비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

이 기술의 전반적인 목표는 in vitro에서 지질-근위 단백질-단백질 상호 작용을 캡처하는 것입니다. 이 방법은 미토콘드리아 외막의 단백질-단백질 상호 작용이 부속 지질에 의해 어떻게 영향을 받을 수 있는지와 같은 미토콘드리아 역학 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 용해성 단백질 도메인을 지질 주형에 테더링하면 보다 많은 네이티브 확인을 달성할 수 있다는 것입니다.

또한, 용해성 단백질과 테더링된 파트너 간의 복잡한 상호 작용은 정의된 지질 보조인자의 존재 하에서 평가될 수 있습니다. 우리는 이 방법을 사용하여 미토콘드리아 핵분열 기계에서 단백질 상호 작용을 조사하지만 다양한 막 구획에 국한된 다른 단백질 복합체에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Ryan입니다.

먼저, 깨끗한 유리 시험관에 원하는 지질의 클로로포름 용액을 결합합니다. 튜브를 회전시키면서 건조 질소 가스로 용매를 증발시켜 얇은 지질막을 형성합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 원심 증발기로 잔류 용매를 제거합니다.

그런 다음 예열된 완충액 A를 첨가하여 1 내지 2 밀리몰의 최종 지질 농도를 제공합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하고 가끔 소용돌이를 일으켜 지질 혼합물을 완전히 재현탁시킵니다. 배양 후 지질 혼합물을 플라스틱 시험관에 옮기고 완전히 얼 때까지 약 30초 동안 튜브를 액체 질소에 넣습니다.

그런 다음 완전히 해동될 때까지 섭씨 37도의 수조에 튜브를 1-2분 동안 넣습니다. 다음으로, 4개의 필터 지지대와 폴리카보네이트 필터를 버퍼 A에 담그고 제조업체의 지침에 따라 압출기를 조립하여 지질 압출기를 준비합니다. 균일한 크기 분포를 보장하기 위해 부드럽고 일정한 압력을 사용하여 필터를 통해 지질 용액을 21회 압출합니다.

압출하는 동안 리포좀 크기 균질성을 보장하기 위해 느리고 일정한 압력을 사용하십시오. 1미크론 필터를 사용하면 이것이 덜 중요합니다. 그러나 필터 크기가 작을수록 더 명백한 이질성이 발생할 수 있습니다.

압출된 리포좀을 섭씨 4도에서 보관합니다. His-tagged 미토콘드리아 핵분열 인자 또는 Mff를 버퍼 A 및 BME에서 실온에서 최소 15분 동안 스캐폴드 리포좀과 함께 배양합니다. Mff-free 대조군의 경우, GFP와 같은 His-tagged 대조군 단백질로 리포좀을 배양하여 노출된 니켈-NTA를 결합하고 차폐합니다.

리포좀 혼합물에 dynamin 관련 protein one 또는 Drp1을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 5마이크로리터의 샘플을 실험실 필름 시트로 옮기고 샘플 위에 탄소로 코팅된 구리-로듐 그리드를 놓습니다. 1 분 동안 배양 한 후 여과지로 여분의 액체를 제거하고 2 % 우라닐 아세테이트 한 방울을 넣으십시오.

1분 더 배양한 후 여과지로 과도한 얼룩을 제거하고 샘플을 그리드 상자로 옮깁니다. 다음 날, 투과 전자 현미경을 사용하여 18, 500에서 30, 000X 배율로 샘플을 이미지화하여 단백질 및 리포좀 형태학의 초구조적 변화를 관찰합니다. His-tagged Mff 및 Fis1을 스캐폴드 리포좀과 함께 실온에서 15분 동안 buffera A 및 BME에서 배양합니다.

Drp1을 추가하고 각 혼합물을 실온에서 추가로 15분 동안 배양합니다. 튜브를 섭씨 37도로 설정된 써모사이클러로 옮기고 GTP와 염화마그네슘을 첨가하여 반응을 시작합니다. 원하는 시점에서, 각 반응 혼합물 20마이크로리터를 5마이크로리터의 0.5몰 EDTA가 포함된 마이크로타이터 플레이트의 웰로 옮겨 마그네슘을 킬레이트화하고 반응을 중지합니다.

그런 다음 버퍼 A 및 BME에서 인산칼륨을 희석하여 결과를 보정하여 인산염 표준물질 세트를 준비합니다. 5마이크로리터의 0.5몰 EDTA가 들어 있는 웰에 각 표준물질 20마이크로리터를 추가합니다. 각 웰에 150마이크로리터의 공작석 녹색 시약을 추가합니다.

마지막으로, 각 추가 후 5분 후에 OD 650을 읽습니다. GTP는 산성 공작석 녹색 시약의 존재 하에서 천천히 가수분해됩니다. 따라서 이 시약은 신호 대 잡음을 최대화하기 위해 흡광도를 측정한 후 10분 이내에 모든 샘플 웰에 추가해야 합니다.

Drp1이 없는 경우, Mff도 GFP도 막 변형을 일으키지 않았습니다. 그리고 GFP로 장식된 농축 스캐폴드 리포좀 또는 ESL에 대해서는 특징이 없는 리포좀만 관찰되었습니다. 그러나 Drp1이 Mff로 장식된 ESL 템플릿에 추가되었을 때 리포좀의 리모델링이 분명했습니다.

Mff 강화 GTPase 활동으로 SL을 장식합니다. 반대로, 노출된 NTA 헤드 그룹이 His-tagged GFP로 차단되었을 때, 이 증강된 GTPase 활성이 절제되었습니다. SL에 대한 막관통 도메인이 없는 Fis1의 테더링도 Drp1의 GTPase 활성의 자극을 유도하지 못했습니다.

SL과 유사하게, Drp1에 SL/Cl을 첨가하면 GTPase 활성이 약간 자극되었는데, 이는 His-tagged Fis1 또는 GFP를 리포좀에 테더링함으로써 역전되었습니다. Mff로 장식된 SL/CL과 함께 배양했을 때 Drp1의 GTPase 활성이 2.6배 자극됨에 따라 Mff와 카디올리핀 간의 시너지 효과가 관찰되었습니다. SL/PE/CL 템플릿이 Mff로 데코레이팅되었을 때 Drp1 활성이 향상되었습니다.

리포좀을 지세관으로 리모델링하는 Drp1의 능력은 골격 리포좀에 PE를 추가함으로써 향상되었습니다. 일단 숙달되면 절차가 제대로 수행되면 이러한 골격을 준비하고 몇 시간 안에 사용할 수 있습니다. 이 절차에 따라 기능적 상호 작용을 특성화하기 위해 침전 및 광 산란 분석과 같은 다른 단백질 및 지질 상호 작용 방법을 수행할 수 있습니다.

이 기술의 적용을 통해 정의된 생물학적 막으로의 단백질 전좌를 검사하는 사람들은 일시적인 단백질 상호 작용과 필수 세포 어셈블리의 형성 및 안정화에 대한 특정 지질 보조 인자의 영향을 탐구할 수 있습니다.