Name: RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 배우세요 중간뇌 배양에서 TH-프로모터 eGFP를 이용해 생활 도파민 뉴런을 식별하고 RNA 시퀀싱으로 유전자 발현을 분석하는 방법입니다. 파킨슨병 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 미국 국립보건원(DA017279, AG033954, DA037743), 마이클 J. 폭스 재단, 캘리포니아 공과대학의 밀라드 앤 뮤리엘 제이콥스 유전학 및 유전체학 연구소에 자금을 지원하는 칼텍 혁신 이니셔티브의 보조금으로 지원되었습니다. RNA-Seq 라이브러리 프로토콜을 최적화하고 도움을 주신 Brian Williams에게 감사드립니다. 컴퓨터 교육에 대해 Henry Amrhein에게 감사드립니다. Barbara J. Wold가 자신의 장비와 실험실 공간을 사용해 준 것에 대해 감사드립니다. 도서관 염기서열 분석과 시설 관리에 대해 Igor Antoshechkin에게 감사드립니다.

<ol><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+nicotine+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).</li>
<li>Marinov, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single-cell+to+cell-pool+transcriptomes%3A+stochasticity+in+gene+expression+and+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing.</a> Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+reveals+dynamic+changes+in+lncRNA+expression+during+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).</li>
<li>Gertz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposase+mediated+construction+of+RNA-seq+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Transposase mediated construction of RNA-seq libraries.</a> Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).</li>
<li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. , 562-578 (2012).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li>
<li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs%2C+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry%2C+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency%2C+and+Prevents+Nicotine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubator+embedded+cell+culture+imaging+system+%28EmSight%29+based+on+Fourier+ptychographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy.</a> Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).</li>
<li>Lammel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+transgenic+mouse+models+for+selective+targeting+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons.</a> Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dryanovski, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+entry+and+alpha-synuclein+inclusions+elevate+dendritic+mitochondrial+oxidant+stress+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons.</a> J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).</li>
<li>Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Regulation+of+Action+Potential+Shape+and+Burst-Frequency+Firing+by+BK+and+Kv2+Channels+in+Substantia+Nigra+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons.</a> J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

여기에서 우리는 단일 셀 RNA-서열과 각 셀을 연구, 형광 태그를 사용하여 이기종 인구에서 단일 세포를 분리. 우리는 수확 서열 라이브 TH-eGFP는 세포 100 % 다음 세 DA 관련된 유전자 전 사체, TH, DDC 및 slc6a3의 존재에 기초하여, 실제로 도파민 뉴런 있다고보고한다. RNA-서열에 의해 평가로 TH-eGFP는 양성 세포는 모두이 세 가지 유전자를 표명했다. 이는 각각의 TH-eGFP는 세포는 도파민 뉴런 (8, 9)와 연관된 이온 채널의 레퍼토리를 표시되었습니다 전기 생리학 연구와 일치율이었다. 이 프로토콜에서 우리는 라이브 도파민 신경 세포에 대한 신뢰할 수있는 표식으로 GENSAT 티로신 수산화-eGFP는 마우스 스트레인 (10)를 이용했다. WT 문화에서 현재 자신의 형태를 기반으로 라이브 도파민 신경 세포를 식별 할 신뢰할 수있는 방법이 없습니다....

파킨슨 병 (PD)는 불치, 노화와 관련된 퇴행성 신경 질환이다. 이 비교적 흔한 질환의 원인은 제대로 이해 남아 있습니다. 운동 완만, 강성 및 진동의 진단 임상 양상에 이르는 Substantia 그라 (SNC)에서 도파민 뉴런의 뚜렷한 신경 세포의 변성과 뇌 전반에 걸쳐 광범위하게 신경 세포의 손실은있다. SNC의 도파민 신경 세포를 포함하는 차 혼합 문화는 파킨슨 병에 특히 적합하다. 복부 피개 영역 (VTA) 도파민 뉴런은 보상과 중독에 연루되어있다. 복부 중뇌 (VM) 차 혼합 배아 문화 SNC와 VTA의 도파민 (DA) 신경 세포와 GABA 성 신경 세포 모두를 포함한다. VM 일차 배양 신경 분석에 유용 할 수 있고, 도파민 성 신경 세포의 선택적 취약점 해명. 형태에 따라 문화에서 도파민 세포를 식별 할 신뢰할 수있는 방법은 없습니다. 그우리는 단일 셀, 고 수율 RNA 시퀀싱 라이브러리를 식별하고 하나의 도파민 신경 세포를 수확하고 구성하는 기술을 개발 재. 우리는 하나의 도파민과 중뇌 문화에서 고립 된 GABA 성 신경 세포에 대한 대표의 RNA 전 사체 데이터를보고합니다. 이 프로토콜은 DA / GABA 사체의 다양한 치료법의 효과를 연구하기 위해 신경 보호, 신경 퇴화, 및 약리학 적 분석에 이용 될 수있다. 도파민 뉴런 VM 차 배양에서 발현 뉴런의 소수를 표현하기 때문에, 안정적으로 생활 문화 뉴런을 식별하는 능력은 단일 셀 연구 향상된 범위를 가능하게 할 것이다. 이 새로운 기술은 세포 수준에서 발생하는 메커니즘을 이해하는 발전을 촉진하고 다른 신경 및 분자 생물학 분야에서의 응용을 가질 수있다.

<table><tbody><tr><td>파파인</td><td>워딩턴 생화학 공사&nbsp;</td><td></td><td></td>LS003126</tr><tr><td>Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>기증자 말 혈청</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>매체: Neurobasal 매체</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민의 안정화된 형태를 포함하는 배양 배지: GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td>0.5mM 최종 농도.</td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>기코&nbsp;</td><td>17504-044</td><td>50x 스톡 용액, 1x 최종 농도.</td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시</td><td>MatTek&nbsp; &nbsp;</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td>시그마&nbsp;</td><td>L2020</td>은 <td>-20 &deg에 저장되었습니다. C 20 & 마이크로; L 분취량</td></tr><tr><td>데옥시리보뉴클레아제 I (DNase)</td><td>시그마&nbsp;</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>블루 피펫 팁 P1000</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>&nbsp;Inc. 10130</td><td></td></tr><tr><td>10 mm 얕은 페트리 접시</td><td>VWR&nbsp;</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C 수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C, 5% 습도 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드(PFA)</td><td>전자 현미경 과학&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>&nbsp; X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 세럼</td><td>에퀴테크&nbsp;</td><td>SD-0100HI</td><td>100% 원액, 1% 최종 농도.</td></tr><tr><td>표준 패턴 수술용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-14</td><td></td></tr><tr><td>Forceps - 2x3 teeth</td><td>Fine Science Tools</td><td>11022-14</td><td></td></tr><tr><td>Forceps - Dumont #55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Forceps - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7.4</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 용액 (DPBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>21 G 바늘</td><td>BD PrecisionGlide 바늘</td><td></td><td>305167 100 바늘</td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>서터 기기</td><td>모델 P-87</td><td></td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터&nbsp;</td><td>셔터 기기</td><td>&nbsp; MP-285</td><td></td></tr><tr><td>염기서열분석 키트: Illumina 염기서열분석을 위한 SMARTer 초저 RNA 키트</td>, <td>Clontech</td><td></td><td>634936 100 rnxs, incl Advantage2PCR Kit</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드 (12 &micro; M): SMARTer IIA 올리고뉴클레오티드(12 &micro; M)</td><td></td><td></td> <td>SMARTer 키트에서&nbsp;</td></tr><tr><td>역전사효소 (100 units)</td><td>SMARTcribe 역전사효소</td><td></td><td>SMARTer Kit에서&nbsp;</td></tr><tr><td>프라이머 1</td><td>3' CDSIIa 프라이머&nbsp;</td><td></td><td>SMARTer Kit</td></tr><tr><td>Primer 2</td><td>IS PCR 프라이머</td><td></td><td>에서 SMARTer Kit</td></tr><tr><td>50x 2 중합효소 혼합물</td><td>50x Advantage 2 중합효소 혼합물</td><td></td><td>SMARTer Kit에서</td></tr><tr><td>10x PCR buffer</td>, <td>10x Advantage 2 PCR buffer</td><td></td><td></td>에서</tr><tr><td>RNA 스파이크</td><td>ThermoFisher 4456740</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 쿨러 랙</td><td>IsoFreeze PCR 쿨러 랙</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 샘플 준비 키트&nbsp;</td><td>(Illumina/Nextera) Nexter</td><td>FC-121-1030</td><td>24 샘플</td></tr><tr><td>PCR 마스터 믹스</td><td>Nextera PCR 마스터 믹스 (NPM)</td><td></td><td>Nextera 키트에서&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR 프라이머 칵테일 (PPC)&nbsp;</td><td>넥스테라 PCR 프라이머 칵테일 (PPC)&nbsp;</td><td></td><td>Nextera 키트에서</td></tr><tr><td>Fluorometer</td><td>The Qubit ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>HS DNA BioAnalyzer kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>110 rxns</td></tr><tr><td>전기영동 시스템&nbsp;</td><td>Agilent 2100 바이오분석기.</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>자석 비즈: Agencourt AMPure&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>RNAse wipe: RNAse Zap wipes</td><td>Ambion</td><td>AM9786</td><td>크기 100 장</td></tr><tr><td>Qubit ds HS Assay Kit</td><td>분자 프로브&nbsp;</td><td>Q32854</td><td>500 분석</td></tr><tr><td>젤 추출 키트: Qiaquick 젤 추출 키트</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td> <td>(Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm 외경)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige (또는 동급)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시퀀서</td><td>Illumina HiSeq 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GENSAT 티로신 하이드록실라제-eGFP 마우스 스트레인&nbsp;</td><td></td><td>MMRRC 재고 번호: 000292-UNC</td><td>재고 Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/돌연변이 마우스 지역 연구 센터</td></tr></tbody></table>

rna 시퀀싱 및 th-프로모터 중심 egfp는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

<html> 파킨슨 병 (PD)에서 운동 완만, 강성 및 진동에지도하는 SNC에서 도파민 뉴런의 발음 변성 뇌 전반에 걸쳐 광범위하게 신경 세포의 손실이있다. 형광 마커를 사용하여 기본 복부 중뇌 (VM) 문화 생활 도파민 신경 세포의 식별은 고정 된 세포의 면역 염색에 의존하지 않고 이러한 신경 세포의 선택적 취약점을 연구하는 다른 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 분리, 해리, 문화 마우스 VM 신경 삼주합니다. 우리는 그 다음의 (a 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터에 의해 구동) eGFP는 형광을 이용하여 문화에서 도파민 신경 세포를 식별합니다. 개별 뉴런 유리 가능한 Micropipette를 사용하여 마이크로 원심 튜브에 수확된다. 다음으로, 우리는 수확 된 세포 용균 및 단일 세포 RNA-SEQ 라이브러리 (1, 2)를 생성하는 cDNA 합성 및 트랜스포존 매개 &quot;tagmentation를&quot;행위엉덩이 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 3, 4, 5. 품질 제어 검사를 통과 한 후, 단일 셀 라이브러리는 서열화되고 후속 분석은 유전자 발현을 측정하기 위해 수행된다. 우리는 개인의 도파민과 중뇌 문화에서 고립 된 GABA 성 신경 세포에 대한 사체 결과를보고한다. 우리는 수확 서열 된 라이브 TH-eGFP는 세포의 100 % 도파민 신경 세포라고보고한다. 이러한 기술은 신경 과학 및 분자 생물학에서 광범위하게 응용 프로그램을 제공합니다.

여기에서 우리는, 티로신 수산화 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-SEQ (그림 1)를 사용하여 자신의 RNA 전 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다. 데이터 수확 서열화 된 TH-eGFP는 양성 세포 100 % 다음 세 DA 관련된 유전자 전 사체의 존재 TH, DOPA 데카 복실 라제 (DDC) 및 도파민 전달체 DAT에 기초하여, 도파민 뉴런 것으로 나타났다 (slc6a3). RNA-서열에 의해 평가로 TH-eGFP는 양성 세포는 모두이 세 가지 유전자를 표명했다. 각각의 단일 셀 RNA-서열 라이브러리에서 6,000 - 8,000 단백질 코딩 유전자 (그림 2) 검출되었다. 도파민 신경 세포는 견고 여러 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 (nAChR을) 서브 유닛 (표 1)에</stron...

파킨슨 병 (PD)에서 Substantia 그라 (SNC) 도파민 신경 세포는 운동 기능 장애로 이어지는, 퇴화. 여기에서 우리는 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-서열을 사용하여 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

이 절차의 전반적인 목표는 티로신 하이드록라아제 주도 eGFP 발현, 단일 세포 수확 및 RNA 염기서열 분석 라이브러리 생성을 사용하여 중뇌 배양에서 살아있는 도파민 뉴런을 안정적으로 식별하는 것입니다. 이 방법은 배양에서 확인된 살아있는 도파민 뉴런에 대한 유전자 발현 및 전기생리학적 분석을 수행할 수 있기 때문에 파킨슨병 및 약물 중독 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 1차 복부 중뇌 배양에서 고정된 도파민 뉴런이 아닌 살아있는 도파민 뉴런을 안정적으로 식별할 수 있는 수단을 제공한다는 것입니다.절차의 첫 번째 부분은 Henry Lester 실험실의 기술자인 Charlene Kim이 시연할 것입니다. 쥐 배아의 머리를 주둥이에 단단히 올려 놓아 등쪽 표면에 접근할 수 있도록 하는 것으로 시작합니다. 다른 손에 든 집게를 사용하여 중뇌의 융기 바로 앞의 피부층과 두개골을 꼬집고 정중선을 따라 피부와 두개골 코델리를 벗겨냅니다.집게를 융기 주위에 놓고 한 쪽 끝은 피질과 중간판 사이에, 다른 쪽 끝은 소뇌 위에 놓습니다. 전체 중뇌를 꼬집어 제거합니다. 중뇌를 페트리 접시에 넣고 차가운 HBSS를 해부 현미경으로 만듭니다.해부 현미경 아래에서 뇌 분절을 뒤집어 이제 복부 쪽에 접근할 수 있도록 합니다. 이제 4개의 사분면이 표시됩니다. 집게로 수막을 부드럽게 잡고 뇌에서 위로 당겨 모든 수막과 혈관 구조를 제거합니다.다음으로, 집게 한 통을 분절의 대략 중앙에 있는 심실에 놓습니다. 그런 다음 중뇌를 분리하기 위해 등쪽을 꼬집은 다음 양쪽을 내측으로 꼬집습니다. 양쪽을 옆으로 잘라서 아래쪽 두 사분면을 취합니다.복부 피개 영역과 substantia nigra pars compacta는 복부 하부 부분에 있으며 조밀하게 보입니다. VTA와 SNC를 모두 포함하는 절개된 조직을 페트리 접시의 별도 영역에 신선한 HBSS에 놓습니다. 모든 뇌 분절을 해부한 후 집게와 숫자 11 메스를 사용하여 각 중뇌 부분을 거의 같은 크기의 조각으로 4등분합니다.그런 다음 넓은 구경의 P1000 피펫 팁을 사용하여 4등분된 모든 중뇌 분절을 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 조직이 가라앉도록 하고 HBSS를 제거한 후 파파인 용액 500마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도의 수조에서 15분 동안 배양합니다.배양 후 넓은 보어 P1000 팁을 사용하여 중뇌 분절만 1밀리리터의 DNase I 용액 분취량으로 옮기고 분절이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 그런 다음 중뇌 분절만 1ml의 콜드 스톱 용액이 들어 있는 15ml 튜브로 옮깁니다. 두 번째 헹굼은 1ml의 새로운 스톱 용액으로 교체하고 P1000 피펫 팁으로 위아래로 7회 피펫을 사용하여 세포를 분쇄합니다.그런 다음 200마이크로리터의 4%BSA 용액을 튜브 바닥에 천천히 피펫팅하여 세포 현탁액을 깔아줍니다. 280 x g에서 6분 동안 원심분리한 후 P1000으로 상층액을 흡인하고 1ml의 도금 배지에 세포를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행한 다음 도금 배지를 사용하여 세포 현탁액을 마이크로리터당 1000개의 세포로 희석합니다.라미닌 흡입 직후 poly-D-lysine, poly-L-ornithine 및 laminin 코팅된 배양 접시에 세포 현탁액 120마이크로리터를 플레이트하여 코팅이 건조되지 않고 고르지 않은 표면을 형성하지 않도록 합니다. 그런 다음 배양 1시간 후 배양 접시의 파종되지 않은 영역에 3ml의 배양 배지를 조심스럽게 첨가하여 세포의 파괴를 최소화합니다. 3주간의 배양 후 RNase가 없는 Dulbecco의 PBS 2ml로 배양 접시를 헹굽니다.DPBS를 제거합니다. 그런 다음 수확을 위해 1ml의 새 DPBS로 교체하십시오. 도립 에피형광 현미경에서 GFP 필터 세트와 40X 대물렌즈를 사용하여 배양물에서 형광 TH 양성 뉴런을 식별합니다.micromanipulator를 사용하여 cell soma 위의 피펫에 연결합니다. 그런 다음 마이크로피펫 홀더의 측면 포트에 부착된 플라스틱 튜브를 사용하여 부드럽게 흡입하여 뉴런을 유리 마이크로피펫으로 흡인합니다. 입용액에서 세포가 들어 있는 마이크로피펫을 즉시 제거하고 반응 완충액이 들어 있는 0.2밀리리터 PCR 튜브 컬렉션 안에 팁을 넣습니다.바닥 근처의 튜브 측면에 대해 팁을 끊습니다. 그런 다음 멸균 21 게이지 주사기 바늘을 미코피펫 뒤쪽에 놓고 압력을 가하여 마이크로피펫의 부러진 끝에서 남은 액체를 배출합니다. 탁상용 마이크로 원심분리기를 사용하여 수집 튜브를 5초 동안 원심분리한 다음 드라이아이스에 얼립니다.얼음 또는 냉각기 블록에서 시약과 함께 PCR 캐비닛에서 작업하는 동안 실온에서 첫 번째 균주 마스터 믹스와 10% 추가 부피를 준비합니다. 그리고 1 마이크로 리터의 3 프라임 프라이머 1 및 1 마이크로 리터의 정량화 된 RNA 스파이크가 샘플에 스파이크됩니다. 그런 다음 섭씨 72도에서 3분 동안 열순환기에 샘플을 배양한 다음 샘플을 PCR 쿨러 랙에 직접 넣습니다.다음으로, 준비된 마스터 믹스 5.5마이크로리터를 PCR 쿨러 랙의 반응 튜브에 넣고 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 튜브를 5초 동안 원심분리한 후 이제 화면에 표시된 매개변수로 설정된 열순환기에서 배양합니다. 첫 번째 가닥 cDNA를 정제하기 위해 25마이크로리터의 와류가 있는 실온 마그네틱 비드를 샘플에 추가합니다.전체 부피를 최소 10회 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 cDNA가 비드에 결합할 수 있도록 실온에서 8분 동안 배양합니다. 그런 다음 액체가 완전히 투명하게 나타나고 상등액에 비드가 남지 않을 때까지 샘플과 마그네틱 비드를 자기 분리 장치에 놓습니다.상층액을 흡인하고 버립니다. 샘플을 5초 동안 회전시켜 튜브 측면에서 액체를 수집합니다. 샘플을 자기 분리 장치에 30초 동안 놓습니다.그런 다음 P10 파이펫터로 남아 있는 모든 상층액을 제거하고 DNA가 결합된 비드만 남깁니다. ds-cDNA PCR 마스터 믹스 50마이크로리터를 첨가한 다음 두 번째 가닥 합성 PCR 프로그램을 실행하여 이중 가닥 cDNA를 얻습니다. 이 히스토그램은 TH-eGFP 양성 세포에서 생성된 단일 세포 도파민 RNA 염기서열 분석 라이브러리에서 검출된 단백질 코딩 유전자의 수를 보여줍니다.6, 000에서 8, 000의 단백질 유전자가 단 하나 세포 도서관에서 검출되었다. 이 기술을 완전히 익히면 세포를 추출하는 시간, 배양 중인 세포의 성숙, 세포 수확 및 라이브러리 생성 단계, 라이브러리 염기서열 분석 및 예비 분석을 포함하여 4-5주 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 RNA 탐색 라이브러리 생성 및 세포 수확을 위한 RNAse-free 작업 공간을 유지하고, 세포 배양을 통해 멸균 기술을 유지하고, 단일 세포 수확을 위해 적절한 크기의 직경을 가진 피펫을 만드는 것을 기억하는 것이 중요합니다.파라포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 흄 후드 사용, 피부 및 눈 접촉 피하기, 열 및 화염 멀리하기, 항상 적절한 개인 보호복 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 따라 약물 치료가 도파민 세포에서 단백질 발현에 미치는 영향과 같은 추가 질문에 답하기 위해 유전자 발현 및 유전자 네트워크 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

reliable-identification-living-dopaminergic-neurons-midbrain-cultures

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

E12.5 murine 배아 midbrain에서 organotypic 조각을 생성하는 방법을 설명합니다. organotypic 슬라이스 문화가 dopaminergic 신경이나 다른 복부 midbrain의 뉴런의 행동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

기능과 midbrain dopaminergic 뉴런의 발달 동안 유전자의 규정을 평가하기 위해 관련된 방법을...

Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

여기에 우리가있는 도파민 (DA) 신경 세포의 연령에 따라 신경 변성을 연구하기 위해 설립 된 두 가지 분석을...

에 신약 표현형을 평가<em&gt; 초파리</em&gt; 등산 분석 실험에 의한 도파민 뉴런과 뇌 전체의 면역 염색

도파민 뉴런은 뇌에서 중요한 조절 역할을 합니다. 그들의 손실은 파킨슨병과 관련이 있습니다. 이 비디오에서는 배아 마우스 중뇌에서 중심 도파민 뉴런의 1차 배양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이러한 배양은 다양한 스트레스에 대한 이러한 뉴런의 극도의 취약성을 연구하는 데 유용합니다.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

파킨슨병 동안 중뇌 도파민성 뉴런의 퇴화 원인은 완전히 이해되지 않았습니다. 세포 배양 시스템은 이러한 뉴런의 신경 생리학적 특성을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다. 여기에서는 신경퇴행의 체외 모델링에 활용할 수 있는 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

배양된 초파리 뇌 외식편에서 정동작 신경줄기세포를 재활성화시키는 방법이 확립되었다. 이 방법을 사용하여, 전신 신호의 역할은 신경 줄기 세포 정지, 출입의 조절에서 조직 내재적 신호로부터 결합되지 않을 수 있다.

배양된 초파리 뇌 외래 식물에서 신경 줄기 세포 재활성화

이 프로토콜은 인간 중뇌 도파민 뉴런의 세포 배양에 이어 면역학적 염색 및 획득된 현미경 high-content 이미지에서 신경 세포 표현형 프로파일 생성을 설명하여 유전적 또는 화학적 조절로 인한 표현형 변이를 식별할 수 있습니다.

인간 줄기세포 유래 중뇌 도파민 뉴런의 표현형 프로파일링

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)은 확장 현미경 검사와 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 결합하여 두꺼운 조직에서 여러 유전자의 발현을 검출하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 이 방법의 최근 발전과 온전한 초파리 중추 신경계를 라벨링하기 위한 적응을 간략하게 설명합니다.

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

본 연구는 다공성 막 삽입물을 이용해 축삭 mRNA를 분리하는 견고한 방법을 제시하여, 전체 뉴런과 신경돌의 분리 및 RNA 정제를 가능하게 합니다. RTddPCR과 결합하여 저복제 전사체의 절대적 정량화를 가능하게 하여, 높은 민감도, 재현성, 광범위한 실험적 적용성을 가진 mRNA 수송 및 국소 번역 연구를 용이하게 합니다.

다공성 막 삽입물과 RTddPCR을 이용한 축삭 mRNA의 분리 및 정량

배우세요 중간뇌 배양에서 TH-프로모터 eGFP를 이용해 생활 도파민 뉴런을 식별하고 RNA 시퀀싱으로 유전자 발현을 분석하는 방법입니다. 파킨슨병 연구에 활용됩니다.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

더 많은 동영상 탐색