 μM)에 의해 속도를 나누어 고양이 k로 변환한다. 참고 : 초기 선형 속도 포스페이트 생성 속도를 결정하기 위해 사용되어야하고, (3) 데이터 포인트의 최소 사용되어야한다. 반응 속도는 처음 세 데이터 포인트가없는 선형 충분히 빠른 경우 사인 (즉, 선형 피팅의 R2는 0.9 미만이다)최소 3 시간 포인트 ificantly 짧은 시간 과정은 수행해야합니다. </li></ol>

<ol><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-related+Protein+1+Oligomerization+in+Solution+Impairs+Functional+Interactions+with+Membrane-anchored+Mitochondrial+Fission+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor.</a> J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).</li>
<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Fusion+and+Fission+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals.</a> Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).</li>
<li>Bui, H. T., Shaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+Assembly+Strategies+and+Adaptor+Proteins+in+Mitochondrial+Fission%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission.</a> Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).</li>
<li>Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+into+the+understanding+of+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+%28BBA%29+-+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances into the understanding of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).</li>
<li>Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fis1%2C+Mff%2C+MiD49%2C+and+MiD51+mediate+Drp1+recruitment+in+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission.</a> Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).</li>
<li>Otera, H., Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mff+is+an+essential+factor+for+mitochondrial+recruitment+of+Drp1+during+mitochondrial+fission+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).</li>
<li>Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Novel+Tail-anchored+Membrane+Protein+Mff+Controls+Mitochondrial+and+Peroxisomal+Fission+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells.</a> Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).</li>
<li>Koirala, S., Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchangeable+adaptors+regulate+mitochondrial+dynamin+assembly+for+membrane+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).</li>
<li>Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimeric+equilibrium+intermediate+nucleates+Drp1+reassembly+on+mitochondrial+membranes+for+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission.</a> Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).</li>
<li>Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Splice+Variants+of+Dynamin-related+Protein+1+Differentially+Utilize+Mitochondrial+Fission+Factor+as+an+Effector+of+Cooperative+GTPase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity.</a> J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).</li>
<li>Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Interaction+with+Cardiolipin+Triggers+Functional+Activation+of+Dynamin-Related+Protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1.</a> PLoS ONE. 9 (7), (2014).</li>
<li>Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanoenzymatic+Core+of+Dynamin-Related+Protein+1+Comprises+the+Minimal+Machinery+Required+for+Membrane+Constriction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles%3A+Preparations+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid preparation of giant unilamellar vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).</li>
<li>Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use+small+unilamellar+phospholipid+vesicles+by+ultrasonication+with+a+beaker+resonator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator.</a> Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).</li>
<li>Mears, J. A., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13+Visualization+of+Dynamins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 13 Visualization of Dynamins.</a> Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).</li>
<li>Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Colorimetric+Assays+for+Dynamin%27s+Basal+and+Stimulated+GTPase+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities.</a> Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).</li>
<li>Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnm1+forms+spirals+that+are+structurally+tailored+to+fit+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria.</a> J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).</li>
<li>Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+oligomerization+and+mitochondrial+remodelling+of+dynamin+1-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein.</a> EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).</li>
<li>James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hFis1%2C+a+Novel+Component+of+the+Mammalian+Mitochondrial+Fission+Machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery.</a> J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).</li>
<li>Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+Protein+hFis1+Regulates+Mitochondrial+Fission+in+Mammalian+Cells+through+an+Interaction+with+the+Dynamin-Like+Protein+DLP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).</li>
<li>Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+and+independent+roles+of+Drp1+adaptors+Mff+and+MiD49%2F51+in+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission.</a> J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).</li>
<li>Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-Directed+Self-Assembly+Enhances+RTK+Catalytic+Domain+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function.</a> J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).</li>
<li>Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-directed+Assembly+of+Signaling+Proteins%3A+A+Novel+Drug+Screening+and+Research+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool.</a> Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).</li>
<li>Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+a+membrane-bound+murine+MHC+class+I+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).</li>
<li>Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+helix+dimerization%3A+Beyond+the+search+for+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).</li>
<li>Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+of+membrane-spanning+and+glycosylphosphatidylinositol-+linked+proteins%3A+toward+establishing+rules+governing+the+lateral+mobility+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins.</a> J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).</li>
<li>Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion of membrane proteins.</a> J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).</li>
<li>Gambin, Y., Reffay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+the+lateral+mobility+of+transmembrane+peptides+with+hydrophobic+mismatch%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch.</a> J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).</li>
<li>Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanotubes+as+substrates+for+helical+crystallization+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules.</a> Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).</li>
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이 프로토콜은 통합 막 단백질을 포함하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하는 방법을 제공한다. 모듈 리포솜 지지체를 이용하여, 연구자들은 지질 근위 환경에서 하나 이상의 단백질의 활성을 사정 할 수있다. 26 - 이전 연구 세포막 수용체 (24)의 효소를위한 동일한 방법을 증명하고있다. 우리는 지질 보조 인자를 포함하고 미토콘드리아 분열 기계의 mechanoenzymatic 핵심을 구성하는 단백질 사이의 상호 작용을 탐구하는이 방법을 확장했다. 위에서 제시 한 모델 시스템을 위해, 우리는 MFF 장식 SL이 Drp1의 자기 조립을 강화 것으로 나타났습니다. 또한, 우리는 이제 MFF 장식 ESL 템플릿 효율적으로 확장 관 구조를 형성하도록 야생형 Drp1으로 개조 된 것을 나타낸다. 또한 음전기 리핀 및 원뿔형 지질 PE 등 다양한 미토콘드리아 지질의 역할을 평가 하였다.PE에 의해 부여 막의 유연성과 유동성 막 ...

막 인접 단백질 - 단백질 상호 작용을 공부 인해 1 포함 된 통합 막 단백질의 기본 환경을 recapitulating 어려움에 도전적인 노력이다. 이 세제 용해 필요성 및 테오 단백질의 방향 불일치에 기인한다. 이러한 문제를 방지하기 위해, 우리는 통합 막 단백질의 가용성 도메인 그의 태그 융합 단백질로서 발현된다 전략을 채용 한 이러한 가용성 단편 지질에 NTA (니켈 2+) headgroups와의 상호 작용을 통해 지지체 리포솜에 고정되고 표면. 이러한 발판 사용 근위 지질 단백질 상호 작용은 지질 및 단백질 조성의 범위를 조사 할 수있다. 우리는 효과적으로 홍보를 조절하는 지질 상호 작용을 미토콘드리아 분열 복합체의 조립을 지배하는 중요한 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하고 검토하려면이 방법을 적용했습니다ocess 2. 미토콘드리아 분열 동안 Dynamin 관련 단백질 1 (Drp1) 3이라고하는 보존 막 리모델링 단백질은 에너지 항상성, 세포 사멸 신호, 및 기타 여러 가지를 조절 세포 신호에 응답하여 상기 외부 미토콘드리아 막 (OMM)의 표면에 채용되고 필수적인 미토콘드리아 처리합니다. 8 -이 큰, 세포질는 GTPase는 통합 OMM 단백질 (4)과의 상호 작용을 통해 미토콘드리아의 표면에 채용된다. 그러한 단백질의 역할 미토콘드리아 분열 인자 (MFF)에 의한 시험 관내 Drp1와 겉보기 약한 상호 작용을 해명 어려웠다. 그럼에도 불구하고, 유전자 연구는 명확하게 MFF 성공 미토콘드리아 분열 7,8에 필수적임을 증명하고있다. 이 논문에 기재된 방법은 Drp1 MFF-상호 작용을 촉진 동시 지질 상호 작용을 도입함으로써 기존의 단점을 극복 할 수 있었다. 전반적으로,이 소설 분석 revea미토콘드리아 분열 복합체의 어셈블리를 안내 근본적인 상호 작용을지도하고 필수적인 분자 기계의 지속적인 구조 및 기능 연구에 새로운 단계를 제공했다. 지금까지 Drp1과 MFF 사이의 상호 작용의 검사가 MFF (9)의 고유의 유연성에 의해 복잡하게되었습니다 Drp1의 이질성은 2,10을 중합체 및 어려움 정화 및 손상되지 횡단 도메인 (11)와 함께 전체 길이 MFF를 재구성. 우리는 막 횡단 도메인 (MffΔTM-그의 6) 부족 그의-태그 MFF를 재구성 NTA 니켈 (Ni 2+) 비계 리포좀을 사용하여 이러한 문제를 해결. E의 과발현 때 MffΔTM 매우 수용성이기 때문에이 전략은 유리했다. 콜라이,이 절연 단백질 용이 골격 리포좀에 재구성 하였다. 이러한 지질 템플릿에 닿는 경우, MFF는 멤브레인의 표면 상에 동일한 외측으로 향하는 방향을 가정한다.이러한 장점 등 리핀 등 미토콘드리아 지질 이외에, 멤브레인 (11) MFF 폴딩 및 결합을 안정화 하였다. 카디오 리핀은이 무질서 지역을 안정시키고 분열 기계의 조립을 용이하게 할 수 Drp1 2,12의 가변 도메인과 상호 작용한다. 이 방법은 강력한 막 - 근위 단백질 상호 작용을 평가하고자 미래 연구에 널리 적용 할 수있다. 추가의 테 더링 / 친 화성 상호 작용을 사용하여,이 막 재구성 연구 정교한 세포 내 멤브레인의 표면에서 발견 된 추가 복잡도를 모방하도록 향상 될 수있다. 동시에, 지질 조성물을보다 정확하게 이러한 고분자 복합체의 기본 환경을 모방하도록 수정 될 수있다. 요약하면, 이러한 방법은 중요한 세포 PROC시에 막 모폴로지 형성에 상대적 기여도 단백질과 지질을 검사하는 방법을 제공한다esses.

<table><tbody><tr><td>포스파티딜콜린(DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylethanolamine(DOPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>DGS-NTA(Ni2+)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Heart Cardiolipin (CL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840012</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>268320010</tr><tr><td>리포좀 압출기</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Cu/Rh 네거티브 스테인 그리드</td><td>Ted Pella</td><td>79712</td><td></td></tr><tr><td>마이크로퓨지 튜브</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1012</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3509</td><td></td></tr><tr><td>마이크로타이터 플레이트 스트립</td><td>Thermo Scientific</td><td>469949</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Acros Organics</td><td>40993-0010</td><td></td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie Dye</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>Acros 유기물</td><td>223211000</td><td></td></tr><tr><td>4 - 20% SDS-PAGE 젤</td><td>바이오 라드</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli 로딩 염료</td><td>바이오 라드</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>공작석 그린 카르비놀</td><td>시그마 알드리치</td><td>229105</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 몰리브덴셜 테트라하이드레이트</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>실험실 필름</td><td>파라필름</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이</td>트 <td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai T12 100keV 현미경</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 로터</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장 CentriVap Concentrator</td><td>Labconico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VersaMax Microplate reader</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

시험관 내에서 세포막 단백질 연구가 많이 소수성 막 횡단 도메인의 존재에 의해 복잡하게된다. 또한 이러한 연구를 복잡하게, 리포좀에 세제 - 가용화 된 막 단백질의 reincorporation 단백질 토폴로지를 적용하는 것은 불가능 확률 과정이다. 본 논문은 리포좀 기반의 발판을 이용하여 이러한 도전적인 기술에 대한 대체 방법을 제공합니다. 단백질의 용해성은 경막 도메인의 결실에 의해 강화되며, 이러한 아미노산 같은 그의 태그 같은 더링 잔기로 대체된다. 이것은 테더가 리포솜의 표면에 균일 한 단백질 토폴로지를 적용 (니트릴 로트리 아세트산 그의 태그 된 단백질 (NTA (니켈 2+))에 의해 조정 니켈 2+) 앵커링 그룹과 상호 작용한다. 필수 막 단백질 미토콘드리아 분열 인자 (MFF)와 Dynamin 관련 단백질 1 (Drp1) 사이의 상호 작용이 INVE이었다 상기 예가 제시이 골격 리포솜 법을 이용 stigated. 이 작품에서 우리는 효율적으로는 GTPase 활동을 자극 리포좀의 표면에 용해 Drp1을 모집 MFF의 능력을 증명하고있다. 또한 Drp1 특정 지질의 존재 MFF 장식 지질 템플릿 관 모양 할 수 있었다. 이 예는 구조 및 기능 분석을 사용하여 골격 리포좀의 효과를 보여주고 Drp1 활성을 조절하는데 MFF의 역할을 강조한다.

MFF Drp1과의 상호 작용은 미토콘드리아 분열에 중요한 것으로 입증되었지만, 이러한 상호 작용은 시험 관내에서 요점을 되풀이하기 어려웠다. 우리의 목표는 더 나은 Drp1과 MFF 상호 작용에있어서, 상기 세포 환경을 에뮬레이션하는 것이 었습니다. 이를 위해 리포좀 NTA (니켈 2+) headgroups의 제한 농도를 함유하는 전술 한 바와 같이 지질 막을 재수 화하여 제조 하였다. 용액 (도 1a)의 불투명도에 의해 입증 지질 용액은 초기 이종 직경의 단일 층 및 다중 층 소포로 구성된다. 이 불투명도는 다중 층 소포의 유병률을 감소 동결 해동 (그림 1b)에 의해 감소된다. 리포솜 직경은 상기 투명 용액 (도 1C)을 초래 폴리 카보네이트 필터를 통해 압출하여 균질화한다. <p class="jove_content" fo:keep...

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

이 기술의 전반적인 목표는 in vitro에서 지질-근위 단백질-단백질 상호 작용을 캡처하는 것입니다. 이 방법은 미토콘드리아 외막의 단백질-단백질 상호 작용이 부속 지질에 의해 어떻게 영향을 받을 수 있는지와 같은 미토콘드리아 역학 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 용해성 단백질 도메인을 지질 주형에 테더링하면 보다 많은 네이티브 확인을 달성할 수 있다는 것입니다.또한, 용해성 단백질과 테더링된 파트너 간의 복잡한 상호 작용은 정의된 지질 보조인자의 존재 하에서 평가될 수 있습니다. 우리는 이 방법을 사용하여 미토콘드리아 핵분열 기계에서 단백질 상호 작용을 조사하지만 다양한 막 구획에 국한된 다른 단백질 복합체에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Ryan입니다.먼저, 깨끗한 유리 시험관에 원하는 지질의 클로로포름 용액을 결합합니다. 튜브를 회전시키면서 건조 질소 가스로 용매를 증발시켜 얇은 지질막을 형성합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 원심 증발기로 잔류 용매를 제거합니다.그런 다음 예열된 완충액 A를 첨가하여 1 내지 2 밀리몰의 최종 지질 농도를 제공합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하고 가끔 소용돌이를 일으켜 지질 혼합물을 완전히 재현탁시킵니다. 배양 후 지질 혼합물을 플라스틱 시험관에 옮기고 완전히 얼 때까지 약 30초 동안 튜브를 액체 질소에 넣습니다.그런 다음 완전히 해동될 때까지 섭씨 37도의 수조에 튜브를 1-2분 동안 넣습니다. 다음으로, 4개의 필터 지지대와 폴리카보네이트 필터를 버퍼 A에 담그고 제조업체의 지침에 따라 압출기를 조립하여 지질 압출기를 준비합니다. 균일한 크기 분포를 보장하기 위해 부드럽고 일정한 압력을 사용하여 필터를 통해 지질 용액을 21회 압출합니다.압출하는 동안 리포좀 크기 균질성을 보장하기 위해 느리고 일정한 압력을 사용하십시오. 1미크론 필터를 사용하면 이것이 덜 중요합니다. 그러나 필터 크기가 작을수록 더 명백한 이질성이 발생할 수 있습니다.압출된 리포좀을 섭씨 4도에서 보관합니다. His-tagged 미토콘드리아 핵분열 인자 또는 Mff를 버퍼 A 및 BME에서 실온에서 최소 15분 동안 스캐폴드 리포좀과 함께 배양합니다. Mff-free 대조군의 경우, GFP와 같은 His-tagged 대조군 단백질로 리포좀을 배양하여 노출된 니켈-NTA를 결합하고 차폐합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리가 맥스와 Annexin V - 복합 자석 구슬과 대상 지질 및 Annexin V - 구속력 phosphatidylserine의 합성 지질 vesicles를 사용하여 자사의 목표 지질과 단백질의 상호 작용을 테스트하려면. 대상 지질에 바인딩 단백질은 공동 정화 및 비즈에서 용출 후 분석하고 있습니다.

자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

여기, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 TIRFM를 사용하여 리포좀과 미세 유체 채널에 지원 이중층 사이에 하나의 SNARE 매개 융합 이벤트를 감지하는 프로토콜을 제시한다. 지질 용해성화물 분리를 동시에 검출 할 수있다. 리포좀의 크기, 지질 확산과 융합 기공 특성을 측정한다.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

여기 postfusion bilayer에이 막 단백질의 세제 무료 배달 대상 지질 bilayers와 fusogenic proteoliposomes에 막 단백질의 재구성 및 같은 proteoliposomes의 융합에 대 한 두 개의 초고속 프로토콜 선물이. 이러한 방법의 복잡 한 다중 구성 요소 막 시스템의 신속 하 고 쉽게 제어 조립이 있습니다.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

우리 제공 프로토콜 시험관에 마음과 나의 자기 조직 분석 오픈 챔버에 지원된 지질 bilayer에. 또한, 우리는 vivo에서 조건 반응 감 금에 의해 모방 PDMS microcompartments 지질 입은에 분석 결과 포함 하는 방법을 설명 합니다.

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

생물학적 막 융합은 특수 융합 단백질에 의해 촉매됩니다. 단백질의 fusogenic 특성을 측정하는 것은 지질 혼합 분석을 통해 달성될 수 있다. 우리는 재조합 Drosophila 아틀라를 정화하는 방법을 제시, ER의 상모 융합을 중재하는 단백질, 미리 형성 된 리포솜에 그것을 재구성, 융합 용량에 대한 테스트.

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 역학의 근본적인 중요한 정동성 반응입니다. 여기에 설명된 시험관 내 재통합 시스템은 막 테더링, 도킹, 혈전 및 모공 개방을 해결할 수 있는 미토콘드리아 내막 융합을 연구한다. 세포막 시스템을 탐구하는 이 접근의 다양성은 토론됩니다.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

이 프로토콜은 밀 무세포 시스템 및 리포좀을 사용하는 이중층 투석 방법에 의한 고품질 프로테올리포좀의 생산을 위한 효율적인 무세포 방법을 설명합니다. 이 방법은 막 단백질의 기능 분석, 약물 표적 스크리닝 및 항체 개발에 적합한 수단을 제공합니다.

막 단백질을 표적으로 하는 기능 분석 및 항체 개발을 위한 프로테올리포좀의 무세포 생산

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

이 기사에서는 상으로 분리된 거대 소포 내부의 세포골격 네트워크의 간단한 원팟 재구성을 소개합니다. 이 방법은 일반화되어 광범위한 생체 분자의 캡슐화 또는 제한에 적용될 수 있습니다.

시험관 내 상분리된 거대 단일층 소포(GUV) 내부 세포골격 네트워크의 재구성

학습하세요 비계 리포좀을 활용한 체외 지질 근위 단백질 상호작용 재구성 방법입니다. 이 기술은 미토콘드리아 분열 기계에서 보조 지질이 단백질 상호작용에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

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