낮은 밀도 차 해마 신경 세포 문화

본 프로토콜은 Gary Bunker 박사와 동료들에 의해 처음 발표되었으며, 신경세포를 글리아 필터 층 위에 부유시켜 배양함으로써 배아 해마 신경세포의 저밀도 및 고순도 배양을 가능하게 합니다. 이러한 결과는 오염된 글리아 세포가 거의 없는 상태에서 신경세포를 저밀도로 성장시킬 수 있기 때문에, 다른 해마 관련 연구 결과들과 차별화됩니다. 따라서 이 방법은 배양된 성숙한 신경세포의 고해상도 이미징 및 기능적 분석에 이상적입니다.

본 프로토콜의 사후 숙성 과정은 새로운 생명체의 적응을 촉진할 것입니다. 절차 중에 설명하기 어려운 몇 가지 핵심 상태들이 존재하므로, 단계별로 안내해 드립니다. 이 프로토콜은 고품질의 일차 뉴런 배양에 필요한 세 가지 독립적인 개체군으로 구성됩니다. 이러한 과정에는 글리아 세포 배양, 커버스립 제작 및 코팅, 그리고 해마 신경 세포의 준비가 포함됩니다.

우선, 서면 프로토콜에 설명된 대로 생후 초기 쥐의 피질 조직을 확보해야 합니다. 여기에서 직접적으로 보여주지는 않지만, 본 프로토콜의 후반부에 나오는 박리 단계는 피질 박리에 사용되는 단계와 거의 동일하다는 점에 유의하십시오. 이러한 이유로, 이후 비디오에서 보여줄 해마 박리 과정 중에 관련 단계들을 강조하여 설명하겠습니다.

서면 프로토콜의 단계 6부터 시작하여, 수집된 피질 조직에서 HBSS를 제거한 다음 가위를 사용하여 조직을 가능한 한 잘게 다집니다. 다진 조직을 50 milliliter 원심 분리 튜브로 옮길 수 있을 만큼의 HBSS를 추가하고, HBSS를 더해 전체 부피를 12 milliliters로 맞춥니다. 2.5% trypsin과 10 milligram per milliliter DNA 용액을 각각 1.5 milliliters씩 추가하고, 튜브를 뒤집어 섞은 후, 결과 혼합물을 37 degree Celsius 항온수조에서 12분 동안 배양합니다.

유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 10~15회 분쇄한 다음, 항온수조에서 3분 더 배양합니다. 모든 조직 조각이 튜브 바닥에 가라앉았는지 확인한 후, 상층액을 5 mL의 BGS가 담긴 50 mL 원심분리 튜브에 여과하여 옮깁니다. 소화되지 않은 조직 조각이 남아 있는 튜브에 13.5 mL의 HBSS와 1.5 mL의 2.5% trypsin을 넣고, 뒤집어 섞은 다음 항온수조에서 10분 더 배양합니다.

배양 후, 남은 조직을 10~15회 삼출하고, 이를 처음의 여과액이 들어 있는 튜브에 여과합니다. 다음으로, 3 mL의 BGS를 추가로 통과시켜 필터를 헹굽니다. 이 단계에서 여과액을 여러 개의 튜브로 나누어 펠렛 세포의 균형 맞추기와 재현탁 과정을 간소화할 수 있습니다.

현탁액을 130 G에서 6분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 혈액 성분의 존재로 인해 펠릿의 바닥 부분이 약간 붉게 보임을 확인하십시오. 상층액을 제거한 다음, 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 각 튜브에 glial medium 1 milliliter를 첨가합니다. 붉은색을 띠지 않는 각 펠릿 부분을 새로운 50 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다.

결합된 조직을 재현탁하기 위해 새끼 한 마리당 최대 2 milliliters의 글리아 배지를 추가하고, 현탁액 2 milliliters를 75 centimeter squared 배양 플라스크에 담긴 37 degrees Celsius로 예열된 글리아 배지 18 milliliters로 옮깁니다. 플라스크를 37 degrees Celsius, 5%CO2 인큐베이터에서 배양합니다. 세포 파종 다음 날, 각 플라스크의 배지를 신선한 글리아 배지로 교체합니다.

현재 단계에서 배양물은 성상교세포와 다른 비표적 세포 유형이 혼합된 상태임에 유의하십시오. 성상교세포가 아닌 세포 유형을 제거하려면, 세포를 파종한 후 약 4일 뒤에 플라스크를 강하게 흔들어주어야 합니다. 이를 위해 플라스크를 HBSS로 헹군 다음, 각 플라스크에 신선한 HBSS 10 milliliters를 넣고 각각 5~10회 세게 흔드십시오.

HBSS를 흡입하여 제거하고, HBSS로 두 번 더 헹굽니다. 그런 다음 glial medium 20 milliliters를 첨가하고, 이전과 같이 플라스크를 인큐베이터에 넣습니다. 이 과정이 격렬하게 이루어지지만, 배양하려는 성상교세포는 플라스크 표면에 강하게 부착된 상태로 유지된다는 점에 유의하십시오.

성상교세포 배양을 유지하려면 세포가 완전히 밀집될 때까지 일주일에 두 번 신선한 glial medium으로 배지를 교체하십시오. 세포가 완전히 밀집되면 서면 프로토콜에 기술된 대로 향후 사용을 위해 세포를 동결 보관할 수 있습니다. 글리아 세포는 서면 프로토콜에 기술된 대로 뉴런 배양 시작 최소 14일 전에 디쉬에 접종해야 합니다.

커버슬립을 진한 질산에 담그고 실온에서 30분 동안 초음파 처리합니다. 진한 질산은 부식성이 매우 강하므로 주의하십시오. 일부 실험실에서는 세라믹 염색 랙을 사용하여 커버슬립을 질산에 하룻밤 동안 담가두는 방법을 선호하기도 합니다.

기관 지침에 따라 화학 흄 후드에서 질산을 조심스럽게 폐기한 다음, 커버슬립을 탈이온수로 3회 헹굽니다. 커버슬립을 물에 담그고 30분 동안 다시 초음파 세척합니다. 그다음, 물을 제거하고 커버슬립을 다시 3회 헹굽니다.

커버슬립을 50밀리리터의 물에 담근 후 오토클레이브로 멸균한다. 무균 층류 후드 내에서 물을 제거하고, 세척을 위해 에탄올 20~30밀리리터를 첨가한다. 에탄올 20~30밀리리터를 추가로 넣은 다음, 커버슬립과 에탄올을 100밀리리터 페트리 접시에 옮긴다.

뭉뚝한 핀셋을 사용하여 염색된 커버글라스를 60 mL 페트리 접시에 접시당 4~5장씩 옮긴 후, 커버글라스를 접시 가장자리에 기대어 공기 중에서 건조시킵니다. 에탄올이 증발하면 커버글라스를 다시 수평 상태로 눕힙니다. 내열 유리병에 파라핀 10 g을 넣고 녹인 후, 약 150~200 °C로 유지합니다.

최적의 온도를 맞추기 위해 약간의 조정이 필요할 수 있으며, 온도가 부적절하면 적절한 크기의 파라핀 발(paraffin feet)을 만드는 데 어려움이 있을 수 있습니다. 파스퇴르 피펫을 파라핀에 담근 후, 각 커버슬립의 가장자리 근처 세 곳에 빠르게 접촉시킵니다. 파라핀 방울은 높이 약 3~5 mm, 직경 1~2 mm의 구슬 형태로 응고되며, 이는 커버슬립 위의 뉴런과 그 아래의 글리아 단일층(glial-mono layer) 사이에 공간을 제공하는 역할을 합니다.

파라핀 지지대가 부착된 미리 준비된 커버슬립이 들어 있는 디쉬를 준비합니다. 각 커버슬립 표면에 poly-l-lysine과 붕산염 완충액 200 µL를 첨가하고, 실온에서 덮개를 덮은 상태로 하룻밤 동안 그대로 둡니다. 코팅할 표면은 파라핀 비즈가 위치한 표면과 동일해야 합니다.

적절하게 세척되었다면, poly-l-lysine이 커버슬립 표면을 덮도록 쉽게 퍼져야 합니다. 다음 날 아침, 커버슬립을 멸균수에 각각 2시간씩 두 번 담가 세척합니다. 마지막 세척 후, 물을 디쉬당 4 milliliters의 플레이팅 배지로 교체합니다.

poly-L-lysine으로 코팅한 후 커버슬립의 표면이 마르지 않도록 하는 것이 중요합니다. 커버슬립 디쉬를 37 °C 인큐베이터에 넣으십시오. 코팅된 커버슬립은 뉴런 배양을 시작하기 전 최소 24시간 동안 인큐베이션해야 합니다.

임신 18일 또는 19일째의 쥐를 준비하여 승인된 방법으로 안락사시킵니다. 쥐의 복부 아래쪽에 70% ethanol을 분무한 후, 치골 부위부터 복강 끝까지 정중선 절개를 실시합니다. 오염을 방지하기 위해, 이 단계에서는 피부만 절개하도록 주의하십시오.

70% ethanol을 사용하여 해부 도구를 멸균한 후, 복벽을 절개하여 자궁을 노출시킵니다. 두 개의 자궁각을 제거하여 멸균 접시에 담습니다. 멸균 라미나 플로우 후드 내에서 태아를 둘러싸고 있는 자궁막을 제거한 다음, 태아의 머리를 절단하여 20 mL의 HBSS가 담긴 100 mm 페트리 접시에 넣습니다.

뇌를 적출하여 즉시 얼음 위에 놓인 2 mL의 HBSS가 담긴 60 mm 페트리 접시에 넣습니다. 다음 단계를 위해 충분한 공간을 확보할 수 있도록 접시당 2~3개의 뇌만 수집합니다. 해부 현미경 하에서 대뇌 반구의 정중선으로부터 뇌수막을 제거합니다.

다음으로, 해마를 절제합니다. 해마는 대뇌 피질 반구의 내측 표면에서 초승달 모양의 구조물로 구별할 수 있으며, 외측이 뇌실과 맞닿아 있어 쉽게 제거할 수 있습니다. 분리한 해마는 4.5 milliliters의 HBSS가 담긴 60 millimeter 페트리 접시에 넣고 얼음 위에 보관합니다.

지금까지 수행한 단계들은 피질 박리 과정에도 동일하게 적용되나, 해마 대신 피질을 보관한다는 점이 다릅니다. 피질 박리의 경우, 다음 단계는 여기에서 보여주는 것처럼 피질을 뇌의 나머지 부분과 분리한 다음, 앞서 보여준 것과 같이 피질과 HBSS를 수집하는 것입니다. 모든 해마 조직을 HBSS에 수집했다면, 이를 15 milliliter 원심분리관으로 옮기십시오.

2.5% trypsin 5 milliliters를 첨가한 후, 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 튜브 바닥의 해마 조직이 흐트러지지 않도록 주의하며 파스퇴르 피펫으로 trypsin 용액을 조심스럽게 제거합니다. HBSS 5 milliliters를 조심스럽게 첨가하여 37°C에서 5분 동안 배양한 후, 다시 파스퇴르 피펫으로 제거하는 과정을 두 번 반복하여 조직을 세척합니다. 이때 바닥의 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.

앞서 설명한 배양 단계가 진행되는 동안, 조직 해리를 위해 화염 연마된 피펫 두 가지 유형을 준비합니다. 이를 위해 유리 파스퇴르 피펫의 끝부분을 화염에 짧게 노출시킨 후, 피펫 끝의 상태를 확인합니다. 첫 번째 유형의 경우, 피펫 끝의 가장자리가 매끄러워질 때까지 이 단계를 반복하되, 직경은 변하지 않도록 합니다.

두 번째 세척의 경우, 가장자리가 매끄러워지고 팁의 직경이 약 절반으로 줄어들 때까지 반복합니다. 세포가 손상되지 않으면서도 단일 세포로 해리될 수 있도록 하는 이상적인 직경을 찾기 위해 충분히 연습하는 것이 중요합니다. 두 번째 세척 후, 조직에 적당량의 HBSS를 첨가하여 총 부피를 5 milliliters로 맞춥니다.

먼저 매끄러운 가장자리의 일반 피펫으로 해마 조직을 약 10회 통과시켜 분쇄한 다음, 팁 직경이 작은 피펫으로 5~10회 더 통과시킵니다. 이때의 목표는 조직 덩어리가 없거나 매우 적은 균질한 세포 현탁액을 얻는 것입니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 밀도를 측정합니다.

일반적인 수득량은 마리당 약 800,000에서 1,000,000개의 세포입니다. 의도한 실험에 따라 60 millimeter 디쉬당 100,000에서 500,000개의 세포 도말 밀도를 얻을 수 있도록, 4 milliliters의 도말 배지가 들어 있고 poly-l-lysine이 코팅된 커버슬립이 포함된 디쉬에 적절한 부피의 세포 현탁액을 옮깁니다. 디쉬를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에 넣습니다.

3~4시간 후, 뉴런이 부착된 커버슬립을 글리아 세포와 NBG 배지가 들어 있는 디쉬로 옮깁니다. 이때 뉴런이 플레이팅된 면이 글리아 세포 층을 향하도록 아래쪽으로 놓아야 합니다. 글리아 디쉬 하나당 총 4~5개의 커버슬립을 넣습니다.

플레이팅 2~3일 후, 글리아 세포의 성장을 억제하기 위해 디시당 최종 농도가 5 µM이 되도록 aerocele 용액을 첨가합니다. 매주 한 번씩 기존 배지 2 mL를 신선한 배지 2.5 mL로 교체하여 세포에 영양분을 공급합니다. 추가로 첨가된 배지는 시간이 지남에 따라 발생하는 증발량을 보충하기 위한 것입니다.

글리아 세포에 의해 배지가 일관되게 컨디셔닝되도록 배지의 일부만 교체합니다. 이러한 배양물은 일반적으로 최소 한 달 동안 건강한 상태를 유지합니다. 뉴런은 4%paraformaldehyde로 고정시킨 후, 형광 이미징을 위해 1차 항체에서 배양하였습니다.

Tau 및 MAP2 면역 염색에서 확인된 바와 같이, 이러한 뉴런들은 잘 발달된 축삭과 수지상 돌기를 통해 광범위한 분지화를 형성합니다. 성숙한 뉴런은 또한 Drebrin One의 선택적 국소화로 확인되는 시냅스 가시를 형성하며, 이는 synapse in one 면역 염색으로 확인된 시냅스 전 특수 구조와 밀접하게 마주 보고 있습니다. 이러한 일차 뉴런은 신호 전달, 뉴런의 극성, 세포 내 수송, 시냅스 발달 및 가소성 연구 등을 포함하여 뉴런과 시냅스의 기능적 및 구조적 연구에 매우 적합합니다.

이 영상은 본 프로토콜의 몇 가지 핵심 단계들을 이해하고 정확하게 수행하는 데 도움을 줄 것입니다. 설명된 방법을 적절히 준수하면 광범위한 수지상 돌기 분지와 형태적 및 기능적으로 잘 발달된 시냅스를 가진, 건강하고 밀도가 높은 신경세포 배양 결과를 얻을 수 있습니다.