Name: TGF-β 함유 프로토콜을 사용하여 나이브 CD4 + T 세포에서 인간의 CD4 + Foxp3의 + 유도 규제 T 세포 (iTregs)의 체외 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 배우세요 TGF-β 프로토콜을 사용하여 나이브 CD4+ T 세포에서 인간 FOXP3+ 유도 조절 T 세포(iTregs)를 체외 분화시키는 방법. 이 기법은 면역내성 연구와 자가면역 질환 치료 개발에 필수적인 재현 가능한 iTreg 생성 및 표현형 분석을 가능하게 합니다.

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니나 나겔(Nina Nagel)은 비디오 촬영과 실험 준비 과정에서 기술적 도움을 준 것에 대해 감사의 뜻을 전했습니다. 세포 내 FOXP3 염색 프로토콜에 도움을 준 Eva-Maria Weiss와 nTreg 분리 프로토콜을 수립해 준 Elisabeth Suri-Payer와 Nina Oberle에게 감사드립니다. Matilda Eriksson과 Peri Noori는 실험실 관리 부문에서 인정을 받았습니다. 
자금 지원: A.S.는 제7차 유럽 공동체 프레임워크 프로그램(European Community Framework Programme)의 마리 퀴리 인트라 유럽(Marie Curie Intra Europe) 펠로우십, Dr. Åke Olsson 재단 및 KI 연구 재단의 지원을 받았습니다. A.S.와 J.T.는 CERIC(Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease, J.T.)의 지원을 받았으며, Vetenskapsrådet Medicine and Health(Dnr 2011-3264)의 지원을 받았습니다. Torsten Söderberg 재단, FP7 STATegra, AFA 보험 및 스톡홀름 카운티 의회.

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기술 된 프로토콜은 인간의 CD4 + Foxp3의 + 인간의 순진한 CD4 + T 세포에서 iTregs의 강력한 유도 할 수 있습니다. 우리가 우수한 시험 관내 억제 기능 22 iTregs의 유도, TGF-β, ATRA 및 라파 마이신의 조합을 사용하여, 최근에 기술 된 새로운 프로토콜을 포함한다. 게시 된 다른 프로토콜들에 비해 다른 이점은 단독 -2- IL의 존재 하에서 활성화 된 대조군 세포와 함께 특정 iTreg 유발 요인 효과의 직접적인 비교를 가능하게 서로 다른 프로토콜에 의해 병렬로 다른 iTreg 집단의 유도가있다 . 기술 된 프로토콜은 낮은 기증자의 변화에 ​​Foxp3의 재현성 유도를 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 순진한 CD4 + T 세포는 자기 활성화 셀 정렬에 의해 분리하지만, 형광 활성화 셀 정렬도 가능합니다. 이 프로토콜 나이브 CD4 + T 세포의 예상 수율은 전형적으로 5-10 % 사이<html> 하...

CD4 + CD25 + + Foxp3를 조절 T 세포 (Tregs)는 다른 면역 세포를 억제 말초 관용의 중요한 매개체 방지자가 면역 과도한 염증 일이다. Tregs의 중요성은, 중증 전신성자가 면역 질환에 이르게하는 Tregs의 손실로 인해`master&#39; TREG 전사 인자 forkhead 상자 P3의 돌연변이로 인간의 질병 immunodysregulation의 polyendocrinopathy의 병증의 X 연결된 증후군 (IPEX), (Foxp3를)을들 수있다 어린 나이에 치명적. 그러나 Tregs는 또한 특정 설정이있는 항 종양 면역을 방해 할 수있는 면역 체계의 양날의 검으로 작용한다. TREG 번호와 기능의 치료 조작은 수많은 임상 연구에 따라서 달라질 수 있습니다. 암에서 Tregs의 고갈은 바람직 할 수 있으며, 임상 적 접근 방법의 일부 성공은 추가 연구 (3)를 권장합니다. 세비에서 Tregs의 치료 효과뿐만 아니라자가 면역 및 염증 질환에RAL 마우스 질병 모델, 입양 TREG 전송의 최근 처음에 남자 임상 시험 그라프 대 -host 질환 (GVHD) 4 방지 - 7 매우 유망한 결과를 보여 주었다 제 1 형 당뇨병 (8) 치료에 안전성을 평가하기 위해. 11 - 자연 Tregs (nTregs가) 건강 (9)을 유지하는 비 중복 필수 기능과 흉선 유래 tTregs 및 주변으로 유도 pTregs를 포함 발생. 그러나 nTreg 번호는 순진한 T 세포 전구체 (12)으로부터 체외에서 유도 Tregs (iTregs)의 보완적인 접근 방식을 장려, 제한됩니다. 아마도 인해 Foxp3의 유전자 좌위 (13)의 소위 TREG 별 탈 메틸화 지역 (TSDR)에서 탈 메틸화 부족 iTregs의 또 안정성, 우려 남아 있고 여러 연구는 Tregs 유도 생체 내에서 14 더 안정되어 있음을 나타냅니다. 지금까지 Foxp3의 최고의 단백질 m 남아인간 기존의 CD4 + CD25- T 세포가 일시적으로 활성화 (15, 16)에 Foxp3의 중간 수준을 표현하기 때문에 Tregs에 대한 arker하지만 그것은 절대적으로 특정하지 않습니다. 상당한 진전은 Foxp3를 발현 조절되는지 설명 하였지만, 더 특히 인간 세포에서의 유도 Foxp3의 안정성 및 기능에 대하여 발견되고 유지된다. nTregs에 차이에도 불구하고, 시험 관내에서 Foxp3를 유도 + CD4 + T 세포는 Foxp3를 유도 분자 메커니즘을 연구하기위한 모델 시스템으로 사용할 수있는 더 유사한 iTregs의 생성을 허용 장래 프로토콜을 개발하는 시작점 미래의 입양 전송 전략에 적용 할 수있는 생성 Tregs를 생체. 거기에 인간 iTregs 유도 할`금 standard&#39; 프로토콜은없고, 현재 프로토콜 생체 TREG 유도 조건을 모방에 기초하여 개발되었다 : 2 (IL-2 인터루킨) 및 변형 성장 인자 β (TGF-β) 시그널링은 생체 17 Foxp3의 유도에 매우 중요하고, 올 - 트랜스 레티노 산 (ATRA) - 창자 연관된 수지상 세포에 의해 생체 내에서 생성되는 - 자주 Foxp3의 유도를 향상시키는 데 사용된다 21-18을 체외있다. 우리는 부티레이트 (22), 최근에 쥐 TREG 유도 (23, 24)을 증가시키기 위해 도시 된 장내 미생물 유래 단쇄 지방산을 사용하여 추가 인간 TREG 유도 프로토콜을 개발했습니다. 또한, 최근 그을 촉진하는 것으로 알려져 억제제 후자는 라파 마이신 (mTOR의)의 임상 적으로 승인 된 포유류 대상인, TGF-β, ATRA의 조합을 사용하여, 22 라파 마이신에 의해 시험관 내에서 우수한 억제 기능 iTregs의 생성을위한 새로운 프로토콜을 확립 인간의 TREG 확장 25, 26시 Foxp3의 유지 보수. 이 방법의 재현성을 설명합니다인간 CD4 + Foxp3의 + 상이한 조건들의 세트를 이용 iTregs 및 유세포 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응에 의해 그 이후의 표현형의 체외 세대 (QRT-PCR)은 Foxp3를 발현하고, 다른 TREG 서명 분자 등을의 프로토콜 별 무늬를 공개 CD25, CTLA-4, EOS뿐만 아니라, IFN-γ 및 SATB1 식 (22)의 억압 등. 생성 된 세포 집단은 일반적 Foxp3의 규제에 관한 또는 부티르산 또는 라파 마이신과 같은 특정 화합물은 특정 효과를 연구하거나, 억제 활성에 대한 기능 분석을 위해 또는 분자 연구에 사용될 수있다. TREG 차별화를 운전하는 분자 메커니즘의 추가 이해는 특히 TREG 생성과 기능에 관여하는 분자를 대상으로자가 면역 암에서 미래의 치료 접근에 매우 관련이있다.

<table><tbody><tr><td>올 트랜스 레티노산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anit-human Foxp3-APC 클론 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD25 microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD28 antibody, LEAF Purified&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 항체, LEAF Purified&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RA, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RO PE 클론 UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD4-PerCP 클론 SK3;mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD8-eFluor 450 (클론 OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>항-인간 CTLA-4 (CD152), 클론 BNI3, mIgG2ak, 브릴리언트 바이올렛 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>안티-휴먼 IFN-g FITC 클론 4S. 나3; mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A 함유 용액 : GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>cDNA 합성 키트 : SuperScript VILO (역전사 효소) cDNA 합성 키트</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>밀도 원심 분리 매체 : Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99.7 %</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 열 비활성화</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>고정 가능한 생존력 염료, eFluor 780&nbsp; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 또는 65-0865-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 염색 완충액 세트</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>주의: 파라포름알데히드가 포함되어 있습니다. 항체와 결합된 키트에서도 구입할 수 있습니다. 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 염색 세트 APC 클론: 236A/E7 세트</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>human naive CD4 T cell isolation kit II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>Human serum albumin 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS-columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG1 K Isotype Control FITC 50 &#956; g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, 클론 MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 플라스틱, 개별 포장</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Phorbol 12-미리스테이트 13-아세테이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>P1585-1MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>라파마이신</td><td>EMD (Merck)</td> <td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-2, CF</td><td>R & D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TGF-베타 1, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RNA 분리 키트: RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 미디엄&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>72400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 부티레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>B5887-250MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T 세포 배양 배지: X-Vivo 15 배지, 겐타마이신+페놀</td>레드 <td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 분석, FOXP3 (최상의 커버리지)&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182; 분석 ID: Hs01085834_m1</td><td>주의: 파라포름알데히드</td></tr><tr><td>포함 TaqMan 유전자 발현 분석, RPL13A (최상의 적용 범위)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370; 분석 ID: Hs04194366_g1&nbsp; &nbsp;</td><td>주의: 파라포름알데히드 함유</td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369514</td><td></td></tr></tbody></table>

tgf-β 함유 프로토콜을 사용하여 나이브 cd4 + t 세포에서 인간의 cd4 + foxp3의 + 유도 규제 t 세포 (itregs)의 체외 분화

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

조절 T 세포(Tregs)는 말초 내성의 필수적인 부분으로, 자기 구조에 대한 면역 반응을 억제하여 자가면역 질환을 예방합니다. Tregs를 양자로 옮기거나 암에서 Tregs를 고갈시키는 임상 접근법이 진행 중이며 유망한 첫 번째 결과가 있습니다. 
자연적으로 발생하는 Tregs(nTregs)의 수가 매우 제한되어 있기 때문에 in vitro induced Tregs(iTregs)를 사용하여 특정 Treg 기능을 연구하는 것이 유리할 수 있습니다. 현재까지 Tregs를 설명하는 절대적으로 특이적이지는 않지만 가장 좋은 단백질 마커는 전사 인자 FOXP3입니다. 말초적으로 유도된 Tregs의 중복되지 않는 역할을 포함한 Tregs의 중요성에도 불구하고 iTregs를 생성하는 프로토콜은 현재 특히 인간 세포에 대해 논란의 여지가 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 다양한 Treg 유도 인자(TGF-β와 IL-2만 또는 레티노산, 라파마이신 또는 부티레이트와의 조합)를 병렬적으로 사용하여 인간 미접촉 T 세포에서 인간 CD4+FOXP3+ iTregs의 체외 분화를 설명합니다. 또한 유세포 분석 및 qRT-PCR에 의한 이러한 세포의 표현형에 대해 설명합니다. 
이러한 프로토콜은 FOXP3 및 기타 Treg 시그니처 유전자의 재현 가능한 발현을 초래하고 일반적인 FOXP3 조절 메커니즘 및 프로토콜 특이적 효과를 연구하여 특정 요인의 영향을 설명할 수 있도록 합니다. iTregs는 Treg 유도의 분자 메커니즘뿐만 아니라 다양한 표현형 측면을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 상세한 분자 연구는 얻을 수 있는 비교적 큰 세포 수에 의해 촉진됩니다. 
iTregs의 적용에 대한 한계는 nTregs에 비해 이러한 세포에서 FOXP3 발현의 상대적 불안정성입니다. 이러한 프로토콜에 의해 생성된 iTregs는 TGF-β와 레티노산 및 라파마이신에 의해 유도된 iTregs가 우수한 억제 활성을 나타내는 억제 기능 연구와 같은 기능적 분석에도 사용할 수 있습니다. 그러나 iTregs의 억제 능력은 nTregs와 다를 수 있으며 적절한 제어의 사용이 중요합니다.

도 1은 실험 장치의 구조를 도시한다. 그림 2는 자기 절연 순진한 CD4 + T 세포와 nTregs에 대한 대표적인 순도 제어 염색을 보여줍니다. F의 igure 3a는 게이팅 전략 세포 계측법 흐름을 보여주고 그림 3b는 대표 Foxp3를하고 CD25가 표시 iTreg 또는 제어 조건 하에서 문화의 날 (6)에 염색과 유동 세포 계측법을 보여줍니다. 시험 관내 자극시에, 대부분의 세포는 라파 마이신의 존재 하에서 감소 CD25을 상향 조절. 전용 iTreg 유도 인자의 첨가하에 Foxp3의 + 세포의 명확한 인구도 iTreg 조건 하에서 CD25 + 세포 내에서 농축되는 명백해진다....

이 프로토콜은 체외 나이브 CD4 + T 세포로부터 재생 가능한 생성 유도 인간 T 조절 세포 (iTregs)의 표현형을 설명한다. Foxp3의 유도를위한 다른 프로토콜은 각각의 프로토콜로 얻은 특정 iTreg의 표현형 연구를 허용합니다.

TGF-β 함유 프로토콜을 사용하여 나이브 CD4 + T 세포에서 인간의 CD4 + Foxp3의 + 유도 규제 T 세포 (iTregs)의 체외 분화

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

이 실험의 전반적인 목표는 in vitro에서 naive CD4 T cell에서 human FOXP3 positive regulatory T cell을 유도하고 그 표현형을 분석하는 것입니다. 이 방법은 분자 수준에서 조절 T 세포 분화가 어떻게 발생하는지와 같은 T 세포 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 FOXP3 양성 조절 T 세포의 재현 가능한 생성 및 표현형을 허용한다는 것입니다.이 방법은 조절 T 세포 분화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 CD4 T 세포 하위 집합 및 기타 관심 면역 세포를 연구하기 위해 수정할 수도 있습니다. PBMC 및 자기 비트 분리 단계는 설명되는 것보다 표시되는 경우 쉽게 이해할 수 있기 때문에 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 말초 혈액 T 세포를 분리하려면 먼저 버피 코트당 5개의 50밀리리터 튜브에 15밀리리터의 실온 밀도 구배 매체를 추가하고 실온 PBS로 최종 버피 코트 부피를 최대 180밀리리터까지 가져옵니다.다음으로, 밀도 구배 매체의 튜브를 옆으로 기울이고 용액을 혼합하지 않고 밀도 구배 매체에 약 35ml의 희석된 혈액을 천천히 층을 이룹니다. 원심분리로 세포를 분리합니다. 그런 다음 각 튜브의 밀도 구배와 플라즈마 상 사이의 흰색 PBMC 층을 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 이동합니다.200ml의 새 PBS로 PBMC를 세척하고 플라스틱 부착에 의한 말초 혈액 단핵구의 고갈을 위해 펠릿을 완전한 배지에 다시 현탁시킵니다. 부유 세포를 수집한 후 PBMC를 최대 50ml의 새 PBS로 3회 세척하고 최종 펠릿을 섭씨 4도의 분리 완충액 40마이크로리터와 10배당 10배에서 7번째 세포로 순진한 CD4 양성 T 세포 비오틴 항체 칵테일에 다시 현탁시킵니다. 세포를 섭씨 4도에서 10분 동안 배양한 다음 섭씨 4도 PBS 40밀리리터로 세포를 세척하고 펠릿을 10배에서 7번째 세포에 1배당 80마이크로리터의 분리 완충액과 20마이크로리터의 항비오틴 마이크로비드에 다시 현탁시켜 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다.세포가 배양하는 동안 LS 컬럼을 자석에 놓고 3ml의 분리 완충액으로 평형을 이룬 다음 50ml의 PBS로 세포를 세척하고 3ml의 새로운 분리 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이제 세포를 컬럼에 추가하여 15ml 튜브에서 나이브 CD4 양성 T 세포 함유 플로우스루를 수집합니

in-vitro-differentiation-human-cd4-foxp3-induced-regulatory-t-cells

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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우리는 한 인간의 혈액 기증자로부터 규제, 메모리 및 나이브 T 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 편광 Tregs 그때도 여기에 설명된 억제 분석을 포함한 유전자 균질성와 유전 및 기능 다양한 어플 리케이션의 다른 하위 집합을 비교할 수 있습니다.

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순진한 CD4+ T cell은 활성화 시점의 환경에 따라 다양한 subset으로 분극화합니다.  naive CD4+ T cell을 다양한 effector subset으로 분화하는 것은 T cell receptor stimuli 및 specific cytokine signal의 추가를 통해 in vitro에서 달성할 수 있습니다.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

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뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

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