RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

이 절차의 전반적인 목표는 티로신 하이드록라아제 주도 eGFP 발현, 단일 세포 수확 및 RNA 염기서열 분석 라이브러리 생성을 사용하여 중뇌 배양에서 살아있는 도파민 뉴런을 안정적으로 식별하는 것입니다. 이 방법은 배양에서 확인된 살아있는 도파민 뉴런에 대한 유전자 발현 및 전기생리학적 분석을 수행할 수 있기 때문에 파킨슨병 및 약물 중독 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 1차 복부 중뇌 배양에서 고정된 도파민 뉴런이 아닌 살아있는 도파민 뉴런을 안정적으로 식별할 수 있는 수단을 제공한다는 것입니다.

절차의 첫 번째 부분은 Henry Lester 실험실의 기술자인 Charlene Kim이 시연할 것입니다. 쥐 배아의 머리를 주둥이에 단단히 올려 놓아 등쪽 표면에 접근할 수 있도록 하는 것으로 시작합니다. 다른 손에 든 집게를 사용하여 중뇌의 융기 바로 앞의 피부층과 두개골을 꼬집고 정중선을 따라 피부와 두개골 코델리를 벗겨냅니다.

집게를 융기 주위에 놓고 한 쪽 끝은 피질과 중간판 사이에, 다른 쪽 끝은 소뇌 위에 놓습니다. 전체 중뇌를 꼬집어 제거합니다. 중뇌를 페트리 접시에 넣고 차가운 HBSS를 해부 현미경으로 만듭니다.

해부 현미경 아래에서 뇌 분절을 뒤집어 이제 복부 쪽에 접근할 수 있도록 합니다. 이제 4개의 사분면이 표시됩니다. 집게로 수막을 부드럽게 잡고 뇌에서 위로 당겨 모든 수막과 혈관 구조를 제거합니다.

다음으로, 집게 한 통을 분절의 대략 중앙에 있는 심실에 놓습니다. 그런 다음 중뇌를 분리하기 위해 등쪽을 꼬집은 다음 양쪽을 내측으로 꼬집습니다. 양쪽을 옆으로 잘라서 아래쪽 두 사분면을 취합니다.

복부 피개 영역과 substantia nigra pars compacta는 복부 하부 부분에 있으며 조밀하게 보입니다. VTA와 SNC를 모두 포함하는 절개된 조직을 페트리 접시의 별도 영역에 신선한 HBSS에 놓습니다. 모든 뇌 분절을 해부한 후 집게와 숫자 11 메스를 사용하여 각 중뇌 부분을 거의 같은 크기의 조각으로 4등분합니다.

그런 다음 넓은 구경의 P1000 피펫 팁을 사용하여 4등분된 모든 중뇌 분절을 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 조직이 가라앉도록 하고 HBSS를 제거한 후 파파인 용액 500마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도의 수조에서 15분 동안 배양합니다.

배양 후 넓은 보어 P1000 팁을 사용하여 중뇌 분절만 1밀리리터의 DNase I 용액 분취량으로 옮기고 분절이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 그런 다음 중뇌 분절만 1ml의 콜드 스톱 용액이 들어 있는 15ml 튜브로 옮깁니다. 두 번째 헹굼은 1ml의 새로운 스톱 용액으로 교체하고 P1000 피펫 팁으로 위아래로 7회 피펫을 사용하여 세포를 분쇄합니다.

그런 다음 200마이크로리터의 4%BSA 용액을 튜브 바닥에 천천히 피펫팅하여 세포 현탁액을 깔아줍니다. 280 x g에서 6분 동안 원심분리한 후 P1000으로 상층액을 흡인하고 1ml의 도금 배지에 세포를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행한 다음 도금 배지를 사용하여 세포 현탁액을 마이크로리터당 1000개의 세포로 희석합니다.

라미닌 흡입 직후 poly-D-lysine, poly-L-ornithine 및 laminin 코팅된 배양 접시에 세포 현탁액 120마이크로리터를 플레이트하여 코팅이 건조되지 않고 고르지 않은 표면을 형성하지 않도록 합니다. 그런 다음 배양 1시간 후 배양 접시의 파종되지 않은 영역에 3ml의 배양 배지를 조심스럽게 첨가하여 세포의 파괴를 최소화합니다. 3주간의 배양 후 RNase가 없는 Dulbecco의 PBS 2ml로 배양 접시를 헹굽니다.

DPBS를 제거합니다. 그런 다음 수확을 위해 1ml의 새 DPBS로 교체하십시오. 도립 에피형광 현미경에서 GFP 필터 세트와 40X 대물렌즈를 사용하여 배양물에서 형광 TH 양성 뉴런을 식별합니다.

micromanipulator를 사용하여 cell soma 위의 피펫에 연결합니다. 그런 다음 마이크로피펫 홀더의 측면 포트에 부착된 플라스틱 튜브를 사용하여 부드럽게 흡입하여 뉴런을 유리 마이크로피펫으로 흡인합니다. 입용액에서 세포가 들어 있는 마이크로피펫을 즉시 제거하고 반응 완충액이 들어 있는 0.2밀리리터 PCR 튜브 컬렉션 안에 팁을 넣습니다.

바닥 근처의 튜브 측면에 대해 팁을 끊습니다. 그런 다음 멸균 21 게이지 주사기 바늘을 미코피펫 뒤쪽에 놓고 압력을 가하여 마이크로피펫의 부러진 끝에서 남은 액체를 배출합니다. 탁상용 마이크로 원심분리기를 사용하여 수집 튜브를 5초 동안 원심분리한 다음 드라이아이스에 얼립니다.

얼음 또는 냉각기 블록에서 시약과 함께 PCR 캐비닛에서 작업하는 동안 실온에서 첫 번째 균주 마스터 믹스와 10% 추가 부피를 준비합니다. 그리고 1 마이크로 리터의 3 프라임 프라이머 1 및 1 마이크로 리터의 정량화 된 RNA 스파이크가 샘플에 스파이크됩니다. 그런 다음 섭씨 72도에서 3분 동안 열순환기에 샘플을 배양한 다음 샘플을 PCR 쿨러 랙에 직접 넣습니다.

다음으로, 준비된 마스터 믹스 5.5마이크로리터를 PCR 쿨러 랙의 반응 튜브에 넣고 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 튜브를 5초 동안 원심분리한 후 이제 화면에 표시된 매개변수로 설정된 열순환기에서 배양합니다. 첫 번째 가닥 cDNA를 정제하기 위해 25마이크로리터의 와류가 있는 실온 마그네틱 비드를 샘플에 추가합니다.

전체 부피를 최소 10회 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 cDNA가 비드에 결합할 수 있도록 실온에서 8분 동안 배양합니다. 그런 다음 액체가 완전히 투명하게 나타나고 상등액에 비드가 남지 않을 때까지 샘플과 마그네틱 비드를 자기 분리 장치에 놓습니다.

상층액을 흡인하고 버립니다. 샘플을 5초 동안 회전시켜 튜브 측면에서 액체를 수집합니다. 샘플을 자기 분리 장치에 30초 동안 놓습니다.

그런 다음 P10 파이펫터로 남아 있는 모든 상층액을 제거하고 DNA가 결합된 비드만 남깁니다. ds-cDNA PCR 마스터 믹스 50마이크로리터를 첨가한 다음 두 번째 가닥 합성 PCR 프로그램을 실행하여 이중 가닥 cDNA를 얻습니다. 이 히스토그램은 TH-eGFP 양성 세포에서 생성된 단일 세포 도파민 RNA 염기서열 분석 라이브러리에서 검출된 단백질 코딩 유전자의 수를 보여줍니다.

6, 000에서 8, 000의 단백질 유전자가 단 하나 세포 도서관에서 검출되었다. 이 기술을 완전히 익히면 세포를 추출하는 시간, 배양 중인 세포의 성숙, 세포 수확 및 라이브러리 생성 단계, 라이브러리 염기서열 분석 및 예비 분석을 포함하여 4-5주 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 RNA 탐색 라이브러리 생성 및 세포 수확을 위한 RNAse-free 작업 공간을 유지하고, 세포 배양을 통해 멸균 기술을 유지하고, 단일 세포 수확을 위해 적절한 크기의 직경을 가진 피펫을 만드는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

파라포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 흄 후드 사용, 피부 및 눈 접촉 피하기, 열 및 화염 멀리하기, 항상 적절한 개인 보호복 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 따라 약물 치료가 도파민 세포에서 단백질 발현에 미치는 영향과 같은 추가 질문에 답하기 위해 유전자 발현 및 유전자 네트워크 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.