Name: 양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초, Dermestes maculatus (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 배우세요 Dermestes maculatus의 유전자 기능 연구를 위한 배양 및 RNA 간섭 기법을 활용한 방법입니다. 이 기술은 발달생물학 및 해충 방제 연구에 활용될 수 있습니다.

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미세 주입 장치를 설치하고 곤충 RNAi에 대한 귀중한 지식과 경험을 공유해 주신 Alison Heffer 박사와 Yong Lu 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 지원을 받았습니다(R01GM113230 to L.P.).

저자는 공개할 것이 없습니다.

정교한 모델 시스템 (마우스, 날아 벌레)의 소수는 20 세기 동안 개발 동안, 21 세기 새로운 동물 시스템의 물결이 전 세계에 걸쳐 연구실에서 개발중인 보았다. 이 새로운 시스템은 과학자 만 &#39;표준&#39;모델 시스템을 사용하여 탐색 할 수 없습니다 비교, 진화의 문제를 해결 할 수 있습니다. 새로운 모델이 배포 실험실 배양, 유전자 식별 및 새로운 종의 기능적 접근 방법의 급속한 발전이 필요합니다. 여기에서, 실험실 및 배아의 RNAi, 부모의 RNAi,이 딱정벌레의 표현형 분석을위한 단계별 프로토콜에 D. maculatus를 양육하기위한 절차를 제시 하였다. 목표는 이러한 설명은 자신의 실험에서 D. maculatus을 사용하고 추가로 새로운 모델 종을 개발하기 위해 여기에 제시된 방법을 사용하기 위해 다른 사람을 격려한다는 것입니다. D. maculatus 리터 동안AB 식...

1998 년 화재와 멜로는 이중 가닥 RNA (dsRNA를이) 예쁜 꼬마 선충 1 유전자 기능의 억제를 유도 할 수 있다고보고했다. dsRNA에 의해 유발이 반응은 RNA 간섭 (RNAi의) 명명하고, 이러한 RNAi를 매개 된 유전자 사일런 싱은 동물, 식물, 균류 및 2-7에서 보존되는 것으로보고되었다. 일부 식물 및 동물에서의 RNAi 기능 전신적 의미 효과 (8-10에서 검토) dsRNA를 직접 도입되지 않은 다른 세포 / 조직으로 확산 될 수있다. 과학자하여 직접 (11-14에서 검토) 게놈을 조작없이 유전자 기능을 쓰러 뜨린, 관심의 유전자를 대상으로 dsRNA에를 설계하여이 내생 세포의 RNAi 응답의 사용을 만들었습니다. RNAi의는 다음과 같은 장점으로 인해 기능 연구를위한 강력한 도구입니다. 먼저도 최소한의 유전자 서열 정보하는 유전자의 RNAi를 사용하여 타겟팅 될 수있다. 이 일에 특히 중요하다게놈 또는 transcriptomic 데이터가없는 비 모델 생물의 udies. 둘째, RNAi의 응답이 견고 전신 인 유기체에서 RNAi를 매개하는 유전자 녹다운 거의 모든 발육 단계에서 수행 될 수있다. 이 기능은다면 발현 유전자의 기능을 연구하는데 매우 유용하다. 셋째, 어떤 경우에는, RNAi의 효과 표현형 자손 15,16 관찰되도록 상기 생식선 및 자손에 퍼졌다. 단일 주입 부모에 의해 생성 된 수많은 자손 계란을 직접 조작하지 않고 검사 할 수있는 부모의 RNAi (pRNAi)로 알려진이 현상은,,, 배아 발달에 영향을 미치는 유전자에 특히 유리하다. 이러한 이유로, pRNAi는 선택의 방법입니다. pRNAi 비효율적 인 경우, oogenesis 필요한 유전자, 예를 들어 다음의 RNAi 배아 (eRNAi)이 사용되어야한다. 넷째, RNAi의 강력한 결함 약한 생산하는 dsRNA의 양은 범위에 걸쳐 변화 될 수있는 전달하는 대립 시리즈의 등가를 생성하는데 사용될 수있다. 표현형 그러한 계조 유전자가 치명적인 복잡한 프로세스 및 / 또는 기능을 완전히 상실 포함될 때 유전자 기능을 이해하는데 도움이 될 수있다. 다섯째, dsRNA를 전달 특히 강력한 조직의 RNAi 반응을 나타내는 동물, 일반적으로 쉽게 가능하다. dsRNA를이 미세 주입 1,5, 공급 / 섭취 17, 18, 침지, 19, 20 및 바이러스 / 박테리아 매개 배달 (21, 22)에 의해 도입 될 수있다. 여섯째, 일부 유전자 타겟팅 / 편집 방법과 달리, 돌연변이를 운반 생물을 선별하거나 RNAi의 사용시 동형 접합체를 생성하기 위해 유전 교배를 실시 할 필요가 없다. 따라서, 유전자 기능을 연구하기위한 다양한 다른 기술에 비해 저렴 RNAi를 빠르게하고, 대형 화면 (23-25)에 적용될 수있다. 의 RNAi의 다양한 유틸리티 beyon 연구 가능한 종의 범위를 확대하고, 생물의 광범위한 기능적 연구를 수행하는 방법을 제공한다유전 적 도구가 개발되어있는 기존의 모델 시스템 거라고. 예를 들어, 비 - 모델 시스템을 사용하여 연구가 다른 개발 모드를 표시하거나 별개의 형태 적 특징 26-29을 나타내는 종 orthologs의 기능을 비교하여 유전자 및 유전자 네트워크의 발전에 대한 통찰력을 제공해야한다. 연구 이러한 유형의 응용 및 기본적인 두 연구의 영향이 생물학적 다양성의 더 나은 이해를 제공 할 것이다. 지구상에서 가장 큰 동물 그룹이기 때문에, 곤충 메커니즘을 기본 다양성을 탐험 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다. 또한, 곤충은 일반적으로 작고 짧은 수명주기, 높은 생산력을 가지고 있고, 실험실에서 뒤쪽으로 쉽습니다. 지난 20 년에, RNAi의 성공적 파리목 (사실 파리) 5, 나비목 (나비와 나방) (30)를 포함하여 주문에 걸쳐 곤충 적용되어, 딱정벌레 목 (딱정벌레) 16,31, 벌목 (sawf거짓말, 말벌, 개미와 꿀벌) (32), 매미목 (사실 버그), Isoptera (흰개미) (34), Blattodea (바퀴벌레) (35), 메뚜기 (귀뚜라미, 메뚜기, 메뚜기, 그리고 katydids) 36 Phthiraptera (이가) 37. RNAi를 성공적으로 응용 프로그램, 에크 디손 (42) 신호, 초기 배아에서 패턴의 연구 기능 데이터 (전후방 축 (32), 지느러미 - 복부 축 (28), 세그멘테이션 26,38), 성별 결정 39, 40, 키틴 / 표피의 생합성 (41)를 제공하고있다 사회적 행동 (43), 그리고 더. 다른 곤충 종 개발의 RNAi 방법은 (44-46 검토) 방제에 유용 할 가능성이 있다는 점에서 추가적인 이점이 될 수있다. RNAi의 효과는 비 보존 지역을 타겟팅 선택되는만큼, 유전자 특이뿐만 아니라 종 특이 할 것이다. 의 생존을위한 필수적인 유전자를 대상으로 꿀벌과 누에와 같은 유익한 곤충 종에 대한감염을 제어하는 바이러스 또는 기생충이 종 (47, 48)을 보호하기위한 새로운 전략을 제공 할 수있다. Dermestes maculatus (D. maculatus), 일반 이름 숨기기 딱정벌레, 남극 대륙을 제외하고 전 세계적으로 배포됩니다. holometabolous 곤충으로, D. maculatus 수명주기는 배아, 애벌레, 번데기 및 성인 단계 (그림 1)을 포함한다. 그것은 육체에 공급하기 때문에, D. maculatus는 죽은 동물을 해골로하는 박물관으로 사용되며, 법의학 곤충 학자 죽음 49,50의 시간을 예상하는 데 사용할 수 있습니다. D. maculatus는 시체, 말린 고기, 치즈, 그리고 번데기 / 다른 곤충의 고치를 포함한 동물 제품을 공급함으로써 가정의 손상, 저장 음식, 그리고 실크, 치즈, 육류 산업 51,52됩니다. 이 딱정벌레에서의 RNAi를 적용하면 경제에 미치는 영향을 최소화하기 위해 효율적이고 환경 친화적 인 방법을 제공 할 수있다. 우리 연구소는 새로운 m로 D. maculatus을 사용하고있다ODEL 곤충 세그먼트 (53)를 연구한다. 그것은 단기 및 장기 생식 개발 사이의 전환을 공부하고 그것에게 유용한 종을, 중간 - 생식 개발자로 실험실 양육 의무가있을뿐 아니라, D. maculatus는 기초 연구에 대한 관심이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg"> 그림 1 : D. maculatus의 수명주기. 나타낸 바와 같이, 서로 다른 삶의 단계에서 D. maculatus의 사진. 성인에 계란에서 라이프 사이클은 낮은 온도에서 세 30 ° C에서 주하지만 더 오래 걸립니다. (A, F) 갓 배치 배아의 길이는 약 1.5 mm, 밝은 노란색 타원형에 흰색입니다. 배아는 ~ 30 ° C에서 55 시간이 걸립니다. (B, C와 G) 애벌레 어두운 색소 줄무늬가 있고 강모로 덮여있다. 애벌레는 1 이상 cm까지 확장 할 수있는 환경과 길이에 따라 여러 령충을 통해 이동합니다. (D, H) (E, I)는, 어두운 색소 침착은 성인 딱정벌레 몸에 나타납니다. 성인은 몇 개월까지 살 수있는 한 여성은 그녀의 일생을 통해 배아의 수백을 배치 할 수 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 이전에, 우리는 RNAi의는 D. maculatus (53)에 유전자 기능을 쓰러 뜨린에 효과가 있음을 보여 주었다. 다음은 실험실에서 D. maculatus 식민지를 양육 경험은 배아와 부모 모두 RNAi의 설정, 사출, 포스트 분사 관리 및 표현형 분석을위한 단계별 프로토콜과 함께 공유됩니다. 여기에 소개 된 dsRNA를 매개 유전자 최저 및 분석 방법 D. maculatus에 문제를 해결에 대한 자세한 정보를 제공 할뿐만 아니라, FO 잠재적 인 의미가 아니라R 아닌 다른 모델 딱정벌레 / 곤충 종의 RNAi를 적용.

<table><tbody><tr><td>Dermestes maculatus 살아있는 딱정벌레</td><td>우리 실험실 또는 Carolina Biological Supply</td><td>#144168</td><td>우리 실험실 균주는 COI 바코드로 확인되었습니다. 캐롤라이나의 균주 변동을 배제할 수 없습니다</td></tr><tr><td>젖은 고양이 사료</td><td>Fancy Feast</td><td></td><td>그레이비를 곁들인 고기 덩어리. 대부분의 애완 동물 사료 및 식료품 점에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>건조 개 사료</td><td>Purina Puppy Chow</td><td></td><td>대부분의 애완 동물 사료 및 식료품 점에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>곤충 케이지 (중 크기, 30.5 x 19 x 20.3cm)</td> <td>Exo Terra</td><td>PT2260</td><td>식민지 유지 보수용. 필요한 경우 더 큰 케이지를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>곤충 케이지 (미니 크기, 17.8 x 10.2 x 12.7cm)</td> <td>Exo Terra</td><td>PT2250</td><td>배아 수집</td></tr><tr><td>용 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td>Fisher</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 전사 키트</td><td>Fisher</td><td>AM1334</td><td>40 회 반응</td></tr><tr><td>용 공압 펌프</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>모세관 홀더</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>NARISHIGE</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>검정 여과지 (90&nbsp; mm)</td><td>VWR</td><td>28342-010</td><td></td></tr><tr><td>식용 색소(녹색)</td><td>McCormick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>Hilgenberg</td><td>1406119</td><td></td></tr><tr><td>니들 풀러(마이크로피펫 풀러)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>현미경 유리 슬라이드</td><td>WorldWide Life Sciences Division</td><td>41351157</td><td></td></tr><tr><td>밀봉 필름 (Parafilm M)</td><td>Fisher</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>모델 801 주사기 (10&nbsp; &마이크로; l)</td><td>Hamilton</td><td>7642-01</td><td></td></tr><tr><td>바늘 (32게이지)&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>정착 솔루션(Pampel's)</td><td>BioQuip Products, Inc.</td><td>1184C</td><td>유독성, 흄 후드에서 취급해야</td></tr> 함 <tr><td>집게 (DUMONT #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5)</td><td>Globe Scientific</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader 피펫 팁</td><td>Fisher</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>배아 주입용 해부 현미경</td><td>Leica</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>유충 표현형 시각화를 위한 현미경 해부</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discover. V12</td><td></td></tr><tr><td>DIC 현미경 Zeiss</td><td></td><td>AXIO 이미저. 엠1</td><td></td></tr></tbody></table>

양육 및 숨기기 비틀에 rna 매개 유전자 최저를 두 번 좌초, dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

유전체학의 발전으로 전례 없는 규모로 생물 다양성을 조사할 수 있는 가능성이 높아졌습니다. 그러나 염기서열만으로는 유전자 기능을 연구할 수 있는 도구 없이는 정보를 얻을 수 없습니다. 따라서 실험실에서 새로운 모델 시스템을 구축하고 기능 연구를 수행하기 위한 도구를 위한 세부 프로토콜의 개발 및 공유는 유전체학의 힘을 활용하는 데 매우 중요합니다. 딱정벌레목(딱정벌레)은 곤충의 가장 큰 군집이며 지구상의 거의 모든 유형의 서식지를 차지합니다. 기초 연구를 위한 이상적인 모델을 제공하는 것 외에도 딱정벌레에 대한 연구는 종종 가정, 농업 및 식품 산업의 해충이기 때문에 해충 방제에 영향을 미칠 수 있습니다. D. maculatus 실험실 군체의 사육 및 유지 관리와 D. maculatus에서 dsRNA 매개 간섭을 수행하기 위한 자세한 프로토콜이 제시됩니다. 장치 설정, 준비, 주입 및 주입 후 회복을 포함한 배아 및 부모 RNAi 절차가 모두 설명됩니다. 또한 생존력, 부화한 유충의 패턴 결함, 부화하지 않은 유충에 대한 큐티클 준비를 포함한 배아 표현형을 분석하기 위한 방법도 제시됩니다. 이러한 분석은 분자 마커에 대한 현장 혼성화 및 면역 염색과 함께 D. maculatus를 기초 및 응용 연구를 위한 접근 가능한 모델 시스템으로 만듭니다. 또한 다른 새로운 곤충 모델 시스템에서 절차를 수립하는 데 유용한 정보를 제공합니다.

저자의 실험실은 곤충 53, 55의 분할을 조절하는 유전자의 기능 진화를 연구하는 RNAi의 기술을 사용하고있다. 모든 곤충이 분할되어 있지만, 이러한 과정을 조절하는 유전자를 곤충 방사선 26,38,56-63 동안 갈라 것으로 보인다. 초파리 유전자 스크린 바디 세그먼트 64-70의 형성을 촉진하는 책임 아홉 쌍 룰 분할 유전자 세트를 식별. 여기서, 이들 유전자 중 하나의 ortholog, 쌍 (PRD)은, D. maculatus에서 유전자 기능을 연구하기위한 RNAi에의 유용성을 문서화하는 데 사용됩니다. 이 종에서 세그먼트 형성 PRD - eRNAi 및 pRNAi 각 DMAC의 역할을 보여주는에 효과...

여기, 우리는 실험실에서 중간 - 세균 딱정벌레, Dermestes maculatus (D. maculatus)를 양육하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한이 종에서 유전자 기능을 연구하기 위해 배아 표현형을 분석 배아 및 부모의 RNAi를위한 프로토콜과 방법을 공유 할 수 있습니다.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 딱정벌레 군을 나타내는 새로운 곤충 모델 시스템인 Dermestes maculatus의 유전자 기능을 탐색하고 기본 및 응용 연구 질문의 연구를 용이하게 하는 것입니다. 이 방법은 Dermestes 배아와 성인의 유전자 기능을 테스트할 수 있도록 함으로써 발달 생물학, 진화 생물학 및 그 이상의 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전체 게놈 염기서열이 없는 경우에도 염기서열 정보만을 기반으로 모든 유전자를 표적으로 삼는 데 RNA 간섭을 사용할 수 있다는 것입니다.여기에 소개된 방법은 Dermestes의 유전자 기능을 연구하는 접근 방식을 제공할 뿐만 아니라. 또한 새로운 곤충 모델 시스템을 개발하고 잠재적으로 해충을 통제하는 데 적용할 수 있습니다. D.maculatus를 위한 사육 케이지를 준비하려면 먼저 중간 크기의 곤충 케이지에 나무 부스러기를 얇게 펴십시오.스티로폼 한 부분을 케이지에 넣어 유충이 번데기가 될 수 있는 환경을 제공합니다. 20-50마리의 성충 딱정벌레 또는 늦은 instar 유충을 케이지에 추가합니다. 젖은 고양이 사료를 페트리 접시나 계량 보트에 넣어 사료 공급원으로 사용하십시오.케이지를 메쉬 천으로 덮고 인큐베이터에 넣습니다. 배아 채취를 시작하기 전에 먼저 케이지에 배아가 있는지 주의 깊게 확인하고 배아를 제거하십시오. 케이지가 깨끗해지면 늘어난 솜뭉치를 케이지에 넣고 섭씨 30도에서 군체를 배양합니다.적절한 시간이 지나면 솜뭉치를 모으고 그 자리에 있는 성인을 모두 꺼내 우리에 다시 넣습니다. 검은색 공사용 종이 위에 면봉을 부드럽게 꼬집고 얇은 필라멘트로 천천히 찢어 계란이 검은색 종이 위에 떨어지도록 합니다. 표준 페트리 접시 뚜껑을 가져 와서 검은 색 여과지를 사용하여 내부를 덮습니다.표준 현미경 슬라이드의 가장자리를 따라 양면 테이프 조각을 붙입니다. 페트리 접시 뚜껑의 검은색 여과지 위에 현미경 슬라이드를 놓습니다. 수집된 배아가 들어 있는 종이를 잡고 부드럽게 두드려 배아를 페트리 접시 뚜껑으로 옮깁니다.붓을 사용하여 테이프의 배아를 슬라이드에 수직으로 정렬하고 앞쪽 또는 뒤쪽 끝이 가장자리를 향하도록 정렬합니다. RNAi를 시작하려면 먼저 2-4마이크로리터의 dsRNA를 20마이크로리터 마이크로 로더 피펫 팁에 넣습니다. 바늘이라고 하는 미리 당겨진 유리 모세관에 팁을 삽입하고 용액을 바늘에 부드럽게 피펫으로 넣습니다.바늘을 유리 모세관 홀더에 고정한 다음 모세관 홀더를 마이크로 매니퓰레이터에 조립합니다. 다음으로, 배아가 부착된 슬라이드를 해부 현미경의 스테이지에 조심스럽게 옮깁니다. 슬라이드를 움직여 하나의 배아를 필드의 중앙으로 가져오고 현미경의 초점을 맞춥니다.해부 범위를 살펴보면서 마이크로 매니퓰레이터로 모세관 끝을 배치합니다. 끝을 줄의 첫 번째 배아 끝에 가깝게 가져옵니다. 질소 또는 공기 공급 장치를 켠 다음 솔레노이드 입력 선택 스위치를 진공으로 설정합니다.장치에 따라 배출 압력 조절기를 10-15psi로 조정합니다. 모세관을 열면 착색된 dsRNA 용액이 팁을 채우고 주입할 준비가 됩니다. 모세관 끝을 앞으로 움직여 배아에 부드럽게 구멍을 뚫습니다.이상적인 압력 설정에서는 배아 유체가 모세관으로 흐르지 않습니다. 풋 스위치를 밟아 적절한 양이 분배될 때까지 dsRNA를 배아로 배출합니다. 팁을 배아 내부에 약 2초 동안 그대로 두었다가 조심스럽게 제거합니다.모든 배아가 주입되면 슬라이드를 페트리 접시에 넣습니다. 젖은 면봉을 접시에 넣고 슬라이드에 닿지 않도록 주의하십시오. 페트리 접시를 덮고 밀봉 필름으로 감쌉니다.주입된 배아의 dsRNA 유형, 농도, 날짜, 시간 및 개수를 표시합니다. 마지막으로, 배아가 부화할 때까지 접시를 섭씨 30도의 인큐베이터에 넣습니다. pRNAi를 수행하려면 먼저 군체에서 번데기를 수집합니다.수컷과 암컷 번데기를 두 개의 접시로 분류하고 섭씨 30도의 부화기에 넣습니다. 밀폐된 딱정벌레가 있는지 매일 접시를 확인하고 이 개체를 수컷과 암컷 성인을 위한 두 개의 별도 페트리 접시로 옮깁니다. 이 성인에게 먹이를 주고 주사를 시작할 수 있을 만큼 충분한 성인이 닫힐 때까지 격일로 접시를 유지하십시오.성체 풀이 완성되면 암컷 딱정벌레를 마취하고 한 손으로는 개별 복부 쪽을 위로 잡고 다른 손으로는 주사기를 잡습니다. 흉골 2와 3 사이의 segmacoria 막을 부드럽게 관통합니다. 주사기 저울을 확인하고 여성 1인당 약 2마이크로리터를 천천히 분주합니다.주사 후 바늘을 5초 이상 안정적으로 잡고 조심스럽게 빼냅니다. 주입된 암컷을 고양이 사료가 든 페트리 접시에 옮깁니다. 접시에 적절하게 레이블을 붙입니다.접시를 섭씨 30도의 인큐베이터에 넣습니다. 24시간 후, 주입된 암컷을 미니 케이지로 옮기고 주입되지 않은 어린 수컷과 동일한 수를 추가합니다. 케이지에 라벨을 붙이고 고양이 사료를 추가합니다.케이지를 섭씨 30도의 인큐베이터에 넣어 짝짓기를 허용합니다. 그 결과 생성된 자손을 검사하여 pRNAi의 효과를 확인할 수 있습니다. 이 이미지는 대조군으로 녹색 형광 단백질인 DS GFP를 주입한 pRNAi 개체의 자손을 보여줍니다.여기서, 야생형 개체와 마찬가지로, 자손은 분절당 하나의 색소 줄무늬로 부화했습니다. 인접한 착색된 줄무늬는 착색되지 않은 틈으로 분리되었습니다. 한 쌍의 pRNAi에 이어, 영향을 받은 자손은 융합된 이웃 색소 줄무늬로 부화하여 분절 경계에 결함이 있음을 나타냅니다.표현형 심각도는 가변적이었지만 융합은 특정 경계 영역에서 일관되게 나타나 결함과 같은 쌍 규칙을 나타냅니다. 유사하게, 쌍을 이룬 넉다운(knockdown) 후 부화하지 않은 배아의 큐티클 표현형은 복부 분절의 손실과 신체 길이 단축을 보여주었습니다. 분자 결함을 검사하기 위해 충혈된 항체로 초기 배아를 염색한 결과, 대조군 개체의 각 분절에서 동일한 강도의 발현 줄무늬가 나타났습니다.대조적으로, Dmac 쌍을 이룬 dsRNA를 주입한 암컷의 자손에서 대체 줄무늬에서 감소된 발현이 감지되었습니다. 이러한 발현 감소 패턴은 영향을 받은 부화한 유충에서 관찰된 결함 있는 표피 패턴과 일치합니다. 여기에서 우리는 처음으로 RNA 간섭을 사용하여 Dermestes maculatus의 초기 배아 발달 과정에서 관심 유전자를 녹다운하는 프로토콜을 제시합니다.이러한 절차를 시도하는 동안 적절한 단계에서 배아 또는 여성 성인을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 일단 숙달되면 약 100명의 배아 또는 10명의 성인 암컷을 30분 이내에 주입할 수 있습니다. 이 절차에 따라 유전자 조절 메커니즘에 대한 추가 질문에 답하기 위해 배아 염색 또는 정량적 PCR과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 Dermestes 실험실 군체를 설정하는 방법과 이 딱정벌레에서 배아 및 부모 RNA 간섭을 모두 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 현재 기능 연구에 사용할 수 있는 곤충 모델은 소수에 불과합니다. 여기에 제시된 기술은 연구자들이 Dermestes를 모델 시스템으로 사용하여 분자 유전 분석에 적합한 곤충의 범위를 확장할 수 있는 길을 열어줍니다.

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유전학

이 프로토콜에서 우리는 함께 RNAi - 중재 유전자 입을를...

RNAi - 중재 유전자 최저 및<em&gt; VIVO에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; 모기

이 프로토콜에서는, 우리는 동시에 꿀벌 두 개의 유전자 (더블 유전자 최저를) 억제 두 가지 전략에 대해 설명합니다. 그럼 우리는 꿀벌 미각 지각을 두 번 유전자 최저의 효과를 연구하는 코 확장 응답 (PER) 분석을 사용하는 방법을 제시한다.

꿀벌의 RNAi를 매개로 두 유전자 넉다운과 미각 지각 측정 (<em&gt; 아피스 mellifera</em&gt;)

dsRNA에는 C.에 공급하면서 엘레 대규모 공급 화면 현재 프로토콜이 변수 최저 효율 결과 유전자 기능을 평가하는 강력한 도구입니다. 우리는 유전자 발현의 높은 효능 및 재현성 넉다운 결과 대규모의 RNAi 수유 화면을 수행하기위한 개선 된 프로토콜을 설명한다.

대규모 유전자 넉다운에<em&gt; C. 엘레</em&gt; 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용

RNA 간섭 (RNAi의) 기반의 유전자 녹다운 기술은 Tribolium 연구의 핵심이다. 여기서 우리는 Tribolium의 castaneum 우리의 애벌레의 RNAi 기술에 대한 개요를 제공합니다. 애벌레의 RNAi 연구자들이 다양한 상황에서 유전자의 기능을 연구 할 수 있도록, 기능 상실 표현형에 대한 빠른 액세스를 제공하는 간단하지만 강력한 기술이다.

레드 밀가루 딱정벌레의 애벌레 RNA 간섭, Tribolium castaneum

여기서 우리는 유충 섭취 RNA 나노 입자 / 키토산의 사용을 통해 질병 벡터 모기 유전자 기능을 억제 간섭하는 절차를 설명한다.

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

RNA interference (RNAi)는 유전자 기능을 밝히는 데 매우 유용한 도구입니다. 그러나 성체 이전 단계에서 RNAi를 사용하여 유전자를 표적으로 하는 능력은 주요 인간 말라리아 매개체인 Anopheles gambiae에서 제한됩니다. 번데기 발달 중 직접 주입을 통해 유전자 기능을 감소시키는 RNAi 프로토콜에 대해 설명합니다.

에 RNAi의 트리거 배달<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt; 번데기

여기에서 우리는 크리켓 계란을 주입하는 프로토콜을 제시, 크리켓의 많은 실험에서 기초 방법 역할을하는 기술, 포함하되 이에 국한되지 않음, RNA 간섭 및 게놈 조작.

그릴루스 바이마쿨라투스 계란 주입

RNA 간섭은 특정 발달 단계에서 유전자 발현을 조작하기 위한 널리 적용가능하고 강력한 기술입니다. 여기서, 우리는 수중 다이빙 딱정벌레 Thermonectus marmoratus에서이 기술을 구현하기 위한 필요한 단계를 기술합니다, 구조 또는 행동에 영향을 미치는 유전자의 녹다운에 유전자 의 취득에서.

특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭

우리는 청색 꼬리 댐을 사용하여 주문 오도나타 (잠자리와 담석)의 곤충에 전기 포기 매개 RNA 간섭에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다(이쉬누라 세네갈렌시스: 코나그리니대 : 지고피테라) 및 파이드 스키머 드래곤 플라이(Pseudothems zonata:...

오도나타에서 전기 기화 매개 RNA 간섭 방법

여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

본 프로토콜은 P. americana에서 RNAi 조작 기술에 대한 단계별 지침을 설명합니다.

미국 바퀴벌레에 있는 RNA 간섭의 신청

배우세요 Dermestes maculatus의 유전자 기능 연구를 위한 배양 및 RNA 간섭 기법을 활용한 방법입니다. 이 기술은 발달생물학 및 해충 방제 연구에 활용될 수 있습니다.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초, Dermestes maculatus

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