에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구 초파리 난소

이 절차의 전반적인 목표는 모델 유기체인 drosophila melanogaster의 고정 조직뿐만 아니라 살아있는 조직에서 미토콘드리아 구조 및 기능을 연구하는 방법을 시연하는 것입니다. 이 방법은 미토콘드리아 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 미토콘드리아 기능의 조절 메커니즘과 같은.

이 기술의 주요 장점은 미토콘드리아 구조/기능 관계에 대한 자세한 분석을 수행한다는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마취된 암컷 파리 5마리를 분류한 후 해부 현미경으로 두 쌍의 집게를 사용하여 복부에서 흉부를 절단합니다. 그런 다음 복부를 접시의 두 번째 우물로 조심스럽게 옮깁니다.

한 쌍의 집게를 사용하여 복부의 뒤쪽 끝을 잡고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 난소를 천천히 밀어냅니다. 그런 다음 집게를 사용하여 불투명한 뒤쪽 끝으로 개별 난소를 잡고 조심스럽게 접시의 세 번째 구멍으로 옮겨 놀리거나 고정합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 뒤쪽 끝을 잡고 뒤쪽에서 앞쪽 끝으로 놀리는 바늘을 가볍게 쓸어 난소 주변에서 보호 덮개를 조심스럽게 애타게 놀립니다.

폴리리센 코팅된 챔버를 준비하려면 20마이크로리터의 폴리리센 방울 2개를 유리 바닥 페트리 접시의 커버 유리에 놓습니다. 접시를 섭씨 37도에서 1시간 동안 자연 건조하고 접시 아래쪽에 폴리리신의 윤곽을 그립니다. 이미지 획득 소프트웨어를 열어 컨포칼 현미경에서 스캐닝 매개변수를 설정하고 획득 탭에서 적절한 스캐닝 매개변수를 설정합니다.

time series, bleaching 및 regions 상자를 선택하여 개별 탭을 엽니다. 그런 다음 각 탭에 적절한 획득 매개변수 값을 입력합니다. 다음으로, 절개되고 자극된 난소 하나를 표시된 폴리리신으로 코팅된 부위에 놓고 자극 바늘을 사용하여 난소를 벌리고 난소를 분리합니다.

난소 위에 곤충 해부 매체 10마이크로리터 방울을 떨어뜨려 폴리리신으로 코팅된 전체 영역을 덮도록 합니다. 그런 다음 페트리 접시를 덮습니다. 난소를 장착한 직후 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 접안렌즈를 사용하여 살아있는 조직에서 관심 영역을 빠르게 찾습니다.

Live(라이브)를 클릭하여 선택한 관심 필드의 라이브 이미지를 획득한 다음 Stop(중지)을 클릭하여 라이브 스캔을 중지합니다. 필요한 경우, 검출된 형광 신호가 오프셋 값을 조정하여 설정된 대로 정의된 배경의 포화 수준 미만이 되도록 획득 매개변수를 조정합니다. 그래픽 탭에서 베지어 그리기 도구를 사용하여 스캔으로 획득한 이미지의 사진 표백 영역을 구분하는 작은 ROI를 그립니다.

그런 다음 실험 시작을 클릭하여 이미지 획득을 수행합니다. 형광 미토콘드리아 염료로 생염색을 수행하려면 염색 스톡을 따뜻한 해부 매체에서 최종 작업 농도로 희석합니다. 해부와 놀림이 앞서 시연된 후, 난소를 200마이크로리터의 염색 용액에 넣어 해부 접시의 우물에 넣습니다.

접시를 알루미늄 호일로 감싼 상자로 덮어 빛으로부터 보호하고 10 분 동안 조직을 배양합니다. 다음으로, 겸자를 사용하여 염색된 난소를 세척하여 얼룩이 없는 배지가 포함된 3개의 연속 웰로 조심스럽게 이동합니다. TMRE와 함께 염색하기 위해, 호환 가능한 전체 미트로콘드리아 염색에서 먼저 TMRE로 염색한 다음 조직을 세척하지 않고 샘플을 전체 미토콘드리아 염색으로 즉시 옮깁니다.

이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 난소를 세척하고 장착한 후 샘플에 대한 컨포칼 이미징을 수행하려면 z-sectioning 상자를 선택하여 탭을 엽니다.라이브 스캔하는 동안 초점 휠을 샘플의 아래쪽으로 돌리고 set-first를 클릭하여 가장 아래쪽 z-section을 정의합니다. 그런 다음 초점 휠을 반대 방향으로 이동하여 맨 위 섹션을 정의합니다.

실험 시작을 클릭하여 이미지 획득을 수행합니다. 생체 xvivamicroscopy의 경우 조직 장착 후 15분 이내에 데이터를 얻어야 하며, 그렇지 않으면 조직의 사멸로 인한 생리학적 변화의 영향을 실험 결과에 영향을 받을 수 있습니다. 흄 후드 아래에서 해부 직후, 난소를 유리 해부 접시의 우물에 200마이크로리터의 신선한 실온 PFA에 넣습니다.

조직을 고정하기 위해 15분 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 PBS에서 난소를 세척한 후 PBS에 있는 동안 난소를 자극하여 항체의 항원 접근을 방해할 수 있는 보호 섬유 덮개를 조심스럽게 제거합니다. 티징된 난소를 500마이크로리터의 0.5% 트리탄 x 100 PBS가 있는 마이크로퓨즈 튜브에 넣어 투과시킵니다.

다음으로, 튜브를 덮개가 있는 상자에 넣고 25분 동안 30RPM으로 흔들리도록 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 PBS/TX를 제거하고 0.5% PBS/TX에 용해된 200마이크로리터의 BSA를 첨가하여 조직을 차단합니다. 로커에서 샘플을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

차단 용액을 제거한 후 항광견병 데시클라인 E와 항마우스 ATPB 항체를 첨가합니다. 로커의 조직을 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 PBS-TX를 사용하여 난소를 각각 15분씩 3회 세척합니다.

그런 다음 200마이크로리터의 적절한 2차 항체와 새로운 PBS-TX를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 티슈를 두 번 씻은 후 세 번째 씻기에 고리를 추가하십시오. 그런 다음 1밀리리터 마이크로피펫으로 마이크로퓨즈 튜브에서 면역 염색된 난소를 200마이크로리터의 PBS가 들어 있는 유리 해부 접시의 새 웰로 제거합니다.

글리세롤 기반 장착 배지 한 방울을 유리 슬라이드에 추가하고 면역 염색 난소를 장착 배지에 하나씩 추가합니다. 해부 현미경으로 집게로 난소의 불투명한 부분을 잡고 놀리는 바늘을 사용하여 불투명한 성숙한 난자실에서 투명한 난소를 부드럽게 뽑아냅니다. 그런 다음 장착 매체에서 성숙한 난자를 제거합니다.

슬라이드에 커버 유리를 놓고 가볍게 눌러 장착 매체가 균일하게 퍼지도록 합니다. 매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉하기 전에 샘플을 15분 동안 자연 건조하십시오. 마지막으로 필요에 따라 컨포칼 현미경 검사를 수행합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, nerse 세포와 관련된 미토콘드리아 구름 중 하나를 대상으로 한 플립은 200초 이내에 빨간색 플립 ROI를 둘러싼 파란색 및 흰색 ROI의 형광 신호의 50% 이상 손실로 이어지는 반면 노란색 제어 ROI는 최소 표백됩니다. drosophilla 난소는 조직의 깊이에 따라 신호의 감소를 보였으며, TMRE 및 mitostain과 같은 phlorophores가 라이브 이미징 중에 검출될 수 있는 조직의 최대 깊이를 식별하는 것이 중요합니다. TMRE와 함께 염색하고 전체 미토콘드리아 염색을 통해 정성적으로 분석한 결과, drisophilla germarium은 2B단계에서 단위 질량당 더 높은 미토콘드리아 전위를 나타냅니다.

이 그림에서 반정성적 분석은 9단계 난실에서 분석된 AFC와 MBC 간의 단위 질량당 미토콘드리아 전위의 차이를 보여줍니다. 이 이미지는 유사분열 및 유사분열 후 drisophilla 여포 세포에서 유사분열 흡수가 발생한다는 것을 보여줍니다. 이 실험에서 co-immuno 염색은 Germarium 및 9기 난실에서 미토콘드리아 ATPB 신호 및 GFP 음성 DRP1 nole 클론과 겹치는 상승된 데사이클린 신호를 식별합니다.

설명된 방법은 다른 drisophilla 조직에서 미토콘드리아 구조 기능을 연구하기 위해 수정되어 사용될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 미토콘리아 구조와 기능을 연구하기 위해 고정된 살아있는 drisophilla 난소를 절개, 염색 및 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.