레이저 이외에 Microdissection RNA-서열에 대한 실험 디자인 : 옥수수 잎 개발의 분석 교훈

이 방법의 전반적인 목표는 특정 세포 또는 세포 도메인에서 전사체 축적을 정량화하여 돌연변이 및 야생형 샘플에서 서로 다른 도메인 간 또는 등가 도메인 간에 비교를 수행할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 장기 도메인이 어떻게 지정되는지 또는 특정 돌연변이가 유전자 발현에 어떤 영향을 미치는지와 같은 발달 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전사체 축적을 손으로 절부하기에는 너무 작은 미세하고 정확하게 정의된 영역으로 정량화할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하기 전에 표준 조건에서 옥수수 묘목을 2주까지 재배합니다. 측면 부분에 대한 새싹 apices를 해부하려면 먼저 토양 라인 바로 아래에 있는 묘목을 절제합니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 하나 또는 두 개의 성숙한 잎으로 둘러싸인 고요한 타원형이 보일 때까지 줄기 바닥에서 얇은 조각을 제거합니다.

바닥에서 약 10mm 위로 다시 자릅니다. 이 10mm 분절은 어린 잎 primordia의 싹 정점 분열체를 포함합니다. 베이스가 위를 향하도록 10mm 세그먼트를 돌립니다.

측면 축과 평행하게 두 번 절단하여 2-3mm 두께의 조직 슬라이드를 얻습니다. 바깥쪽 두 부분을 버리고 고정 및 삽입을 위해 중앙 슬라이스를 유지합니다. 얼음 위의 유리 바이알에 고정 된 약 10 밀리리터의 농부에 조직 조각을 담그십시오.

모든 샘플을 절제한 후 진공을 적용하여 기포를 제거하고 고정액의 침투를 돕습니다. 진공 청소기를 10분 동안 유지한 다음 천천히 진공 청소기를 해제합니다. 정착액을 교체하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.

다음 날에는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 임베딩을 위한 조직을 계속 처리합니다. 파라핀 블록을 주조하려면 조직 포매 스테이션의 핫 플레이트에 포매 주형을 배치하고 집게를 사용하여 조직 샘플을 절단면이 아래를 향하도록 하여 포매 주형으로 옮깁니다. 금형 상단에 임베딩 링을 놓습니다.

녹인 파라핀으로 각 금형을 채웁니다. 파라핀이 응고될 때까지 금형을 냉각판으로 옮깁니다. 파라핀 블록은 실리카겔이 함유된 밀폐 용기에 넣어 섭씨 4도의 온도에서 보관하십시오.

절편은 표준 절차에 따라 마이크로톰의 파라핀 블록에서 절단되며, 싹 정점 분열체를 포함하는 중간 절편이 장착을 위해 선택됩니다. 슬라이드에 섹션을 장착하려면 RNase가 없거나 섭씨 42도의 슬라이드 워머에 구운 슬라이드를 배치합니다. 각 슬라이드를 덮기 위해 50% 에탄올 용액을 여러 방울 떨어뜨립니다.

슬라이드에 섹션을 부드럽게 놓고 팽창할 때까지 에탄올 용액에 섹션을 띄웁니다. 다음으로, 슬라이드를 기울이고 일회용 이송 피펫으로 흡인하여 과도한 에탄올 용액을 제거합니다. 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 추가 에탄올 용액을 흡수하십시오.

슬라이드를 섭씨 42도에서 몇 시간 동안 또는 밤새 말리십시오. 슬라이드가 건조되면 섭씨 4도의 실리카겔이 함유된 밀폐 용기에 보관하십시오. 현저해부 당일에 슬라이드를 파라핀화합니다.

유리 코플린 항아리 3개, 100% 자일렌 약 50밀리리터가 들어 있는 병 2개, 100% 에탄올 약 50밀리리터가 들어 있는 병 1개를 준비합니다. 슬라이드를 자일렌 1개에 2분, 자일렌 2개에 2분, 100% 에탄올에 1분 동안 담급니다. 보푸라기가 없는 물티슈에 슬라이드를 물기를 빼고 실온에서 자연 건조합니다.

이 절차를 시작하려면 레이저 현미해부 현미경의 스테이지에 슬라이드를 고정하십시오. RNasic 실험에서 레이저 현미해부의 성공에 중요한 요인은 형태학적 및 분자 마커를 사용하여 현저해부를 위한 정확한 도메인을 선택하는 것입니다. 5X 대물렌즈를 사용하여 슬라이드를 검사하고 싹 정점 분열 정점을 중심 기준점으로 사용하여 각 슬라이드에서 가장 중앙값이 높은 5개의 단면을 식별합니다.

다음으로, 10X 또는 20X 대물렌즈를 사용하여 각 절편의 plastochron seven leaf primordium에서 ligule의 위치를 식별합니다. ligule은 잎 primordium의 adaxial 표면에서 돌출 된 돌기로 눈에 띄게 보일 것입니다. 레이저 현미해부 소프트웨어의 그리기 도구를 사용하여 이 위치를 표시합니다.

자유형 그리기 아이콘을 선택하고 커서를 적절한 위치로 이동한 다음 마우스를 클릭하고 끌어 그립니다. 다음 단계는 눈금자와 직사각형 그리기 도구를 사용하여 각 섹션의 ligule을 중심으로 하는 100마이크로미터 높이의 직사각형을 ligule 샘플로 측정하는 것입니다. 눈금자 도구를 사용하려면 눈금자 아이콘을 선택하고 커서를 측정할 영역의 한쪽 끝으로 이동한 다음 클릭하고 끌어서 영역을 측정합니다.

눈금자의 길이가 화면에 표시됩니다. 눈금자 도구를 사용하여 결찰을 중심으로 한 100마이크로미터 세그먼트를 측정합니다. 사각형을 그리려면 직선 그리기 도구를 선택하고 4개의 직선을 그립니다.

같은 방식으로, 결찰 직사각형의 위와 아래에 50마이크로미터 위치에 있는 100마이크로미터 직사각형을 측정합니다. 이것들은 블레이드와 칼집 샘플이 될 것입니다. 레이저 절단 기능을 사용하여 측정된 직사각형을 미세해부하여 선택한 영역의 윤곽을 따라 조직 단면을 절단하고, 투석기 기능을 사용하여 조직의 직사각형을 슬라이드에서 튜브 뚜껑으로 밀어 넣습니다.

ligule, blade 및 sheath 샘플을 별도의 튜브에 수집합니다. 동일한 절차를 사용하여 plastochron seven leaf primordia에서 블레이드, ligule 및 sheath adaxial 표피 샘플을 미세 해부합니다. 마지막으로, 미세절부된 조직에 RNA 추출 buffer를 적용하고 원고에 설명된 대로 RNA 추출, RNA 증폭, 라이브러리 구축, 염기서열분석 및 생물정보학 분석을 진행합니다.

transcript aclumulation을 분석하고 blade, ligule 및 sheath 영역의 모든 세포층을 분석했을 때, 2,359개의 차등적으로 발현된 유전자가 발견되었습니다. 축상 표피 블레이드(adaxial epidermal blade), 결단(ligule) 및 외피(sheath) 영역에서 3, 128개의 다르게 발현된 유전자가 발견되었습니다. 레이저 미세해부, RLM, RNA 염기서열분석 및 현장 혼성화 분석은 이러한 대표적인 유전자에 의해 설명되는 바와 같이 일관된 결과를 제공했습니다.

왼쪽의 만화는 모든 세포층의 LM을 보여주고, 오른쪽의 만화는 부축 표피의 LM만을 보여줍니다. 이미지의 화살촉은 새로운 결찰을 나타냅니다. 리굴 1 전사체 축적은 모든 세포층과 표피 LM 모두에서 결찰에서 유의하게 높았으며, 좁은 칼집 1은 모든 세포층 LM과 부축 표피 LM 모두의 결찰 영역에서 현저하게 상향 조절되었으며, 신진 결찰의 끝에 특이적으로 축적되었습니다.

기능을 알 수 없는 유전자는 모든 층 LM보다 결찰 표피 LM에서 더 높은 평균 recount를 가졌으며, 이 전사체는 표피 세포에서 가장 강력하게 축적됩니다. 네 번째 유전자인 Zm PIN1a는 모든 세포층 분석에서 유의하게 차등적으로 발현되지 않았지만 표피만 분석에서 결찰에서 현저하게 상향 조절되었습니다. 혈관 조직에서의 높은 발현은 모든 세포층을 수집했을 때 표피에서 전사체 축적의 차이를 혼동시킬 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때 미세 해부 및 비교할 세포 영역의 선택과 미세 해부의 정확도가 실험의 성공에 매우 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.