3D 전체 심장 심근 조직 분석

내레이터}이 프로토콜의 전반적인 목표는 경색 경계 영역에 대한 심근 주사의 표적 정확도를 평가하는 데 사용할 수 있는 3D 전체 심장 조직 처리를 위한 구조화되고 재현 가능한 방법을 촉진하는 것입니다. 이 방법은 실습 개발 및 주사 기술의 최적화와 같은 심장 재생 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 3D 전체 심장 조직 처리를 위한 표준화되고 재현 가능한 방법을 제공한다는 것입니다.

이 기술의 의미는 심장 재생 요법의 개발 및 정상 전달 기술의 주입 정확도 검증으로 확장됩니다. 이 심장 줄기 세포 요법의 목적은 국소 혈관 형성을 자극하고 심근세포 보호를 위해 경색 경계 영역에 세포를 주입하는 것입니다. 이완기 말기에 심장을 사로잡으려면 연습과 인내가 필요합니다.

이러한 단계를 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 먼저 마이크로비드가 주입된 심장에서 심낭을 분리하여 심방과 심실을 그대로 유지합니다. 모든 조직이 제거되면 클링켄베르크 가위를 사용하여 대동맥 판막 약 1cm 위의 상행 대동맥을 절개하고 심방에서 약 1cm 떨어진 하강 및 폐 정맥을 절단합니다.

부유를 방지하기 위해 심장의 정점을 플라스틱 매립 용기의 바닥에 고정한 후 대동맥의 나머지 부분을 통해 용기 가장자리까지 2-0 봉합사를 놓고 심장을 고정합니다. 심장이 중앙에 있고 용기의 벽에 닿지 않도록 주의하십시오. 장기가 기하학처럼 이완기 끝에 고정되면 모기 클램프를 사용하여 하부 기공 정맥을 잡고 50ml 주사기를 사용하여 우심방과 심실이 완전히 채워질 때까지 상기정맥을 통해 우심방에 새로 준비한 섭씨 50-60도의 한천을 천천히 주입합니다.

말단 이완기 기하학을 닮은 내포된 심장을 가능한 한 가깝게 얻으려면 좌심실 정점을 용기 바닥에 고정하고 폐정맥을 고정한 상태에서 우심실을 한천으로 채웁니다. 다음으로, 폐정맥에 모기 클램프를 놓고 대동맥 판막을 통해 역행 방향으로 채워진 새 한천을 부드럽게 통과시킵니다. 심실과 좌심방이 완전히 찰 때까지 용액을 좌심실에 천천히 주입하고 좌심실이 채워지면 대동맥을 조입니다.

이제 심장이 완전히 덮일 때까지 남은 한천을 용기에 붓고 매립 용기 내에 두 개의 단단한 플라스틱 튜브를 배치하여 이미지 등록 중에 참조 구조로 사용합니다. 그런 다음 심장을 섭씨 2도에서 7도에 최소 4시간 동안 놓아 한천을 굳힙니다. 자기 공명 영상 후 용기를 거꾸로 뒤집고 한천과 용기 측면 사이에 공기가 흐르도록 하여 용기에서 고체 한천 용액과 심장을 제거합니다.

플라스틱 막대를 제거합니다. 그런 다음 고기 슬라이서를 사용하여 한천 블록과 심장을 심장 정점에서 심장 기저부까지 5mm 조각으로 절단하고 한천 블록의 바닥과 평행하게 절단하여 조각의 각도를 획득한 자기 공명 이미지에서와 동일하게 유지합니다. 모든 슬라이스를 얻었으면 TTC에서 조직 샘플을 염색합니다.

15분 후 수직으로 양쪽 슬라이스를 촬영한 다음 0.9% 식염수로 섹션을 조심스럽게 헹굽니다. 형광 현미경 검사로 샘플을 이미지화하려면 가변 모드 스캐너에서 형광 모드 이미징을 선택하고 픽셀 크기를 100 x 100 미크론으로 설정합니다. 첫 번째 필터 블록의 경우, 채널 1에서 비드 형광의 방출 파장과 겹치는 대역 통과 필터를 선택한 다음, 채널 2에서 방출 파장 밖에 있는 두 번째 필터 블록에 대해 대역 통과 필터를 선택합니다.

다음으로, 적절한 필터 블록을 선택하고, 광전자 증배관을 적절한 전압으로 설정하고, 여기 레이저를 주입된 마이크로비드의 여기 파장에 가장 가까운 여기 파장으로 설정합니다. 모든 이미지를 얻은 후 적절한 후처리 소프트웨어에서 자기 공명 이미지에서 심근 및 심내막 및 심외 좌심실 경계를 분할한 다음 형광 이미지에서 심근 및 주사 부위를 유사하게 분할합니다. 그런 다음 슬라이스의 양쪽에서 이미지에 등록된 세그먼트를 선형으로 보간하여 원래 샘플 두께를 재구성하고 데이터의 3D 모델을 만듭니다.

방금 시연된 바와 같이 심장이 기하학과 같은 이완기 끝에 고정된 상태에서 이 대표적인 실험에서 한천은 심장 조직에 성공적으로 부착되어 동일한 절편 두께로 원하는 각도로 조직을 절단할 수 있었습니다. 2D 형광 및 자기 공명 이미지 모두에서 흉터와 주사 부위가 명확하게 구분됩니다. TTC 염색 조직 및 후기 가돌리늄 강화 자기 공명 영상은 형광 영상에서 흉터 평가를 위한 제어를 제공합니다.

후처리 이미징을 통해 분할 및 형광 이미지를 기반으로 생체 외 심장의 3D 형상을 재구성할 수 있으므로 3D 주입 정확도를 평가할 수 있습니다. 이 연구에서는 주사 침착물과 경색 경계 영역을 심내막벽으로 보호하고 심내막 표면의 돌출부 사이의 거리를 측정했습니다. 이 절차에 따라 외과적 평가, 경색 크기 정량화 또는 다른 3차원 이미징 양식의 검증과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

우리는 이 기술을 사용하여 경색 경계 영역으로의 주입 정확도를 평가했습니다. 본 연구는 심부전증에 대한 심폐재생요법을 개선하기 위해 수행되었다. 이 비디오를 시청한 후에는 심장을 준비하는 방법, 심장 조직을 삽입하고 처리하는 방법, 심장 조직 샘플의 형광 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.