Name: 본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 배우세요 NMR 분광법을 이용하여 Tau 단백질의 다중 인산화 부위를 식별하는 방법을. 본질적으로 무질서 단백질의 구조적 변화와 기능적 변화를 연결하여 신경퇴행성 질환 관련 분자 조절 메커니즘을 규명합니다.

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NMR 시설은 Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community(FEDER), French Research Ministry 및 University of Sciences and Technologies of Lille의 지원을 받았습니다. TGE RMN THC(FR-3050, 프랑스), FRABio(FR 3688, 프랑스), Lille NMR 및 RPE Health and Biology 핵심 시설의 지원에 감사드립니다. 당사의 연구는 LabEx(Laboratory of Excellence), DISTALZ(알츠하이머병에 대한 학제간 접근 방식을 위한 혁신 전략 개발), EU, ITN, TASPPI 및 ANR BinAlz의 보조금으로 지원됩니다.

15 N 1. 생산, 13 C-타우 (그림 1) <ol><li> BL21에 pET15b-타우 재조합 T7 발현 플라스미드 (13, 14)을 변환 (DE3) 유능한 대장균 박테리아 세포 15. 주 : 최장 (441 아미노산 잔기) 타우 이성체에 대한 cDNA의 코딩은 플라스미드 pET15b에서을 NcoI 및 XhoI에 제한 부위 사이에 클로닝한다. <ol><li> 유능한 BL21 1.5 ml의 플라스틱 튜브에 플라스미드 DNA의 100 NG와 플라스미드 DNA의 μg의 당 1-5 × 10 (7) 식민지를 형성 (DE3) 세포의 부드럽게 50 μl를 섞는다. 참고 : 진핵 cDNA를 발현 코돈 - 사용에 최적화 된 균주는 인간의 타우를 생산하는 것이 필수적되지 않습니다. </li><li> 42 ° C에서 10 초 동안 다음 30 분 및 열 충격 얼음에 세포 혼합물을 놓습니다. 다시 얼음에 5 분 동안 튜브를 놓고 실온 LB (루리아 - 베르 타니) 배지 1 ㎖를 추가합니다. 부드러운 하에서 30 분 동안 37 ℃에서 세균 현탁액을 부화동요. </li></ol></li><li> 항생제 암피실린을 100 ㎍ / ml를 함유하는 LB 한천 배지의 플레이트 상에 접종 루프를 고르게 세포 현탁액 100 ㎕를 사용하여 확산. </li><li> 37 ° C에서 15 시간 동안 선택 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 약 2 주 최대, 문화 단계로 진행하기까지 4 ° C에서 선택 판을 보관하십시오. 주 : 세균 배양 (50 % 글리세롤)의 글리세롤, -80 ℃에서 보관은 이후 단계에서 배양을 시작하기 위해 제조 될 수있다. </li><li> 멸균 M9 염 1 L (6g이 나에게 HPO 4 3g의 KH 2 PO 4 ml의 100 mM의 CaCl2를 10 ㎖의 100 × MEM 용 비타민 보충 1 mL의 1 M 황산, 1, 1 ml의 100 ㎎ / ㎖의 암피실린을 추가 0.5 g의 NaCl). 주 : 백색 침전물을 빠르게 방산 M9 소금에 염화칼슘 (2) 용액을 첨가에 형성 할 것이다. </li><li> 15 N 300 ㎎, 13 C-완전 배지, 15 1g을 용해NH 4 CL 13 C M9 배지 6 글루코스 10 ml를 2g. 살균 필터 직접 M9 배지에, 0.2 ㎛의 필터를 사용하여 동위 원소 용액. </li><li> 앰피 실린 100 ㎍ / ㎖로 보충 된 LB 배지 20ml에 선택 플레이트로부터 박테리아를 형질 pET15b 타우 접종 루프를 사용하여 하나의 콜로니 일시. </li><li> 약 6 시간 동안 37 ° C에서 접종 매체를 품어. </li><li> 플라스틱 분광계 큐벳에서 세균 배양의 10 배 희석액 1ml를 600 nm의 (OD 600)에서 광학 밀도를 측정한다. 참고 : 3.0-4.0의 600 중독에 대응하는 세균성 문화의 탁도는 포화 성장 단계에 도달했음을 나타냅니다. </li><li> 2 L의 삼각 플라스틱 배플 배양 플라스크에서 암피실린 (100 μg의 / ㎖ 최종 농도)로 보충 M9 성장 배지 1 L로 포화 LB 배양 20 ㎖를 추가한다. </li><li> 10 °로 설정 프로그램 배양기에서 배양 플라스크를 배치C 50 rpm으로. 다음날 이른 아침에 200 rpm으로 37 ° C로 전환 인큐베이터 프로그램. </li><li> 플라스틱 분광계 큐벳에서 세균 배양 1 ㎖에 측정 OD (600). 1 M IPTG 400 μL (이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드) OD 600 재조합 타우 단백질의 발현을 유도하는 약 1.0의 값에 도달 (-20 ° C에 보관) 스톡 용액을 첨가. </li><li> 또한 3 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션을 계속한다. 20 분 동안 5,000 XG에서 원심 분리하여 균체를 수집합니다. </li><li> -20 ℃에서 박테리아 펠렛을 동결. 필요하다면 장기간의 정제 공정 전까지 냉동 보관. </li></ol> 15 N 2. 정제, 13 C-타우 (그림 2) <ol><li> 121 ° C에서 압력솥 양이온 교환 (CEX) 정화 버퍼 20 분 15 PSI에서. 4 ° C에서 보관 버퍼. </li><li> 박테리아 세포 펠렛을 녹여 45 ㎖에 완전히 재현 탁추출 CEX의 버퍼 (50 mM의 NAPI의 완충액 pH 6.5, 1 mM의 EDTA)를 갓 프로테아제 억제제 칵테일 1 배 (1 정)과 DNAseI (2,000 대)로 보충. </li><li> 20,000 psi에서 고압 균질기를 이용하여 균체를 방해. 3-4 패스가 필요합니다. 40 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기 불용성 물질을 제거합니다. </li><li> 수조를 사용하여 75 ° C에서 15 분 동안 박테리아 세포 추출액을 가열한다. 참고 : 흰색 침전물이 몇 분 후에 관찰된다. </li><li> 20 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기 및 열 안정성 타우 단백질을 포함 뜨는을 유지한다. </li><li> 다음 정제 단계까지 -20 ℃에서 저장, 필요하다면. </li><li> 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) 시스템 (그림 3 A)를 사용하여 5 ml의 침대 컬럼으로 포장 강한 CEX 수지에 양이온 교환 크로마토 그래피를 수행합니다. <ol><li> 2.5 ml / 분으로 설정 유량. </li><li> 버퍼 CEX에서 열 평형 </li><li> 60-70 ML의 heated-를로드타우 샘플 펌프를 사용하여 추출 함유, 또는 대안 적으로 시스템에 따라 펌프. 플로우를 통해 분석은 타우 단백질이 효율적 (2.8 참조) 수지에 결합되어 있는지 확인 할를 수집합니다. </li><li> 다시 기본 값입니다 nm의 280에서 흡수 될 때까지 CEX로 버퍼를 수지 씻으십시오. </li><li> CEX B의 버퍼의 점진적인 증가에 의해 얻어진 세 단계의 NaCl 구배를 사용하여 칼럼으로부터 용출 타우 (CEX 1 M NaCl을 가진 버퍼). 프로그램 FPLC 다음과 같이 500 mM의 NaCl을 도달하기 위해 5 CV 250 mM의 NaCl을, 50 % CEX B 버퍼에 두 번째 단계에 도달하는 10 컬럼 부피 (CV) 25 % CEX B 버퍼에 그라데이션의 첫 번째 단계와 세 번째 단계 이 CV에서 100 % 완충액 B CEX 1 M NaCl을 도달한다. 용출 단계에서 1.5 ml의 분수를 수집합니다. </li></ol></li><li> SDS-PAGE (12 % 아크릴 아미드 SDS-GEL) 쿠마시 염색 (도 3 A) (16)에 의해 용출 단계 동안 수집 된 분획의 10 μl를 분석한다. analy가 아니라 컬럼에 로딩하는 단계를 점검플로우 스루 10 μl를 쌩쌩. </li><li> 타우을 함유하는 분획을 선택하고 다음 단계에서 이들 분획을 풀. </li><li> 타우 함유 풀링 분수 (그림 3 B)에 버퍼 교환을 수행합니다. <ol><li> FPLC 시스템을 사용하여 50 mM의 암모늄 바이 카보네이트 (휘발성 버퍼)에 53 ml의 G25 수지 충전 층 (26 X 10cm)의 탈염 열 평형. </li><li> / 분 5 ㎖로 설정 유량. 5 mL의 주입 루프를 통해 열에 타우 샘플을 주입한다. 280 nm에서 흡수 피크에 대응하는 분획을 수집한다. </li><li> 초기 CEX 풀의 양에 따라, 주사를 3 ~ 4 번 반복합니다. </li></ol></li><li> 280 나노 미터 (타우 1 mg을 140 ml의 MAU *에 대응)의 크로마토 그램의 피크 면적을 이용하여 정제 된 타우 단백질의 양을 계산한다. 주 : 280 nm에서의 타우 단백질의 흡광 계수가 7,550 M -1 cm-1이다. 타우는 TRP의 잔류 물을 포함하지 않습니다. </li><li> 수영장은 모든 타우 분수. </li><li> Aliquo타우의 1 ~ 5 밀리그램의 등가를 포함하는 튜브에 샘플을 t. 용액의 부피는 상기 튜브 (50 ㎖의 튜브 용액, 예를 들어 5 ㎖)의 체적에 비해 작게되도록 이들 튜브를 선택한다. </li><li> 바늘을 사용하여 튜브를 뚜껑의 구멍을 펀치. -80 ° C에서 타우 샘플을 고정. </li><li> 동결 건조 타우 샘플. 동결 건조 된 타우 단백질이 장기간 동안 -20 ℃에서 유지 될 수있다. </li></ol> 15 N-타우 3. 체외 인산화 <ol><li> 500 ㎕의 인산화 버퍼 (50 mM의 헤 페스을 · KOH, pH가 8.0, 12.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 EDTA, 50 mM의 염화나트륨)의 동결 건조 된 타우 5 mg을 녹이고. </li><li> 0.5 M 스톡 2.5 mM의 ATP (100 mM의 스톡 용액을 25 μL가 -20 ℃로 유지), 1 mM의 DTT (1 M 스톡 용액을 1 μL를 -20 ℃로 유지), 1mM의 EGTA 추가 (2 μL 용액), 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (1 ml의 인산화 버퍼 한 태블릿을 용해시킨 40X 재고 25 μL) 및 한81; M 그의-ERK2 활성화 (보존 버퍼 250 μL를 10 -80 ° C에 보관 mM의 헤 페스, pH가 7.3, 1mM의 DTT, 5 밀리미터의 MgCl 2, 100 mM의 염화나트륨 및 10 % 글리세롤)의 총 샘플 부피 1 ml의. 참고 : 활성화 된 그의-ERK2는 MEK 키나아제와 인산화에 의해 사내 5,8 제조 할 수있다. </li><li> 37 ° C에서 3 시간을 품어. </li><li> ERK 키나아제를 실활 15 분 동안 75 ° C에서 샘플을 가열한다. </li><li> 15 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기. 수집하고 뜨는을 유지한다. </li><li> 1 mL의 샘플에 적합한 3.45 mL의 G25 수지 충전 층 (1.3 × 2.6 cm)의 컬럼을 사용하여 50mM의 중탄산 암모늄으로 단백질 샘플을 탈염. </li><li> 무결성 및 효율적인 인산화 (그림 4)을 모두 확인하는 단백질 시료의 2.5 μL와 12 % SDS-PAGE (16)를 실행합니다. </li><li> 인산화 타우 샘플을 동결 건조. -20 ° C에서 분말을 저장합니다. </li></ol> NMR 스펙트럼 4. 취득 (FIgure 5) <ol><li> 동결 건조 15 N의 4 ㎎, 400 μL의 NMR 버퍼 (13) C ERK 인산화 타우 (50 mM의 NAPI 또는 트리스 (D11) .Cl 중수 소화의 50 mM, pH를 6.5, 30 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 EDTA 1 mM의 DTT)을 용해. </li><li> 내부 NMR 신호 기준으로 NMR 분광계의 필드 잠금 및 1 mM의 TMSP (3- (트리메틸 실릴) 프로피온산-2,2,3,3- D 사 산 나트륨 염))에 대해 5 % D 2 O를 추가합니다. 완전한 단백질 분해 효소 억제제 칵테일의 40 배 원액의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 긴 바늘 또는 파스퇴르 피펫 전자 주사기를 사용하여 5mm의 NMR 튜브에 시료를 옮긴다. 플런저를 사용하여 NMR 튜브를 닫습니다. 플런저의 움직임에 의해 플런저와 액체 사이에 갇혀있는 공기 방울을 제거합니다. </li><li> 스피너의 NMR 튜브를 놓습니다. 시료 용액의 대부분이 NMR 코일 내부에있을 것 같은 것을 사용하는 NMR 프로브 헤드에 대한 적절한 게이지와 회 전자의 수직 위치를 조정합니다. </li><li> 공기 흐름을 시작 리프트 난을 클릭N 자석 제어계 창. 조심스럽게 자석 구멍의 상단에있는 공기 흐름 튜브와 스피너를 배치합니다. 공기의 흐름을 중지 (리프트를 클릭) 튜브 자석의 프로브 헤드 내부 제자리에 내려 보자. </li><li> 25 ° C (298 K)로 설정 온도. </li><li> 동력 전달을 최적화하기 위해 반자동 튜닝 및 프로브 헤드의 정합을 수행한다. 명령 행에 ATMM 입력합니다. </li><li> 중수소 채널 상에 기록 된 샘플의 D 2 O 신호를 이용하여 주파수 분석 장치 잠금. 자석 제어계 창 잠금을 클릭. </li><li> 샘플의 위치에서의 자기장의 균일 성을 최적화 shimming 절차를 시작한다. 심 창을 열려면 명령 행에서 GUI를 topshim 입력합니다. 심 창에서 시작을 클릭합니다. 심가 (이하 2 Hz에서 좋은) 최적인지 확인하기 위해 잔류 B0 표준 편차 값을 확인하십시오. </li><li> 양성자의 P1 매개 변수 (길이 보정양성자 스핀의 90 ° 회전을 얻기 위해 필요한 마이크로 초에서 고주파 펄스). 물 양자의 1D 스펙트럼 (그림 6)를 사용하여 360 ° 펄스에 대한 목표로하고 있습니다. </li><li> (도 6) 1D 스펙트럼 양성자 물 주파수 (Hz 단위)을 O1 매개 변수를 설정하여 주파수 오프셋을 조정한다. </li><li> 샘플 (그림 7)로부터의 신호를 확인하기 위해 (예를 zggpw5를 들어, 물 신호 억제를위한 워터 게이트 순서와 펄스 시퀀스) 1 차원 양성자 스펙트럼의 획득을 시작합니다. 상대 단백질 농도를 검사의 수를 적응. 획득을 시작하려면 명령 줄에서 ZG 입력합니다. </li><li> 2 차원의 인수에 대한 추가 매개 변수를 설정 [1 H, 15 N] HSQC 스펙트럼 (펄스 시퀀스 hsqcetfpf3gpsi, 8-9도). <ol><li> 15 N의 경우, 13 C는 15 N 간접 진화 중 (13) C를 분리, 샘플을 표시. </li><li&gt; 포인트의 수 및 1 H (F2) 15 N (F1) 치수의 스펙트럼 폭 (PPM)를 설정한다. 주 : 점당 Hz의 유사한 번호를 유지하는 분광계 필드에 수집 된 데이터 포인트의 수를 적응 시간 디커플링 제한하기 : 1 H 차원에서는 900 MHz와 600 MHz에서 2048 포인트에서 3072 포인트를 사용한다. </li><li> 펄스 시퀀스의 추가 파라미터를 최적화 지연 펄스 길이에 대응하는 주파수, 전력 레벨 오프셋. 명령 행에서 ased 유형 실험에 대한 관련된 모든 매개 변수를 표시합니다. </li></ol></li><li> 3 차원의 획득을위한 설정 매개 변수 [1 H 15 N, 13 C] HNCACB 스펙트럼 (펄스 시퀀스 hncacbgpwg3d, 그림 10A) 600 MHz에서. </li><li> 600 MHz에서 3 차원 [1 H 15 N, 15 N] HNCANNH 실험 (펄스 시퀀스 hncannhgpwg3d)에 대한 매개 변수를 설정합니다. 1 H에서 2048 포인트의 수를 설정하고, (64)두 15 N 차원에서 128 점. , (25), 만 (ppm으로) 당 25 부 4.7, 119, 1 H 119 ppm으로, 15 N 15 N 차원을 중심으로 14으로 스펙트럼 폭을 정의합니다. (16) 검사와 취득 기간 1 일 22 시간이다. </li></ol> 인산화 사이트 5. 확인 <ol><li> 수집 및 처리 NMR 소프트웨어를 이용하여 처리 스펙트럼. <ol><li> 데이터 (도 7)의 푸리에 변환을 수행한다. 1 차원 스펙트럼에 대한 형식 피트, 2 차원 스펙트럼 xfb 또는 명령 행에서, 3 차원 스펙트럼 ft3d. </li><li> 단계 참조 모든 스펙트럼 (그림 7C) 대화 형 창을 사용하여. </li></ol></li><li> 2 차원 HSQC 잠재적 인산화 빼앗아과의 Thr 잔기 (그림 9, 빨간색 상자)에 해당하는 관심의 공명을 확인합니다. </li><li> 추출면에서 (즉, 2D 1 H-13 C 스펙트럼)2 차원의 관심 공명의 (15) N 화학 변화를 이용하여 3 차원 (1) H-15 N- (13) C 스펙트럼. 시각화 할 수있는면 (W1-W3)에 해당하는 15 N 주파수 (그림 10B)을 선택하는 차원이 (W2)의 커서를 사용합니다. </li><li> 각각에 대한 &#39;CA&#39;의 공진 주파수와 &#39;난&#39;의 &#39;CB&#39;13 C 핵와 &#39;I-1&#39;잔류 물 (다음 i 잔류에 비해 신호의 약한 세트)을 선택 [1 H, 15 N] 공명 포인터 모드 메뉴에서 공진을 클릭하여 HNCACB 3D 스펙트럼에서 관심 피크리스트 파일의 화학 쉬프트 값을 추가하기 위해, 추가의 피크를 찾기 /. <ol><li> 공지 CA의 값과 pSer pThr 17 CB 화학 시프트에 피크리스트의 화학적 이동과 비교하여 상기 잔기 I 유형 또는 pSer pThr 식별. </li><li> 추가적인 특성이 PPM 시프트 O로 I + 1 위치에서 프로 잔기의 존재를 확인하여 CA 케미컬 시프트 값 18 F. </li><li> 제 i-1 위치에서의 잔기의 특성을 식별하는 타우의 아미노산 잔기 19에 대한 예측 된 화학적 이동의 테이블에 I-1 잔류에 대응하는 CA와 CB 공명의 화학적 시프트 값을 비교한다. </li></ol></li><li> HNCANNH 스펙트럼에 대한 관심의 각 [1 H, 15 N] 공명의 공명 (가) &#39;난&#39;의 15 N 핵의 주파수와 &#39;I-1&#39;잔류를 선택합니다. </li><li> 23 - 타우 단백질 (20)의 화학적 이동 할당에 15 N의 화학 시프트 값을 비교한다. </li><li> 시퀀스의 특정 할당을 정의하는 타우 시퀀스 식별 디 펩티드를 비교한다. </li></ol>

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우리는 효소 변성 타우 샘플의 특성을 NMR 분광 분석을 사용 하였다. 재조합 발현과 전장 사람 타우 단백질 여기 기재된 정제 마찬가지로 돌연변이 또는 타우 타우 도메인을 생성하는데 사용될 수있다. 동위 원소 적으로 농축 된 단백질의 재조합 발현을 필요로, NMR 분광법 필요하다. 인산화 사이트의 식별 공명 할당 및 15 N, 13 C 이중 표지 단백질을 필요로한다. 동위 원소의 가격을 감안할 때, 양호한 수율은 재조합 발현 단계에서 요구된다. 따라서 포도당 (13) C (6) 글루코스의 양이 수율을 향상시키기 위해 성장 배지 리터 당 4 g으로 증가 될 수 M9 배지에서 세균의 성장을위한 제한 인자가된다. 완전 배지 및 MEM 비타민의 추가는 필수는 아니지만 수율 성장을 촉진하고 개선하는 데 도움이됩니다. 완전한 표지 매체의 높은 가격을 감안할 때, 본 제품은 성장 배지로 사용 supplemen티. 세균의 성장은 M9 배지에서 느립니다. 일반적으로...

21 세기 의료의 주요 과제 중 하나는 알츠하이머 병 (AD)와 같은 신경 퇴행성 질환이다. 타우 미세 소관 (MT)의 형성을 자극 미세 소관 - 연관된 단백질이다. 타우 동등하게, 여러 가지 신경 퇴행성 질환에서 가장 잘 알려진이 AD로되어있는 소위 퇴행성 신경을 참여하고있다. 이러한 질환에서, 타우 쌍 나선형 필라멘트 (PHFs)에서 자기 집합체와는 같은 인산화 1과 번역 후 수정 (PTMS)에 의해 많은 잔류에 수정 발견된다. 타우 단백질의 인산화는 MT 안정화 및 AD 신경 세포의 특징 기능의 병리학 적 손실의 생리 기능을 모두 조절에 관여한다. 질병 뉴런 PHFs에 통합 될 때 더욱이, 타우 단백질은 언제나 2 hyperphosphorylated된다. 2 ~ 3 인산염 그룹을 포함하는 일반 타우는 달리, PHFs에서 hyperphosphorylated 타우 5-9 phosphat을 포함전자 그룹 3. 타우의 과인산 일부 사이트에서와 인산화의 병적 인 사이트라고 추가 사이트의 인산화에 화학 양론의 증가에 모두 해당한다. 그러나, 중복 레벨 4의 양적 차이에도 불구하고, AD 및 인산화의 정상 성인의 패턴 사이에 존재합니다. 어떻게 특정 인산화 이벤트에 영향을 미치는 기능과 타우의 기능 부전은 크게 알려지지 않은 남아있다. 우리는 분자 수준에서 PTMS에 의해 타우 규제를 해독하는 것을 목표로하고 있습니다. 타우의 분자 측면의 이해를 깊게하기 위해, 우리는 기술적 인 문제를 해결해야합니다. 첫째, 타우 솔루션에 고립 본질적으로 무질서 단백질 (IDP)입니다. 이러한 단백질은 생리 학적 조건에서 잘 정의 된 세 가지 차원 구조를 결여하고 그 기능 (들) 및 구조적 특성을 연구하기 위해 특정 생물 물리학 적 방법이 필요합니다. 타우는 실향민의 성장 클래스에 대한 패러다임, 자주와 관련된 발견이러한 신경 퇴행성 질환과 같은 병리, 따라서 그 기능의 기초가되는 분자 파라미터를 이해하기 위해 관심을 증가시킨다. 둘째, 타우 인산화 특성은 최장 441 아미노산 타우 이성체의 순서에 따라 80 전위 인산화 부위와 분석 도전이다. 항체의 다수의 타우 인산화 에피토프에 대해 개발되어 뉴런 또는 뇌 조직 병리학 타우 검출을 위해 사용된다. 인산화 이벤트는 프롤린이 풍부한 지역 내 가까이에 그들의 대부분, 프롤린 지시 키나제의 대상이 적어도 20 사이트에 일어날 수있다. 정 성적 (어떤 사이트?) 및 (화학량 무엇?) 정량적 특성은 가장 최근에 MS 기술 (5)에 의해 곤란하다. NMR 스펙트럼은 매우 이형태 앙상블 구성 동적 시스템이다 무질서 단백질을 연구하는데 사용될 수있다. 고해상도 NMR 분광법 어플리이었다에드는 타우 단백질의 양 구조와 기능을 조사합니다. 8 - 또한, 타우의 인산화 프로파일의 복잡도 인산화 부위 (6)의 식별을위한 NMR을 이용하여 분자 도구 새로운 분석법의 개발을 이끌었다. 분석 방법으로 NMR은 인산 결합의 정도의 글로벌 방식으로 타우 인산화 사이트의 식별, 하나의 실험에서 모든 단일 사이트 수정의 시각화 및 정량화 수 있습니다. 타우 인산화 과정은 문헌에 풍부하지만, 이들 대부분은 인산화 프로필 불확실성의 큰 정도 따라서 개별 인산화 이벤트의 실제 영향을 떠나는 항체 수행 되었기 때문에이 점은 중요하다. PKA, 글리코겐 신타 제 키나제 3β (GSK3β), 사이클린 의존 키나제 2 / 사이클린 A (CDK2 / CycA에 의해서), 사이클린 의존 키나제 5 (CDK5) / P25의 행위를 포함하는 재조합 키나제향해 타우 인산화 활성을 나타내는 ivator 단백질 세포 외 신호 조절 키나아제 2 (ERK2) 및 미세 소관 연관 조절 키나아제 (MARK)는, 활성 형태로 제조 될 수있다. 또한, 잘 특성화 인산화 패턴 특정 타우 단백질 이소 형을 생성 할 수 타우 돌연변이 타우의 인산화 코드를 해독하는데 사용된다. 8 - NMR 분광법이어서 효소 변성 타우 샘플 6을 특성화하기 위해 사용된다. 타우 인산화 시험관은 글루탐산 (Glu가) 잔기로 선택 빼앗아 /의 Thr 돌연변이 등에 의해 의사 인산화보다 더 도전이지만,이 방식은 장점을 갖는다. 실제로, 인산화도 구조에 미치는 영향도 상호 작용 매개 변수는 항상 글루타민산 산으로 모방 할 수있다. 예 글루 돌연변이 9 재현되지 포스 포세린 (202) (pSer202)의 주위에 관찰 턴 모티브 / phosphothreonine 205 (pThr205)입니다. 체외 인산화 타우의 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 12 - ERK2은 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 / ERK 키나제 (MEK) (10)에 의해 인산화에 의해 활성화된다. 개질 된, 동위 원소로 표지 된 타우 단백질의 제조뿐만 아니라, PTMS의 식별을 위해 사용 된 NMR 전략을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>pET15B 재조합 T7 발현 플라스미드</td><td>Novagen</td><td>69257</td><td>-20 &deg; C</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) 형질 전환 유능 E. coli 박테리아</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>-80 &deg; C</td></tr><tr><td>오토클레이브 LB 육수, Lennox&nbsp;</td><td>DIFCO</td><td>240210</td><td>세균 성장 매체</td></tr><tr><td>MEM 비타민 보충 100x</td><td>Sigma</td><td>58970C</td><td>세균 성장 매체 보충제</td></tr><tr><td>15N, 13C-ISOGRO 완전 중간 분말</td><td>시그마</td><td>608297</td><td>세균 성장 매체 보충제</td></tr><tr><td>15NH4Cl</td><td>시그마</td><td>299251</td><td>동위원소</td></tr><tr><td>13C6-Glucose</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td>동위원소</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제&nbsp;</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td>4 &deg에서 유지; 1ml</td></tr><tr><td>의 C 1 정제는 -20 °C로 유지할 수있는 40x 용액입니다. C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>EUROMEDEX</td><td>1307</td><td>-20 유지 &deg; C</td></tr><tr><td>균질화 기 (EmulsiFlex-C3)</td> <td>AVESTIN</td><td></td><td>용해는 4 °C에서 실현됩니다. C</td></tr><tr><td>피어스&트레이드; 염색되지 않은 단백질 MW 마커</td><td>피어싱</td><td>266109</td><td></td></tr><tr><td>활성 인간 MEK1 키나아제, GST 태그</td><td>시그마</td><td>M8822</td><td>-80 &deg에 유지; C</td></tr><tr><td>AKT&Auml; 순수 크로마토그래피 시스템</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5156-01</td><td>양이온 교환 크로마토그래피 컬럼</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 탈염</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5087-01</td><td>단백질 탈염 컬럼</td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-08</td><td>단백질 탈염 컬럼</td></tr><tr><td>Tris D11, 97% D</td><td>Cortecnet</td><td>CD4035P5</td><td>중수소화 NMR 버퍼</td></tr><tr><td>5mm 대칭 마이크로튜브 SHIGEMI D2O(내부 및 외부 파이프 5개 세트)&nbsp;</td><td>Euriso-top</td><td>BMS-005B</td><td>NMR Shigemi Tubes</td></tr><tr><td>eVol 키트-전자 주사기 스타터 키트</td><td>Cortecnet</td><td>2910000</td><td>피펫팅</td></tr><tr><td>Bruker 900MHz AvanceIII, 삼중 공명 극저온 프로브 헤드가 있는</td><td>Bruker</td><td>NMR 분광계 데이터 수집을 위한</td>Bruker <td></td></tr><tr><td>600MHz Avance, 삼중 공명 극저온 프로브헤드가 있는</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR 분광계</td></tr><tr><td>NMR 실험을 위한</td> <td>TopSpin 3.1</td><td>Bruker</td><td></td> 수집 및 처리 소프트웨어</tr><tr><td>Sparky 3.114</td><td>UCSF (T. D. Goddard 및 DG Kneller)</td><td></td><td>NMR 데이터 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

신경 세포 타우 단백질의 응집체는 알츠하이머병 환자의 신경 세포 내부에서 발견됩니다. 이 질병의 발병은 타우(Tau)의 비정상적인 인산화(phosphorylation)를 동반합니다. 질병의 타우 기능 및 기능 장애에 대한 분자 조사 과정에서 핵 자기 공명(NMR) 분광법을 사용하여 타우의 다중 인산화를 식별합니다. 여기에서 NMR 연구를 위한 동위원소 농축과 함께 박테리아에서 Tau의 재조합 생산에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Tau의 열 안정성과 높은 등전점을 활용하는 정제 단계에 대해 설명합니다. 재조합 활성화 ERK2에 의한 Tau의 체외 인산화 프로토콜은 다중 인산화를 생성할 수 있습니다. 단백질 샘플은 이러한 단계에서 데이터를 수집할 준비가 되었습니다. 분광계에서 기록을 시작하기 위한 매개변수 설정은 다음으로 고려됩니다. 마지막으로, NMR 데이터를 기반으로 변형된 Tau의 인산화 부위를 식별하는 전략을 설명합니다. 면역 검출 또는 질량 분석법(MS)과 같은 인산화 부위를 식별하는 데 사용되는 다른 기술과 비교하여 이 방법론의 이점에 대해 설명합니다.

도 3a는 용출 구배 중 관찰 된 280 nm에서 큰 흡수 피크를 나타낸다. 크로마토 그램 상기 아크릴 아마이드 겔에서 볼 때이 피크는 정제 된 타우 단백질에 해당한다. 도 3b는 단백질의 탈염이 효율적으로 보장, 280 nm의 전도도의 피크에서 잘 분리 흡수 피크를 보여줍니다. 도 4는 단백질의 SDS-PAGE 분석에 의해 여러 단백질 인산화 (16)의 특성을 관찰 겔 - 시프트 (비교 레인 2 및 3).을 나타낸다 도 6은 (마이크로 초 단위)의 펄스 길이의 증가에 양성자 (H 1)의 1D 스펙트럼의 시리즈를 보여준다. 이 신호를 최소화함으로써 보정 쉽다로 설정하는 펄스가 360 ° 회전에 대응하여 90 ° 일 H 스핀 자화를 회전 할 펄스의 길이는, 실제로 사용된다. 360 ° 펄스 길이가 적절하게 정의 할 때 물 양자의 신호는 null입니다. 360에 대응하는 값(76); 회전 ...

여기에서는 Tau 단백질을 사례 연구로 사용하여 핵 자기 공명 분광법(NMR)으로 본질적으로 무질서한 단백질의 다중 인산화를 식별하는 방법을 설명합니다. 재조합 Tau는 데이터 수집 및 분석 전에 kinase에 의해 동위원소로 농축되고 in vitro에 변형됩니다.

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

이 방법론의 전반적인 목표는 사례 연구로 타우 단백질을 사용하여 핵 자기 공명 분광법(nuclear magnetic resonance spectroscopy)을 통해 본질적으로 무질서한 단백질의 다중 인산화를 식별하는 것입니다. 이 방법은 분자 파트너와의 단백질 상호 작용에 대한 인산화의 영향과 같은 질병과 관련된 분자 조절의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 무질서한 단백질에서 부위 특이적 인산화를 식별하고 이를 구조적 및 기능적 변화와 연결할 수 있다는 것입니다.이 방법은 함수에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 aPtc 바이러스에서 DNA 단백질의 무질서한 잔해와 같은 다른 단백질에도 적용할 수 있습니다.이 기술의 적용은 단백질, 단백질 상호 작용 억제제의 개발에 의한 치료로 확장됩니다. 이 방법은 우리 그룹의 박사 과정 학생인 Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa 및 Hamida Merzougui에 의해 시연될 것입니다.먼저 50마이크로리터의 유능한 BL21 세포와 100나노그램의 플라스미드 DNA를 부드럽게 혼합하여 1.5밀리리터의 플라스틱 튜브에 혈장 DNA 마이크로그램당 1,000만-1,500만 개의 콜로니를 형성합니다. 세포 혼합물을 얼음 위에 30분 동안 놓은 후 섭씨 42도에서 10초 동안 열 충격을 가합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 다시 5분 동안 놓고 실온 Luria Bertani 또는 LB 배지 1ml를 추가합니다.박테리아 현탁액을 섭씨 37도에서 부드러운 교반 하에서 30분 동안 배양합니다. 스프레더를 사용하여 100마이크로리터의 세포 현탁액을 암피실린 항생제 1밀리리터당 100마이크로그램이 들어 있는 LB 배지의 한천 플레이트에 고르게 펴 바릅니다. 섭씨 37도에서 15시간 동안 선택 플레이트를 배양합니다.다음으로, 질소 15 및 탄소 13 강화 배지 300mg, 질소 15 염화암모늄 1g 및 탄소 13 표지 포도당 2g을 M9 배지 10ml에 용해시킵니다. 필터는 0.2 미크론 필터를 사용하여 동위원소 용액을 M9 매체로 직접 멸균합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램이 보충된 20밀리리터의 LB 배지에 있는 선택 플레이트에서 재조합 혈장 형질전환균의 한 콜로니를 현탁시킵니다.접종된 배지를 섭씨 37도에서 약 6시간 동안 배양합니다. 플라스틱 분광계 큐벳에서 박

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 핵 자기 공명 분광법(NMR) 기술을 사용하여 단백질에서 여러 인산화를 식별하는 방법을 보여줍니다. 특정 아미노산에서 단백질의 인산화는 이웃 아미드 수소의 차폐 해제를 유발하여 스펙트럼 차이를 생성합니다.

단백질에서 다중 인산화를 식별하기 위한 핵 자기 공명 분광법(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

우리는 여기에서 식물 단백질 복합체의 정제 및 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 단지 내에 하나의 단백질을 immunoprecipitating에 의해, 그래서 우리는 그것의 번역 후 변형과 상호 작용하는 파트너를 식별 할 수있는 것을 보여줍니다.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

단백질 인산화는 세포가 세포 외 환경에서 정보를 해석하고 반응하는 방법의 핵심 기능입니다. 여기에서는 포유류 세포에서 정제된 kinase를 사용하여 관심 기질을 인산화하는 kinase를 신속하게 식별하는 고처리량 스크리닝 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

 종속 키 1 (Cdk1) 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 되 고 많은 세포 경로 조절. 여기, Cdk1, Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별이 중요 한 키의 셀룰러 목표 설정에 대 한 수와 함께 체 외에 니 분석 결과 대 한 프로토콜 선물이.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

본질적으로 무질서한 단백질에서 약하고 일시적인 분자 간 및 분자 내 상호 작용을 감지하기 위한 상자성 이완 강화 NMR 분광법의 적용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

본 프로토콜은 개선된 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석을 사용하여 단백질 인산화를 정량화하기 위한 샘플 준비 및 데이터 분석을 기술한다.

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

여기에서, 우리는 세포 및 조직으로부터 내인성 포스포단백질 포스파타제와 이들의 상호작용하는 단백질의 농축과 질량 분광법 기반 프로테오믹스에 의한 이들의 확인 및 정량화를 위한 프로토콜을 제시한다.

포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법

핵 자기 공명(NMR) 분광법은 잔류물 특이적 방식으로 구조적 단백질 역학을 특성화할 수 있습니다. 당사는 피코초에서 나노초의 시간 척도에 민감한 NMR 15NR1 및 R2 이완 및 {1H}-15N 이종 핵 오버하우저 효과(hetNOE) 실험을 기록하기 위한 실습 프로토콜을 제공합니다.

단백질의 피코초에서 나노초까지의 구조 역학 조사를 위한 NMR 15N 이완 실험

배우세요 NMR 분광법을 이용하여 Tau 단백질의 다중 인산화 부위를 식별하는 방법을. 본질적으로 무질서 단백질의 구조적 변화와 기능적 변화를 연결하여 신경퇴행성 질환 관련 분자 조절 메커니즘을 규명합니다.

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

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