본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

이 방법론의 전반적인 목표는 사례 연구로 타우 단백질을 사용하여 핵 자기 공명 분광법(nuclear magnetic resonance spectroscopy)을 통해 본질적으로 무질서한 단백질의 다중 인산화를 식별하는 것입니다. 이 방법은 분자 파트너와의 단백질 상호 작용에 대한 인산화의 영향과 같은 질병과 관련된 분자 조절의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 무질서한 단백질에서 부위 특이적 인산화를 식별하고 이를 구조적 및 기능적 변화와 연결할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 함수에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 aPtc 바이러스에서 DNA 단백질의 무질서한 잔해와 같은 다른 단백질에도 적용할 수 있습니다.이 기술의 적용은 단백질, 단백질 상호 작용 억제제의 개발에 의한 치료로 확장됩니다. 이 방법은 우리 그룹의 박사 과정 학생인 Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa 및 Hamida Merzougui에 의해 시연될 것입니다.

먼저 50마이크로리터의 유능한 BL21 세포와 100나노그램의 플라스미드 DNA를 부드럽게 혼합하여 1.5밀리리터의 플라스틱 튜브에 혈장 DNA 마이크로그램당 1,000만-1,500만 개의 콜로니를 형성합니다. 세포 혼합물을 얼음 위에 30분 동안 놓은 후 섭씨 42도에서 10초 동안 열 충격을 가합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 다시 5분 동안 놓고 실온 Luria Bertani 또는 LB 배지 1ml를 추가합니다.

박테리아 현탁액을 섭씨 37도에서 부드러운 교반 하에서 30분 동안 배양합니다. 스프레더를 사용하여 100마이크로리터의 세포 현탁액을 암피실린 항생제 1밀리리터당 100마이크로그램이 들어 있는 LB 배지의 한천 플레이트에 고르게 펴 바릅니다. 섭씨 37도에서 15시간 동안 선택 플레이트를 배양합니다.

다음으로, 질소 15 및 탄소 13 강화 배지 300mg, 질소 15 염화암모늄 1g 및 탄소 13 표지 포도당 2g을 M9 배지 10ml에 용해시킵니다. 필터는 0.2 미크론 필터를 사용하여 동위원소 용액을 M9 매체로 직접 멸균합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램이 보충된 20밀리리터의 LB 배지에 있는 선택 플레이트에서 재조합 혈장 형질전환균의 한 콜로니를 현탁시킵니다.

접종된 배지를 섭씨 37도에서 약 6시간 동안 배양합니다. 플라스틱 분광계 큐벳에서 박테리아 배양을 10배 희석한 1밀리리터를 사용하여 600나노미터 또는 OD600에서 광학 밀도를 측정합니다. 그런 다음 2리터의 삼각마이어 유리 배플 배양 플라스크에 암피실린이 보충된 1리터의 M9 성장 배지에 20ml의 포화 LB 배양을 추가합니다.

배양 플라스크를 섭씨 10도 및 50RPM으로 설정된 프로그래밍 가능한 인큐베이터에 놓습니다. 다음 날 이른 아침에 인큐베이터가 200RPM 및 섭씨 37도로 전환되도록 프로그래밍합니다. 플라스틱 분광계 큐벳에서 1ml의 박테리아 배양액에서 OD600을 측정합니다.

OD600이 약 1.0의 값에 도달하면 400마이크로리터의 1몰 IPTG 원액을 첨가하여 재조합 타우 단백질의 발현을 유도합니다. 세균성 세포를 37°C에서 추가로 3시간 동안 배양한 후 20분 동안 5, 000회 g에서 원심분리하여 수집합니다. 박테리아 세포 펠릿을 해동하고 45ml의 양이온 교환 완충액 A에 완전히 재현탁하고 1x 프로테아제 억제제 칵테일 DNasel 1을 새로 보충합니다.

20, 000 PSI에 고압적인 균질화기를 사용하여 세균성 세포를 분열시키십시오, 3개에서 4개의 통행은 충분하게 세포를 분열시키게 필요합니다. 20, 불용해성 물자를 제거하기 위하여 40 분 동안 000 시간 g에 붕괴된 세포를 분리기로 만드십시오. 수조를 사용하여 박테리아 세포 추출물을 섭씨 75도에서 15분 동안 가열합니다.

몇 분 후에 흰색 침전물이 관찰됩니다. 다음, 15, 20 분 동안 000 시간 g에 가열된 추출물을 분리기하고 열 안정되어 있는 타우 단백질을 포함하는 상등액을 지키십시오. 다음으로, 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 5ml 베드 컬럼으로 충전된 강력한 CEX 수지에서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행합니다.

유속을 분당 2.5밀리리터로 설정하고 CEX A 버퍼에서 컬럼을 평형화합니다. 다음으로, 샘플 펌프를 사용하여 60-70밀리리터의 가열된 타우 추출물을 로드하고, 타우 단백질이 수지에 효율적으로 결합하고 있는지 확인하기 위해 분석을 위해 플로우 스루를 수집합니다. 280나노미터의 흡광도가 기준선 값으로 돌아올 때까지 CEX A 버퍼로 수지를 세척합니다.

10개의 컬럼 부피에서 최대 25%CEX B 버퍼의 그래디언트로 FPLC를 프로그래밍하여 250밀리몰의 염화나트륨에 도달합니다. 500 밀리몰 염화나트륨에 도달하기 위해 5개의 컬럼 부피에 50%CEX B 버퍼를 사용합니다. 마지막으로, 두 개의 컬럼 볼륨에서 그래디언트를 100% CEX B 버퍼로 증가시켜 1몰 염화나트륨에 도달합니다.

용리 단계에서 1.5ml 분획을 수집합니다. 그런 다음 풀링된 분획을 포함하는 타우에 대해 완충 교환을 수행합니다. FPLC 시스템을 사용하여 15밀리몰 중탄산암모늄 완충액에 53ml G25 수지로 충전된 베드와 탈염 컬럼을 평형

유속을 분당 5ml로 설정하고 5ml 주입 루프를 통해 컬럼에 타우 샘플을 주입합니다. 280 나노미터에서 흡수 피크에 해당하는 분획을 수집합니다. 샘플을 튜브에 할당하기 전에 모든 타우 분획을 풀링합니다.

용액의 부피가 튜브의 부피에 비해 작도록 이 튜브를 선택하십시오. 다음으로, 나중에 동결 건조를 위해 타우 샘플을 섭씨 영하 80도에서 동결하기 전에 바늘을 사용하여 튜브 캡에 구멍을 뚫습니다. 400마이크로리터의 NMR 완충액에 4mg의 동결건조된 질소 15 및 탄소 13이 풍부한 erk 인산화 타우를 가용화합니다.

NMR 분광계의 자기장 잠금을 위해 5% 중수소 산화물을 추가하고 내부 NMR 신호 기준으로 1밀리몰 TMSP를 추가합니다. 또한 완전한 프로테아제 억제제 칵테일의 40EK 스톡 용액 10마이크로리터를 추가합니다. 긴 바늘이 있는 전자 주사기를 사용하거나 파스퇴르 피펫을 사용하여 5ml NMR 튜브에 샘플을 옮깁니다.

플런저를 사용하여 NMR 튜브를 닫습니다. 플런저를 움직여 플런저와 액체 사이에 갇힌 기포를 제거합니다. NMR 튜브를 스피너에 놓습니다.

적절한 게이지를 사용하여 대부분의 샘플 솔루션이 NMR 코일 내부에 있도록 스피너에서 수직 위치를 조정합니다. 그런 다음 Magnet Control System 창에서 lift를 클릭하여 NMR 기기에서 공기 흐름을 시작합니다. 튜브가 있는 스피너를 자석 구멍 상단의 공기 흐름에 조심스럽게 놓습니다.

그런 다음 공기 흐름을 멈추고 튜브가 자석 내의 프로브 헤드 내부의 제자리로 내려가도록 합니다. 샘플이 섭씨 25도까지 평형을 이루도록 한 후 명령줄에 ATMM을 입력하여 프로브 헤드의 반자동 튜닝 및 매칭을 수행하여 동력 전달을 최적화합니다. 그런 다음 Magnet Control System 창에서 잠금을 클릭하여 분광계의 자기장 주파수 잠금을 활성화합니다.

먼저 명령줄에 TopShim GUI를 입력하여 심 창을 열어 샘플 위치에서 자기장의 균질성을 최적화하기 위해 shimming 절차를 시작합니다. 그런 다음 shim 창에서 시작을 클릭합니다. 잔차 B0 표준 편차를 확인하여 shim이 최적인지 확인합니다.

다음으로, 마이크로초 단위의 양성자 무선 주파수 펄스의 길이인 P1 매개변수를 보정합니다. 이 매개변수는 양성자 스핀 자화의 90도 회전을 얻는 데 필요합니다. 물 양성자의 1차원 스펙트럼을 사용하여 360도 펄스를 목표로 합니다.

O1 파라미터를 1차원 스펙트럼의 양성자 물 주파수로 설정하여 주파수 오프셋을 조정합니다. 마지막으로, 명령줄에 ZG를 입력하여 1차원 양성자 스펙트럼 수집을 시작합니다. 재조합 타우 정제의 대표적인 결과는 용리 구배 동안 관찰된 280나노미터에서 주요 흡수 피크를 보여줍니다.

이 피크는 크로마토그램 위의 아크릴아미드 겔에서 볼 수 있는 정제된 타우 단백질에 해당합니다. 재조합 정제된 타우를 탈염하기 위한 크로마토그램은 280나노미터에서의 흡수 피크와 전도도 피크가 잘 분리되어 단백질의 탈염이 동결건조 단계에서 효율적임을 보여줍니다. 900메가헤르츠에서 재조합 질소 15 타우의 1차원 NMR 스펙트럼은 단백질 샘플에서 NMR 신호를 검출할 수 있음을 확인합니다.

신호 대 잡음비가 양호하면 기본 수집 매개변수가 올바르게 설정되었음을 나타냅니다. 인산화된 단백질의 2차원 스펙트럼은 우수한 해상도를 보여주고 공명은 좁고 잘 분리되어 있습니다. 빨간색으로 표시된 스펙트럼 영역의 공명은 인산화된 잔기에 해당합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 쉽게 선택할 수 있는 라벨링으로 재조합 단백질을 생성하고, 이 단백질을 정제하고, 스펙트럼 데이터 수집을 위한 기본 파라미터를 설정할 수 있습니다. 일단 마스터하면 이 프로토콜이 제대로 구성되면 2주 안에 완료할 수 있습니다. NMR 분광법은 금속 물체로 접근해서는 안 되는 매우 강한 자석을 사용한다는 것을 잊지 마십시오.

이 절차를 시도하는 동안 이러한 다른 단백질은 단백질 분해 효소 용해에 민감하며 샘플의 분해를 방지하기 위해 여러 가지 예방 조치를 취해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 고체 상태 NMR과 같은 다른 방법을 적용하여 종종 무질서한 단백질에 의해 형성되는 아밀로이드 유사 응집체를 조사할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 화학 생물학 분야의 연구자들이 체외 모델 시스템을 통해 세라파틱 잠재력을 가진 활성 화합물을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.