양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초, Dermestes maculatus

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 딱정벌레 군을 나타내는 새로운 곤충 모델 시스템인 Dermestes maculatus의 유전자 기능을 탐색하고 기본 및 응용 연구 질문의 연구를 용이하게 하는 것입니다. 이 방법은 Dermestes 배아와 성인의 유전자 기능을 테스트할 수 있도록 함으로써 발달 생물학, 진화 생물학 및 그 이상의 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전체 게놈 염기서열이 없는 경우에도 염기서열 정보만을 기반으로 모든 유전자를 표적으로 삼는 데 RNA 간섭을 사용할 수 있다는 것입니다.

여기에 소개된 방법은 Dermestes의 유전자 기능을 연구하는 접근 방식을 제공할 뿐만 아니라. 또한 새로운 곤충 모델 시스템을 개발하고 잠재적으로 해충을 통제하는 데 적용할 수 있습니다. D.maculatus를 위한 사육 케이지를 준비하려면 먼저 중간 크기의 곤충 케이지에 나무 부스러기를 얇게 펴십시오.

스티로폼 한 부분을 케이지에 넣어 유충이 번데기가 될 수 있는 환경을 제공합니다. 20-50마리의 성충 딱정벌레 또는 늦은 instar 유충을 케이지에 추가합니다. 젖은 고양이 사료를 페트리 접시나 계량 보트에 넣어 사료 공급원으로 사용하십시오.

케이지를 메쉬 천으로 덮고 인큐베이터에 넣습니다. 배아 채취를 시작하기 전에 먼저 케이지에 배아가 있는지 주의 깊게 확인하고 배아를 제거하십시오. 케이지가 깨끗해지면 늘어난 솜뭉치를 케이지에 넣고 섭씨 30도에서 군체를 배양합니다.

적절한 시간이 지나면 솜뭉치를 모으고 그 자리에 있는 성인을 모두 꺼내 우리에 다시 넣습니다. 검은색 공사용 종이 위에 면봉을 부드럽게 꼬집고 얇은 필라멘트로 천천히 찢어 계란이 검은색 종이 위에 떨어지도록 합니다. 표준 페트리 접시 뚜껑을 가져 와서 검은 색 여과지를 사용하여 내부를 덮습니다.

표준 현미경 슬라이드의 가장자리를 따라 양면 테이프 조각을 붙입니다. 페트리 접시 뚜껑의 검은색 여과지 위에 현미경 슬라이드를 놓습니다. 수집된 배아가 들어 있는 종이를 잡고 부드럽게 두드려 배아를 페트리 접시 뚜껑으로 옮깁니다.

붓을 사용하여 테이프의 배아를 슬라이드에 수직으로 정렬하고 앞쪽 또는 뒤쪽 끝이 가장자리를 향하도록 정렬합니다. RNAi를 시작하려면 먼저 2-4마이크로리터의 dsRNA를 20마이크로리터 마이크로 로더 피펫 팁에 넣습니다. 바늘이라고 하는 미리 당겨진 유리 모세관에 팁을 삽입하고 용액을 바늘에 부드럽게 피펫으로 넣습니다.

바늘을 유리 모세관 홀더에 고정한 다음 모세관 홀더를 마이크로 매니퓰레이터에 조립합니다. 다음으로, 배아가 부착된 슬라이드를 해부 현미경의 스테이지에 조심스럽게 옮깁니다. 슬라이드를 움직여 하나의 배아를 필드의 중앙으로 가져오고 현미경의 초점을 맞춥니다.

해부 범위를 살펴보면서 마이크로 매니퓰레이터로 모세관 끝을 배치합니다. 끝을 줄의 첫 번째 배아 끝에 가깝게 가져옵니다. 질소 또는 공기 공급 장치를 켠 다음 솔레노이드 입력 선택 스위치를 진공으로 설정합니다.

장치에 따라 배출 압력 조절기를 10-15psi로 조정합니다. 모세관을 열면 착색된 dsRNA 용액이 팁을 채우고 주입할 준비가 됩니다. 모세관 끝을 앞으로 움직여 배아에 부드럽게 구멍을 뚫습니다.

이상적인 압력 설정에서는 배아 유체가 모세관으로 흐르지 않습니다. 풋 스위치를 밟아 적절한 양이 분배될 때까지 dsRNA를 배아로 배출합니다. 팁을 배아 내부에 약 2초 동안 그대로 두었다가 조심스럽게 제거합니다.

모든 배아가 주입되면 슬라이드를 페트리 접시에 넣습니다. 젖은 면봉을 접시에 넣고 슬라이드에 닿지 않도록 주의하십시오. 페트리 접시를 덮고 밀봉 필름으로 감쌉니다.

주입된 배아의 dsRNA 유형, 농도, 날짜, 시간 및 개수를 표시합니다. 마지막으로, 배아가 부화할 때까지 접시를 섭씨 30도의 인큐베이터에 넣습니다. pRNAi를 수행하려면 먼저 군체에서 번데기를 수집합니다.

수컷과 암컷 번데기를 두 개의 접시로 분류하고 섭씨 30도의 부화기에 넣습니다. 밀폐된 딱정벌레가 있는지 매일 접시를 확인하고 이 개체를 수컷과 암컷 성인을 위한 두 개의 별도 페트리 접시로 옮깁니다. 이 성인에게 먹이를 주고 주사를 시작할 수 있을 만큼 충분한 성인이 닫힐 때까지 격일로 접시를 유지하십시오.

성체 풀이 완성되면 암컷 딱정벌레를 마취하고 한 손으로는 개별 복부 쪽을 위로 잡고 다른 손으로는 주사기를 잡습니다. 흉골 2와 3 사이의 segmacoria 막을 부드럽게 관통합니다. 주사기 저울을 확인하고 여성 1인당 약 2마이크로리터를 천천히 분주합니다.

주사 후 바늘을 5초 이상 안정적으로 잡고 조심스럽게 빼냅니다. 주입된 암컷을 고양이 사료가 든 페트리 접시에 옮깁니다. 접시에 적절하게 레이블을 붙입니다.

접시를 섭씨 30도의 인큐베이터에 넣습니다. 24시간 후, 주입된 암컷을 미니 케이지로 옮기고 주입되지 않은 어린 수컷과 동일한 수를 추가합니다. 케이지에 라벨을 붙이고 고양이 사료를 추가합니다.

케이지를 섭씨 30도의 인큐베이터에 넣어 짝짓기를 허용합니다. 그 결과 생성된 자손을 검사하여 pRNAi의 효과를 확인할 수 있습니다. 이 이미지는 대조군으로 녹색 형광 단백질인 DS GFP를 주입한 pRNAi 개체의 자손을 보여줍니다.

여기서, 야생형 개체와 마찬가지로, 자손은 분절당 하나의 색소 줄무늬로 부화했습니다. 인접한 착색된 줄무늬는 착색되지 않은 틈으로 분리되었습니다. 한 쌍의 pRNAi에 이어, 영향을 받은 자손은 융합된 이웃 색소 줄무늬로 부화하여 분절 경계에 결함이 있음을 나타냅니다.

표현형 심각도는 가변적이었지만 융합은 특정 경계 영역에서 일관되게 나타나 결함과 같은 쌍 규칙을 나타냅니다. 유사하게, 쌍을 이룬 넉다운(knockdown) 후 부화하지 않은 배아의 큐티클 표현형은 복부 분절의 손실과 신체 길이 단축을 보여주었습니다. 분자 결함을 검사하기 위해 충혈된 항체로 초기 배아를 염색한 결과, 대조군 개체의 각 분절에서 동일한 강도의 발현 줄무늬가 나타났습니다.

대조적으로, Dmac 쌍을 이룬 dsRNA를 주입한 암컷의 자손에서 대체 줄무늬에서 감소된 발현이 감지되었습니다. 이러한 발현 감소 패턴은 영향을 받은 부화한 유충에서 관찰된 결함 있는 표피 패턴과 일치합니다. 여기에서 우리는 처음으로 RNA 간섭을 사용하여 Dermestes maculatus의 초기 배아 발달 과정에서 관심 유전자를 녹다운하는 프로토콜을 제시합니다.

이러한 절차를 시도하는 동안 적절한 단계에서 배아 또는 여성 성인을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 일단 숙달되면 약 100명의 배아 또는 10명의 성인 암컷을 30분 이내에 주입할 수 있습니다. 이 절차에 따라 유전자 조절 메커니즘에 대한 추가 질문에 답하기 위해 배아 염색 또는 정량적 PCR과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 Dermestes 실험실 군체를 설정하는 방법과 이 딱정벌레에서 배아 및 부모 RNA 간섭을 모두 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 현재 기능 연구에 사용할 수 있는 곤충 모델은 소수에 불과합니다. 여기에 제시된 기술은 연구자들이 Dermestes를 모델 시스템으로 사용하여 분자 유전 분석에 적합한 곤충의 범위를 확장할 수 있는 길을 열어줍니다.