Name: RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 배우세요 중간뇌 배양에서 TH-프로모터 eGFP를 이용해 생활 도파민 뉴런을 식별하고 RNA 시퀀싱으로 유전자 발현을 분석하는 방법입니다. 파킨슨병 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(DA017279, AG033954, DA037743), 마이클 J. 폭스 재단, 캘리포니아 공과대학의 밀라드 앤 뮤리엘 제이콥스 유전학 및 유전체학 연구소에 자금을 지원하는 칼텍 혁신 이니셔티브의 보조금으로 지원되었습니다. RNA-Seq 라이브러리 프로토콜을 최적화하고 도움을 주신 Brian Williams에게 감사드립니다. 컴퓨터 교육에 대해 Henry Amrhein에게 감사드립니다. Barbara J. Wold가 자신의 장비와 실험실 공간을 사용해 준 것에 대해 감사드립니다. 도서관 염기서열 분석과 시설 관리에 대해 Igor Antoshechkin에게 감사드립니다.

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저자는 공개할 것이 없습니다.

여기에서 우리는 단일 셀 RNA-서열과 각 셀을 연구, 형광 태그를 사용하여 이기종 인구에서 단일 세포를 분리. 우리는 수확 서열 라이브 TH-eGFP는 세포 100 % 다음 세 DA 관련된 유전자 전 사체, TH, DDC 및 slc6a3의 존재에 기초하여, 실제로 도파민 뉴런 있다고보고한다. RNA-서열에 의해 평가로 TH-eGFP는 양성 세포는 모두이 세 가지 유전자를 표명했다. 이는 각각의 TH-eGFP는 세포는 도파민 뉴런 (8, 9)와 연관된 이온 채널의 레퍼토리를 표시되었습니다 전기 생리학 연구와 일치율이었다. 이 프로토콜에서 우리는 라이브 도파민 신경 세포에 대한 신뢰할 수있는 표식으로 GENSAT 티로신 수산화-eGFP는 마우스 스트레인 (10)를 이용했다. WT 문화에서 현재 자신의 형태를 기반으로 라이브 도파민 신경 세포를 식별 할 신뢰할 수있는 방법이 없습니다....

파킨슨 병 (PD)는 불치, 노화와 관련된 퇴행성 신경 질환이다. 이 비교적 흔한 질환의 원인은 제대로 이해 남아 있습니다. 운동 완만, 강성 및 진동의 진단 임상 양상에 이르는 Substantia 그라 (SNC)에서 도파민 뉴런의 뚜렷한 신경 세포의 변성과 뇌 전반에 걸쳐 광범위하게 신경 세포의 손실은있다. SNC의 도파민 신경 세포를 포함하는 차 혼합 문화는 파킨슨 병에 특히 적합하다. 복부 피개 영역 (VTA) 도파민 뉴런은 보상과 중독에 연루되어있다. 복부 중뇌 (VM) 차 혼합 배아 문화 SNC와 VTA의 도파민 (DA) 신경 세포와 GABA 성 신경 세포 모두를 포함한다. VM 일차 배양 신경 분석에 유용 할 수 있고, 도파민 성 신경 세포의 선택적 취약점 해명. 형태에 따라 문화에서 도파민 세포를 식별 할 신뢰할 수있는 방법은 없습니다. 그우리는 단일 셀, 고 수율 RNA 시퀀싱 라이브러리를 식별하고 하나의 도파민 신경 세포를 수확하고 구성하는 기술을 개발 재. 우리는 하나의 도파민과 중뇌 문화에서 고립 된 GABA 성 신경 세포에 대한 대표의 RNA 전 사체 데이터를보고합니다. 이 프로토콜은 DA / GABA 사체의 다양한 치료법의 효과를 연구하기 위해 신경 보호, 신경 퇴화, 및 약리학 적 분석에 이용 될 수있다. 도파민 뉴런 VM 차 배양에서 발현 뉴런의 소수를 표현하기 때문에, 안정적으로 생활 문화 뉴런을 식별하는 능력은 단일 셀 연구 향상된 범위를 가능하게 할 것이다. 이 새로운 기술은 세포 수준에서 발생하는 메커니즘을 이해하는 발전을 촉진하고 다른 신경 및 분자 생물학 분야에서의 응용을 가질 수있다.

<table><tbody><tr><td>파파인</td><td>워딩턴 생화학 공사&nbsp;</td><td></td><td></td>LS003126</tr><tr><td>Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>기증자 말 혈청</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>매체: Neurobasal 매체</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민의 안정화된 형태를 포함하는 배양 배지: GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td>0.5mM 최종 농도.</td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>기코&nbsp;</td><td>17504-044</td><td>50x 스톡 용액, 1x 최종 농도.</td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시</td><td>MatTek&nbsp; &nbsp;</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td>시그마&nbsp;</td><td>L2020</td>은 <td>-20 &deg에 저장되었습니다. C 20 & 마이크로; L 분취량</td></tr><tr><td>데옥시리보뉴클레아제 I (DNase)</td><td>시그마&nbsp;</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>블루 피펫 팁 P1000</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>&nbsp;Inc. 10130</td><td></td></tr><tr><td>10 mm 얕은 페트리 접시</td><td>VWR&nbsp;</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C 수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C, 5% 습도 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드(PFA)</td><td>전자 현미경 과학&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>&nbsp; X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 세럼</td><td>에퀴테크&nbsp;</td><td>SD-0100HI</td><td>100% 원액, 1% 최종 농도.</td></tr><tr><td>표준 패턴 수술용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-14</td><td></td></tr><tr><td>Forceps - 2x3 teeth</td><td>Fine Science Tools</td><td>11022-14</td><td></td></tr><tr><td>Forceps - Dumont #55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Forceps - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7.4</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 용액 (DPBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>21 G 바늘</td><td>BD PrecisionGlide 바늘</td><td></td><td>305167 100 바늘</td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>서터 기기</td><td>모델 P-87</td><td></td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터&nbsp;</td><td>셔터 기기</td><td>&nbsp; MP-285</td><td></td></tr><tr><td>염기서열분석 키트: Illumina 염기서열분석을 위한 SMARTer 초저 RNA 키트</td>, <td>Clontech</td><td></td><td>634936 100 rnxs, incl Advantage2PCR Kit</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드 (12 &micro; M): SMARTer IIA 올리고뉴클레오티드(12 &micro; M)</td><td></td><td></td> <td>SMARTer 키트에서&nbsp;</td></tr><tr><td>역전사효소 (100 units)</td><td>SMARTcribe 역전사효소</td><td></td><td>SMARTer Kit에서&nbsp;</td></tr><tr><td>프라이머 1</td><td>3' CDSIIa 프라이머&nbsp;</td><td></td><td>SMARTer Kit</td></tr><tr><td>Primer 2</td><td>IS PCR 프라이머</td><td></td><td>에서 SMARTer Kit</td></tr><tr><td>50x 2 중합효소 혼합물</td><td>50x Advantage 2 중합효소 혼합물</td><td></td><td>SMARTer Kit에서</td></tr><tr><td>10x PCR buffer</td>, <td>10x Advantage 2 PCR buffer</td><td></td><td></td>에서</tr><tr><td>RNA 스파이크</td><td>ThermoFisher 4456740</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 쿨러 랙</td><td>IsoFreeze PCR 쿨러 랙</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 샘플 준비 키트&nbsp;</td><td>(Illumina/Nextera) Nexter</td><td>FC-121-1030</td><td>24 샘플</td></tr><tr><td>PCR 마스터 믹스</td><td>Nextera PCR 마스터 믹스 (NPM)</td><td></td><td>Nextera 키트에서&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR 프라이머 칵테일 (PPC)&nbsp;</td><td>넥스테라 PCR 프라이머 칵테일 (PPC)&nbsp;</td><td></td><td>Nextera 키트에서</td></tr><tr><td>Fluorometer</td><td>The Qubit ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>HS DNA BioAnalyzer kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>110 rxns</td></tr><tr><td>전기영동 시스템&nbsp;</td><td>Agilent 2100 바이오분석기.</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>자석 비즈: Agencourt AMPure&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>RNAse wipe: RNAse Zap wipes</td><td>Ambion</td><td>AM9786</td><td>크기 100 장</td></tr><tr><td>Qubit ds HS Assay Kit</td><td>분자 프로브&nbsp;</td><td>Q32854</td><td>500 분석</td></tr><tr><td>젤 추출 키트: Qiaquick 젤 추출 키트</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td> <td>(Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm 외경)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige (또는 동급)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시퀀서</td><td>Illumina HiSeq 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GENSAT 티로신 하이드록실라제-eGFP 마우스 스트레인&nbsp;</td><td></td><td>MMRRC 재고 번호: 000292-UNC</td><td>재고 Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/돌연변이 마우스 지역 연구 센터</td></tr></tbody></table>

rna 시퀀싱 및 th-프로모터 중심 egfp는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

<html> 파킨슨 병 (PD)에서 운동 완만, 강성 및 진동에지도하는 SNC에서 도파민 뉴런의 발음 변성 뇌 전반에 걸쳐 광범위하게 신경 세포의 손실이있다. 형광 마커를 사용하여 기본 복부 중뇌 (VM) 문화 생활 도파민 신경 세포의 식별은 고정 된 세포의 면역 염색에 의존하지 않고 이러한 신경 세포의 선택적 취약점을 연구하는 다른 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 분리, 해리, 문화 마우스 VM 신경 삼주합니다. 우리는 그 다음의 (a 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터에 의해 구동) eGFP는 형광을 이용하여 문화에서 도파민 신경 세포를 식별합니다. 개별 뉴런 유리 가능한 Micropipette를 사용하여 마이크로 원심 튜브에 수확된다. 다음으로, 우리는 수확 된 세포 용균 및 단일 세포 RNA-SEQ 라이브러리 (1, 2)를 생성하는 cDNA 합성 및 트랜스포존 매개 &quot;tagmentation를&quot;행위엉덩이 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 3, 4, 5. 품질 제어 검사를 통과 한 후, 단일 셀 라이브러리는 서열화되고 후속 분석은 유전자 발현을 측정하기 위해 수행된다. 우리는 개인의 도파민과 중뇌 문화에서 고립 된 GABA 성 신경 세포에 대한 사체 결과를보고한다. 우리는 수확 서열 된 라이브 TH-eGFP는 세포의 100 % 도파민 신경 세포라고보고한다. 이러한 기술은 신경 과학 및 분자 생물학에서 광범위하게 응용 프로그램을 제공합니다.

여기에서 우리는, 티로신 수산화 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-SEQ (그림 1)를 사용하여 자신의 RNA 전 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다. 데이터 수확 서열화 된 TH-eGFP는 양성 세포 100 % 다음 세 DA 관련된 유전자 전 사체의 존재 TH, DOPA 데카 복실 라제 (DDC) 및 도파민 전달체 DAT에 기초하여, 도파민 뉴런 것으로 나타났다 (slc6a3). RNA-서열에 의해 평가로 TH-eGFP는 양성 세포는 모두이 세 가지 유전자를 표명했다. 각각의 단일 셀 RNA-서열 라이브러리에서 6,000 - 8,000 단백질 코딩 유전자 (그림 2) 검출되었다. 도파민 신경 세포는 견고 여러 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 (nAChR을) 서브 유닛 (표 1)에</stron...

파킨슨 병 (PD)에서 Substantia 그라 (SNC) 도파민 신경 세포는 운동 기능 장애로 이어지는, 퇴화. 여기에서 우리는 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-서열을 사용하여 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

이 절차의 전반적인 목표는 티로신 하이드록라아제 주도 eGFP 발현, 단일 세포 수확 및 RNA 염기서열 분석 라이브러리 생성을 사용하여 중뇌 배양에서 살아있는 도파민 뉴런을 안정적으로 식별하는 것입니다. 이 방법은 배양에서 확인된 살아있는 도파민 뉴런에 대한 유전자 발현 및 전기생리학적 분석을 수행할 수 있기 때문에 파킨슨병 및 약물 중독 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 1차 복부 중뇌 배양에서 고정된 도파민 뉴런이 아닌 살아있는 도파민 뉴런을 안정적으로 식별할 수 있는 수단을 제공한다는 것입니다.절차의 첫 번째 부분은 Henry Lester 실험실의 기술자인 Charlene Kim이 시연할 것입니다. 쥐 배아의 머리를 주둥이에 단단히 올려 놓아 등쪽 표면에 접근할 수 있도록 하는 것으로 시작합니다. 다른 손에 든 집게를 사용하여 중뇌의 융기 바로 앞의 피부층과 두개골을 꼬집고 정중선을 따라 피부와 두개골 코델리를 벗겨냅니다.집게를 융기 주위에 놓고 한 쪽 끝은 피질과 중간판 사이에, 다른 쪽 끝은 소뇌 위에 놓습니다. 전체 중뇌를 꼬집어 제거합니다. 중뇌를 페트리 접시에 넣고 차가운 HBSS를 해부 현미경으로 만듭니다.해부 현미경 아래에서 뇌 분절을 뒤집어 이제 복부 쪽에 접근할 수 있도록 합니다. 이제 4개의 사분면이 표시됩니다. 집게로 수막을 부드럽게 잡고 뇌에서 위로 당겨 모든 수막과 혈관 구조를 제거합니다.다음으로, 집게 한 통을 분절의 대략 중앙에 있는 심실에 놓습니다. 그런 다음 중뇌를 분리하기 위해 등쪽을 꼬집은 다음 양쪽을 내측으로 꼬집습니다. 양쪽을 옆으로 잘라서 아래쪽 두 사분면을 취합니다.복부 피개 영역과 substantia nigra pars compacta는 복부 하부 부분에 있으며 조밀하게 보입니다. VTA와 SNC를 모두 포함하는 절개된 조직을 페트리 접시의 별도 영역에 신선한 HBSS에 놓습니다. 모든 뇌 분절을 해부한 후 집게와 숫자 11 메스를 사용하여 각 중뇌 부분을 거의 같은 크기의 조각으로 4등분합니다.그런 다음 넓은 구경의 P1000 피펫 팁을 사용하여 4등분된 모든 중뇌 분절을 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 조직이 가라앉도록 하고 HBSS를 제거한 후 파파인 용액 500마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도의 수조에서 15분 동안 배양합니다.배양 후 넓은 보어 P1000 팁을 사용하여 중뇌 분절만 1밀리리터의 DNase I

reliable-identification-living-dopaminergic-neurons-midbrain-cultures

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

E12.5 murine 배아 midbrain에서 organotypic 조각을 생성하는 방법을 설명합니다. organotypic 슬라이스 문화가 dopaminergic 신경이나 다른 복부 midbrain의 뉴런의 행동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

기능과 midbrain dopaminergic 뉴런의 발달 동안 유전자의 규정을 평가하기 위해 관련된 방법을...

Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

여기에 우리가있는 도파민 (DA) 신경 세포의 연령에 따라 신경 변성을 연구하기 위해 설립 된 두 가지 분석을...

에 신약 표현형을 평가<em&gt; 초파리</em&gt; 등산 분석 실험에 의한 도파민 뉴런과 뇌 전체의 면역 염색

도파민 뉴런은 뇌에서 중요한 조절 역할을 합니다. 그들의 손실은 파킨슨병과 관련이 있습니다. 이 비디오에서는 배아 마우스 중뇌에서 중심 도파민 뉴런의 1차 배양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이러한 배양은 다양한 스트레스에 대한 이러한 뉴런의 극도의 취약성을 연구하는 데 유용합니다.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

파킨슨병 동안 중뇌 도파민성 뉴런의 퇴화 원인은 완전히 이해되지 않았습니다. 세포 배양 시스템은 이러한 뉴런의 신경 생리학적 특성을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다. 여기에서는 신경퇴행의 체외 모델링에 활용할 수 있는 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

배양된 초파리 뇌 외식편에서 정동작 신경줄기세포를 재활성화시키는 방법이 확립되었다. 이 방법을 사용하여, 전신 신호의 역할은 신경 줄기 세포 정지, 출입의 조절에서 조직 내재적 신호로부터 결합되지 않을 수 있다.

배양된 초파리 뇌 외래 식물에서 신경 줄기 세포 재활성화

이 프로토콜은 인간 중뇌 도파민 뉴런의 세포 배양에 이어 면역학적 염색 및 획득된 현미경 high-content 이미지에서 신경 세포 표현형 프로파일 생성을 설명하여 유전적 또는 화학적 조절로 인한 표현형 변이를 식별할 수 있습니다.

인간 줄기세포 유래 중뇌 도파민 뉴런의 표현형 프로파일링

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)은 확장 현미경 검사와 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 결합하여 두꺼운 조직에서 여러 유전자의 발현을 검출하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 이 방법의 최근 발전과 온전한 초파리 중추 신경계를 라벨링하기 위한 적응을 간략하게 설명합니다.

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

본 연구는 다공성 막 삽입물을 이용해 축삭 mRNA를 분리하는 견고한 방법을 제시하여, 전체 뉴런과 신경돌의 분리 및 RNA 정제를 가능하게 합니다. RTddPCR과 결합하여 저복제 전사체의 절대적 정량화를 가능하게 하여, 높은 민감도, 재현성, 광범위한 실험적 적용성을 가진 mRNA 수송 및 국소 번역 연구를 용이하게 합니다.

다공성 막 삽입물과 RTddPCR을 이용한 축삭 mRNA의 분리 및 정량

배우세요 중간뇌 배양에서 TH-프로모터 eGFP를 이용해 생활 도파민 뉴런을 식별하고 RNA 시퀀싱으로 유전자 발현을 분석하는 방법입니다. 파킨슨병 연구에 활용됩니다.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

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