Zebrafish의에서 암 세포의 혈관 침습 능력을 (테스트

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시 배아 모델에서 암세포의 악성 및 침습적 행동을 평가하는 것입니다. 이 방법은 연구자들이 암세포가 기능적 순환계에서 침입할 수 있는지 여부를 결정하는 데 도움이 되며, 이를 통해 전이성 연쇄 반응의 핵심 단계를 모델링할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 제브라피시 배아 모델이 이러한 평가를 제공하고 마우스에서 자주 수행되는 유사한 실험보다 처리 시간이 짧다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 조지타운 대학의 제브라피시 핵심 시설을 운영하는 에릭 글래스고(Eric Glasgow) 박사입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 암세포, 시약, 제브라피시 배아를 준비한 후 마이크로 주입 디스펜싱 시스템을 가압 공기 공급원에 부착하고 전원을 켭니다. 풋 페달을 밟아 압력을 테스트하십시오.

바늘 홀더에서 짧은 공기 펄스가 방출되어야 합니다. 주입 플레이트에 20mL의 2X Tricaine Solution을 넣고 플레이트를 셰이커에 올려 평형을 이룹니다. 그런 다음 2X Tricaine의 두 번째 부분 표본으로 평형을 반복합니다.

다음으로, 플라스틱 피펫을 사용하여 배아 그룹을 2X Tricaine Solution이 들어있는 작은 접시에 옮깁니다. 젤 로딩 팁을 사용하여 마이크로 주사 바늘에 암세포를 다시 채웁니다. 바늘을 전극 보관 용기에 넣고 뾰족한 끝이 아래를 향하도록 하여 세포가 끝 부분에 정착하도록 합니다.

20-30개의 마취된 배아를 플라스틱 피펫에 2X Tricaine이 다량 함유된 배아를 채취하여 주입 플레이트로 옮깁니다. 배아가 피펫 끝에 굳도록 한 다음 배아를 주입판의 홈통으로 부드럽게 배출하여 배아를 홈의 길이를 따라 배아를 퍼뜨립니다. 머리가 위를 향하고 배가 여물통의 가파른 벽을 향하도록 배아를 정렬합니다.

마이크로 매니퓰레이터의 바늘 홀더에 바늘을 부착합니다. 그런 다음 60도 벽이 왼쪽으로 향하도록 하여 입체경 아래에 주입 플레이트를 배치하고 25X 배율로 상단 배아에 초점을 맞춥니다. 바늘을 확장하면 바늘이 배아를 관통하도록 마이크로 매니퓰레이터를 배치합니다.

그런 다음 배아에 거의 닿을 때까지 바늘을 눈으로 뻗습니다. 이제 현미경 아래를 보면서 바늘을 배아에 맞춥니다. 세포를 주입하려면 난황낭을 통해 배아 홈통을 뚫습니다.

풋 페달을 밟아 팁을 전심장동이 아닌 바로 위에 놓습니다. 주사의 힘은 세포를 심장동으로 배출합니다. 대안적으로, 난황낭에 세포를 주입하면 원고에 설명된 대로 혈관 침습의 다양한 측면을 연구할 수 있습니다.

오른손을 사용하여 주사 바늘을 늘리거나 빼냅니다. 왼손으로 다음 배아의 위치를 미세하게 조정합니다. 플레이트 전체가 주입되면 바늘을 전극 보관 용기에 다시 넣습니다.

배아를 회수 접시로 옮기려면 주입판을 기울여 배아를 바닥에 있는 배아를 당겨 물통에서 배아를 씻어낸 다음 플라스틱 피펫을 사용하여 배아를 수집합니다. 배아가 피펫 바닥에 가라앉도록 한 다음 배아를 최소량의 트리카인으로 회수 접시로 옮깁니다. 회수 접시를 섭씨 28도에서 1시간 동안 배양한 후 죽은 배아와 잔해에서 생존 가능한 배아를 분리합니다.

득점할 준비가 될 때까지 섭씨 33도에서 접시를 배양합니다. 채점할 배아 배치를 마취한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 마취된 유충을 트리카인 한 방울의 우울증 현미경 슬라이드에 놓습니다. 꼬리 부위의 최적 이미징을 위해 유충을 측면으로 배치합니다.

10X 대물 렌즈가 있는 복합 형광 현미경에 슬라이드를 놓습니다. 혈관 밖으로 성공적으로 침입한 암세포의 수를 세어 꼬리 부위를 통해 위아래로 초점을 맞춰 온전한 세포를 명확하게 식별하여 유충에 점수를 매깁니다. 1.5%아가로스 트리카인 용액을 녹여 섭씨 37도까지 가져옵니다.

이전과 같이 배아를 마취한 후 트리카인 용액 한 방울에 배아를 이미징 표면으로 옮깁니다. 유리 피펫을 사용하여 이미징 표면에 배아를 유지하고 있는 과도한 트리카인 용액을 제거합니다. 그런 다음 녹은 아가로스 용액 한 방울을 배아 위에 오버레이합니다.

아가로스가 중합되기 전에 속눈썹 브러시와 같은 섬세한 도구를 사용하여 이미징을 위해 배아를 측면 방향으로 배치하고 배아가 이미징 표면을 따라 평평해지도록 각별히 주의를 기울입니다. 아가로스 방울이 중합되면 트리카인 용액에 담그십시오. 마지막으로, 살아있는 제브라피시 배아를 현미경 이미징에 적용합니다.

제브라피시 배아에서 혈관 침습 능력을 검사한 7개의 유방암 세포주 중, MDA-MB-231 세포주는 주입 후 96시간 후에 평가했을 때 배아당 가장 많은 수의 유출된 암세포를 나타냈습니다. 또한 BT-474 세포는 배아의 꼬리 부위로 쉽게 침입하는 반면 MCF-7, SK-BR-3 및 T-47D 세포와 같은 다른 세포주는 최소 침습적임을 관찰했습니다. 다른 주사 부위를 사용하는 변형된 asay에서, 혈관 침입 능력이 다른 MDA-MB-231 세포의 두 집단을 발달 중인 배아의 난황낭에 동시에 주입하는 경쟁 실험이 수행되었습니다.

점수 매기기 결과, 주입 전 융합 배양 조건에서 증식한 MDA-MB-231 세포는 순환으로의 혈관 내 감소를 보였으며, 따라서 배아의 꼬리 영역에서 존재감이 감소한 것으로 확인되었습니다. 일단 숙달되면, 제브라피시 배아 주사는 제대로 수행된다면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 암세포 유출을 평가할 때 엄격하고 일관된 기준을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 쥐 모델에서 결과를 추가로 검증할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 주사를 수행하고 외부 혈관 점수를 매기는 방법을 잘 이해하여 제브라피시 배아에서 암세포의 혈관 침습 능력을 테스트할