검출 실험 프로토콜 시아 노 박테리아 항체 마이크로 어레이 칩과 액체 및 고체 시료에

이 절차의 전반적인 목표는 형광 마이크로어레이 면역 분석을 사용하여 액체 및 고체 샘플에서 여러 시아노박테리아 균주의 존재를 확인하는 것입니다. 이 방법은 백화가 육안으로 보이기 전에 원독소를 생성하는 박테리아를 생성하는 독소의 존재와 같은 환경, 모니터링 및 수질 관리 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 시아노박테리아 균주와 여러 샘플을 현장 또는 실험실에서 3, 4시간 동안 동시에 모니터링할 수 있다는 것입니다.

따라서 이러한 방법은 생물 다양성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 농업 시설 모니터링, 긴장 환경에서의 생명체 감지 또는 행성 탐사와 같은 다른 분야에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 어려움을 겪지 않을 것입니다.

샘플 처리가 간단하고 결과를 더 쉽게 해석할 수 있기 때문입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 항체를 생산 및 정제한 후 100마이크로리터의 DMSO를 라벨링용 염료가 들어 있는 상용 바이알에 단백질 1mg을 추가합니다. 염료가 용해되면 각 항체 제제 50마이크로리터에 2마이크로리터의 염료를 첨가하여 정제된 항체에 라벨을 부착합니다.

진동 플랫폼에서 1시간 동안 연속 교반하에서 상온에서 라벨링 반응을 유지합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 라벨링된 항체를 정제한 후 작은 부분 표본을 분광 광도계에 로드하고 280 및 650 나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 공급업체 권장 사항에 따라 라벨링 효율성을 계산합니다.

CYANOCHIP을 만들려면 Tween 20 부피당 01% 부피로 1X 단백질 인쇄 버퍼에 1밀리리터당 1밀리그램의 항체를 혼합하여 각 정제된 항체 30마이크로리터를 준비합니다. 다음 인쇄 용액 30마이크로리터를 대조군으로 준비합니다. Tween 20 부피당 부피가 01%인 1X 단백질 프린팅 버퍼.

각 단백질 A는 01%Tween 20이 있는 1X 단백질 인쇄 버퍼와 BSA 밀리리터당 1밀그램 및 01%Tween 20이 있는 1X 단백질 인쇄 버퍼에서 밀리리터당 1밀리그램의 정제된 전면역 혈청입니다. 준비된 인쇄 용액의 웰당 30마이크로리터를 고품질 384웰 마이크로플레이트에 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 인쇄 로봇과 슬라이드 기판을 설정한 후, 약 180-200 미크론 스폿 직경의 삼중 스폿 패턴으로 슬라이드에 대한 모든 항체와 제어 장치를 스폿합니다.

환경에서 샘플링하려면 멸균 주사기를 사용하여 1-100ml의 액체를 수집하고 샘플을 3미크론 공극 크기 필터에 통과시켜 세포를 농축합니다. 필요한 경우 암석이나 토양에서 고체 샘플을 채취하여 멸균 튜브에 보관합니다. 샘플은 소규모 현장 실험실에서 분석할 수 있습니다.

1ml의 추출 배양 버퍼를 추가하여 필터에 수집된 바이오매스를 회수하고 주걱을 사용하여 필터를 15ml 튜브로 긁어냅니다. 휴대용 초음파 처리기를 사용하거나 여러 번 위아래로 피펫팅하여 시료를 응집하고 균질화합니다. 또한 별도의 10ml 튜브에 최대 0.5g의 고체 시료를 넣고 최대 2ml의 추출 버퍼를 추가합니다.

초음파 발생기 프로브를 튜브에 담그고 휴대용 초음파 처리기 또는 기타 초음파 처리 장치로 초음파 처리합니다. 샘플을 얼음 위에 유지하면서 30 킬로 헤르츠에서 30 초 사이클을 5 회 이상 수행하고 초음파 처리 사이에 30 초 동안 멈 춥니 다. 면역 분석을 위한 여과액 추출물을 준비하려면 5-20미크론 공극 크기의 나일론 필터 홀더에 결합된 10ml 주사기를 사용하여 용액을 1.5ml 튜브로 여과하여 모래, 점토 및 기타 거친 물질을 제거합니다.

마이크로어레이 스폿이 아래를 향하게 하여 슬라이드를 100-200마이크로리터의 차단 용액 방울에 놓고 3-5분 동안 배양합니다. 끝이 비닐로 된 집게를 사용하고 마이크로어레이 영역을 피하면서 슬라이드를 조심스럽게 집어 올립니다. 슬라이드를 새로운 차단 용액에 담그고 30분 동안 약한 교반으로 슬라이드를 배양합니다.

슬라이드를 건조시키려면 현미경 슬라이드에 적합한 원심분리기에 넣고 짧게 회전시킵니다. 공급자의 지시에 따라 3 x 8 웰 마이크로어레이 혼성화 카세트에 슬라이드를 설정합니다. 또는 항체 인쇄 패턴을 수정한 후 여기에 표시된 것과 같은 맞춤형 카세트를 설정하거나 단순히 커버 슬라이드를 사용하여 설정합니다.

슬라이드 및 카세트 조립 후, 각 샘플을 최대 50마이크로리터까지 피펫으로 추출하거나 추출 배양 버퍼에서 카세트의 각 웰로 희석합니다. 또는 다른 배양 장치에 샘플을 로드하거나 커버 슬라이드를 사용할 수 있습니다. 블랭크 컨트롤로, 50 마이크로 리터의 TBSTRR 버퍼를 카세트의 적어도 두 개의 별도 웰에 피펫팅합니다.

샘플을 상온에서 1시간 동안 배양하고 15분마다 피펫팅하여 혼합하거나 섭씨 4도에서 12시간 동안 배양합니다. 마이크로어레이를 세척하려면 카세트를 내려놓고 깨끗한 흡수성 종이에 조심스럽게 두드립니다. 그런 다음 각 웰에 150마이크로리터의 추출 배양 버퍼를 추가하여 웰을 세척하고 이전과 같이 흡수 종이를 두드려 버퍼를 제거합니다.

세탁을 세 번 더 반복합니다. 각 웰에 17개의 항시아노박테리아 균주 항체를 포함하는 형광 항체 혼합물 50마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 상온에서 1시간 동안 또는 섭씨 4도에서 12시간 동안 배양합니다.

마이크로어레이를 세척하려면 카세트를 조심스럽게 내려놓고 깨끗한 흡수성 종이에 부드럽게 두드립니다. 그런 다음 150마이크로리터의 추출 배양 버퍼를 추가한 후 종이 타월로 두드려 제거합니다. 세탁을 세 번 반복합니다.

그런 다음 카세트를 분해하고 슬라이드를 0.1X PBS 용액에 담그면 빠르게 헹굴 수 있습니다. 슬라이드를 건조시키기 위해 이전과 같이 빠르게 원심분리기를 합니다. 형광 스캐너를 사용하여 원적색 형광 염료의 최대 방출 피크에서 형광을 찾기 위해 슬라이드를 스캔합니다.

이득 값을 변경하여 서로 다른 스캐닝 매개변수에서 마이크로어레이의 여러 이미지를 촬영합니다. 마지막으로, 그리드를 로드하고 정량화한 다음 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 처리 및 분석합니다. 이 비디오에서 시연된 CYANOCHIP 다중 면역분석법은 이 표에 나열된 대로 가장 관련성이 높은 담수 시아노박테리아 종의 동시 식별을 테스트하는 데 사용되었습니다.

담수 저수지의 해안에서 수집된 물 샘플은 마이크로어레이 분석을 사용하여 분석되었습니다. 주요 양성 면역 반응은 플랑크톤 시아노박테리아 마이크로시스티스 종 및 저서 렙톨링비아 종에 대한 항체에 해당했습니다. planktonic nostocales aphanizomenon 종, anabaena 종, microcystis flos-aquae 및 저서 rivularia 종에 대해 더 낮은 형광 신호를 얻었습니다.

마이크로어레이는 또한 시아노박테리아 마커의 존재를 테스트하기 위해 남극 건조 미생물 매트를 분석함으로써 검증되었습니다. 항체의 긍정적 인 반응은 저서 시아 노박테리아, anabaena 종 및 leptolyngbya 종에 생성되었습니다. microcystis 종, aphanizomenon 종 및 planktothrix rubescens 종과 같은 플랑크톤 시아노박테리아에 대한 항체에서 추가 양성 면역 반응이 검출되었습니다.

마지막으로, 이러한 신호는 톨리포트릭스(tolypothrix) 종과 아나바에나(anabaena) 종을 포함한 다른 저서 종에 대한 항체로부터 얻어졌다. 일단 숙달되면 이 기술은 항체 생성 및 레벨링을 제외하고 적절하게 수행된다면 3-4시간 내에 완료할 수 있습니다. 표본의 동시 외피, 및 형광성 항체에 의하여, 득점방해 1 시간일 수 있습니다.

이러한 절차를 시도하는 동안 형광 항체 혼합물이 항체가 최적의 작동 희석으로 준비되도록 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 절차에 따라 광학 현미경 검사 또는 DNA 추출 및 특정 PCR 증폭과 같은 다른 방법을 수행하여 토양 농도와 같은 추가 질문에 답하거나 검출된 균주 유형을 확인할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 환경 모니터링 분야의 연구자들이 샘플의 유형에 관계없이 이중 배양 공정, 담수 관리 또는 미생물 생태학 연구에서 수역을 탐구할 수 있는 길을 열 것입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 형광으로 항체를 라벨링하고, 항체 마이크로어레이를 조작하고, 멀티플렉스 면역분석을 수행하고, 마이크로어레이 면역분석 결과를 분석 및 해석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 초음파 작업은 위험할 수 있으므로 이러한 절차를 수행하는 동안 귀 보호 장치 착용 또는 기타 특정 관리 조치와 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.