Name: 칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 DNA 상호 작용을 확인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 학습하세요 ChIP-exo 방법으로 단백질-DNA 상호작용을 가까운 염기쌍 해상도로 정밀 매핑하는 기법을. 이 프로토콜은 유전자 조절 및 후성유전학 연구에서 낮은 배경 소음으로 정확한 결합 위치를 식별합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

유익한 토론을 해주신 Venters Lab과 분자 생리학 및 생물물리학 부서 구성원들에게 감사드립니다. 제가 그의 연구실에서 박사 후 연구원으로 있을 때 ChIP-exo의 뉘앙스에 대한 지도, 멘토링 및 많은 통찰력 있는 토론을 해준 Frank Pugh에게 특별한 감사를 드립니다.

<ol><li>Venters, B. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+eukaryotic+genes+are+transcribed%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How eukaryotic genes are transcribed.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li>
<li>Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+MEF2+target+gene+analysis+in+cardiac+and+skeletal+muscle+reveals+novel+regulation+of+DUSP6+by+p38MAPK-MEF2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling.</a> Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+ArgR-DNA+complexes+at+the+genome-scale+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).</li>
<li>Katainen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%2Fcohesin-binding+sites+are+frequently+mutated+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer.</a> Nat Genet. 47, 818-821 (2015).</li>
<li>Murphy, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+protein-DNA+interaction+underlying+metazoan+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination.</a> Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).</li>
<li>Zere, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Targets+and+Features+of+BarA-UvrY+%28-SirA%29+Signal+Transduction+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems.</a> PLoS One. 10, e0145035(2015).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+structures+and+nucleosome+asymmetry+across+a+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome.</a> Cell. , 1377-1388 (2014).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> PLoS One. 11, e0149339(2016).</li>
<li>Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneTrack--a+genomic+data+processing+and+visualization+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework.</a> Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).</li>
<li>Bardet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+transcription+factor+binding+sites+from+ChIP-seq+data+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution.</a> Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MACE%3A+model+based+analysis+of+ChIP-exo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MACE: model based analysis of ChIP-exo.</a> Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).</li>
<li>Bentley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Illumina-based+ChIP-exonuclease+method+provides+insight+into+FoxA1-DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties.</a> Genome Biol. 14, R147(2013).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

<html> 우리는 염색질 근처 염기쌍 해상도 편견, 게놈 차원의 방식으로 단백질 상호 작용에 대한 정확한 결합 위치를 결정하기 위해 기능 유전체학 프로토콜을 제시한다. 면역 침전이 자성 수지에 남아있는 동안 근처 염기쌍 매핑 해상도를 얻기 위해 가장 중요한 단계는 칩 - 풍부 DNA의 엑소 뉴 클레아 제 처리이다. 표면 상, 단백질 복합체는 잠재적으로 주어진 서브 유닛 (예를 들어, 크로 마틴 리모델링 복합체 또는 뉴 클레오 코어 입자)의 생체 배출량 측정을 차단할 수 있습니다. 포름 알데히드 가교제 비효율적이기 때문에,로가 이전에보고 된 10, 그것은 더욱 복잡한 다중 소단위는 DNA에 가교 것 같지는 같은 궤적에서 동일 셀 내의 서로된다. 따라서, 이러한 뉴 클레오의 개별 히스톤 서브 유닛과 같은 단백질 복합체의 개별 서브 유닛의 생체 배출량 측정에서, 칩 - 엑소 가능합니다. t는 &quot;&gt; 칩 - 엑소의 가장 주목할만한 ...

크로 마틴 면역 침강 (칩)을 선택적으로 살아있는 세포에서 특정 단백질과 상호 작용하는 DNA 단편을 위해 농축에 의해 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 강력한 방법이다. 기술은 높은 처리량 시퀀싱 (칩-SEQ) 1 올리고 뉴클레오티드 마이크로 어레이 (칩 - 칩)에 하이브리드에 하나의 궤적 (표준 칩-qPCR에) 검출에서 향상으로 칩 농축 DNA 단편의 검출 방법은 진화했다. 칩-서열이 광범위한 응용 프로그램, 염색질 이질성과 비특이적 DNA 상호 작용을 볼 수 있지만 오탐 (false positive)과 부정확 한 매핑 최고의 데이터 품질을 방해했다. 이러한 제한을 우회하기 위해, 박사 프랭크 퓨는 칩 - 엑소 방법 (2)를 개발했다. 칩 엑소의 두드러진 특징은 효율적으로 위치를 결합 전사 인자를 footprinting에, 엑소 뉴 클레아 &#39;3&#39;, 5를 포함하고 있다는 것이다. 결과적으로, 칩 - 엑소 방법은 높은 해상도 detectio의 큰 동적 범위를 달성n 및 낮은 소음. 칩 - 엑소 좀 더 기술적으로 어려운 칩-서열보다 마스터하지만 연구는 다양한 생물학적 시스템 3-8를 사용하여 고유의 초 고해상도 통찰력을 확보하는 것을 목표로, 그것은 널리 채택되고있다. 실제로, 칩 엑소 성공적 박테리아, 효모, 마우스, 래트, 인간 세포 시스템에 적용되어왔다. 원리의 증거로, 칩 - 엑소는 원래 효모 전사의 소수는 2 요인에 대한 정확한 바인딩 모티브를 식별하는 데 사용되었다. 이 기술은 또한 전사 개시전 복합체의 구성을 연구하기 위해 다양한 히스톤 9,10 subnucleosomal의 구조를 해독 효모에 사용 하였다. 최근에, 우리는 인간의 발기인에 이벤트를 바인딩 인접 TFIIB와 폴 II를 해결하기 위해 칩 - 엑소을 활용, 별개의 개시 11 복합체에서 널리 발산 전사가 발생하는 것으로 나타났다. 여기에 제시된 워크 플로우 최적화의있다포유 동물 칩 - 엑소 (그림 1)에 대한 treamlined. 첫째, 생활 차 또는 조직 배양 세포를 공유 가교를 통해 생체 내 단백질 DNA 상호 작용에 보존하는 포름 알데히드로 처리됩니다. 세포 용균 및 염색질은 100 ~ 전단된다 - 500 염기쌍 크기 단편. 칩은 선택적으로 관심있는 단백질에 가교 결합 된 DNA 단편에 대한 풍부. 이 시점에서, 칩은 일반적 서열 라이브러리 본질적 수백 염기쌍 단편의 평균 크기를 검출 해상도를 제한하는 제조된다. 그러나, 칩 엑소 왼쪽 및 람다 엑소 뉴 클레아 제와 단백질의 DNA 가교 부위의 바로 5 &#39;DNA 경계를 트리밍함으로써 이러한 제한을 극복한다. 아래에 설명 된대로 시퀀싱 라이브러리는 다음 엑소 뉴 클레아 제 소화 DNA로 구성되어있다. 얻어진 중첩 5 &#39;테두리 단백질 DNA 상호 작용 (도 1, 스텝 14)의 생체 내 공간을 나타내고, 높은 처리량 시퀀싱에 의해 검출된다. Alt 키무릎이 칩 엑소 방법은 칩-서열보다 더 복잡 대부분의 단계 사이의 전환은 샘플 손실과 실험적인 변동성을 최소화 간단한 비드 세척을 필요로한다. 중요한 것은, 칩 - 엑소는 칩-SEQ, 또한 칩 - 엑소에 성공한다 칩-서열에 성공하는 샘플의 세련된 버전 때문이다. 칩 서열에서 근본적으로 구별되는 데이터 구조의 칩 엑소 결과 단백질 DNA의 상호 작용의 생체 배출량 측정. 공통 칩 서열 발신자가 가장 정확한 피크 호출을 수득 칩 엑소 데이터에 적용될 수 있지만, 우리는 특별히 염두 칩 엑소 데이터의 독특한 구조로 설계 정보학 도구를 추천한다. 이들은 Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla 및 ExoProfiler 12-15을 포함한다.

<table><tbody><tr><td>37% 포름알데히드, 메탄올 무함유, 10 x 10ml 앰플</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Section 3</td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI)</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Sections 4, 8</td></tr><tr><td>Bioruptor sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD200</td><td>Section 5</td></tr><tr><td>15 ml 폴리스티렌 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352095</td><td>Section 5</td></tr><tr><td>MagSepharose Protein G Xtra beads</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9670-66</td><td>Section 6</td></tr><tr><td>DynaMag-1.5 ml Side Magnetic Rack</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Section 6-17, 22</td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Section 7, 22</td></tr><tr><td>T4 DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0203</td><td>Section 9</td></tr><tr><td>DNA Polymerase I, Klenow</td><td>New England BioLabs</td><td>M0210</td><td>섹션 9</td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2 (10x 반응 버퍼 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7002</td><td>섹션 9-11, 13, 15, 20</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382</td><td>섹션 9-16</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche Life Science</td><td>010419979001</td><td>섹션 9, 11, 13</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td>섹션 9, 12, 19, 23</td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201</td><td>섹션 9, 13</td></tr><tr><td>dATP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0440</td><td>섹션 10, 20</td></tr><tr><td>Klenow 3'-5' Exo Minus</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212</td><td>섹션 10, 20</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202</td><td>섹션 11, 21</td></tr><tr><td>&Phi;-29 DNA 중합효소</td><td>New England BioLabs</td><td>M0269</td><td>섹션 12,</td></tr><tr><td>19 10x &Phi;-29 버퍼</td><td>New England BioLabs</td><td>B0269</td><td>섹션 12, 19</td></tr><tr><td>Lambda 엑소뉴클레아제</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262</td><td>섹션</td></tr><tr><td>14 10x Lambda 버퍼</td><td>New England BioLabs</td><td>B0262</td><td>섹션 14</td></tr><tr><td>RecJf Exonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0264</td><td>Section 15</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Life Science</td><td>03115828001</td><td>Section 16</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche Life Science</td><td>010901393001</td><td>Section 18</td></tr><tr><td>10x T4 Ligase Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202</td><td>Section 21</td></tr><tr><td>AMPure XP (clean up) 비즈&nbsp;</td><td>벡크만 콜터</td><td>A63881</td><td>섹션 22</td></tr><tr><td>Q5 핫 스타트 DNA 중합효소&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0493</td><td>Section 23</td></tr><tr><td>5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer)</td><td>New England BioLabs</td><td>B9027</td><td>Section 23</td></tr><tr><td>QIAquick Gel 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Section 25</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>Section 26</td></tr><tr><td>Optical Clear Qubit tubes&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td>Section 26</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA 고감도 어세이 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Section 26</td></tr></tbody></table>

칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 dna 상호 작용을 확인

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

크로 마틴 면역 침강 (칩)은 후성 유전학 및 특정 단백질 DNA 상호 작용을 분리 유전자 조절의 분야에서 필수적인 도구입니다. 높은 처리량 시퀀싱 (칩 서열)에 결합 된 칩은 일반적으로 염색질 상호 작용 단백질의 게놈 위치를 결정하기 위해 사용된다. 그러나, 칩 서열은 수백 염기쌍 비교적 낮은 매핑 해상도 및 높은 백그라운드 신호에 의해 방해된다. 칩 엑소 방법은 실질적으로 해상도 및 노이즈 모두 개선 한 칩 서열의 정제 된 버전이다. 칩 엑소 방법론의 키 차이는 효과적으로 왼쪽 풋 프린트 라이브러리 준비 워크 플로의 람다 엑소 뉴 클레아 제 소화의 설립 및 단백질 DNA의 가교 사이트의 오른쪽 5 &#39;DNA 테두리입니다. 칩 엑소 라이브러리는 다음 높은 처리량 시퀀싱을 실시한다. 얻어진 데이터는 기능적 조직 O에 고유 초 고해상도 통찰력을 제공하기 위해 활용 될 수있다게놈 바. 여기, 우리는 우리가 최적화 및 포유류 시스템과 차세대 시퀀싱 합성에 의한 플랫폼 간소화 한 칩 - 엑소 방법을 설명합니다.

다음 그림은 여기에 제시된 칩 - 엑소 프로토콜 대표 결과를 보여줍니다. 몇 효소 단계를 기존의 칩-SEQ 방법과는 달리, 칩 - 엑소는 열한 순차적으로 의존 효소 반응 (그림 1)가 필요합니다. 따라서, 치료는 각 반응 성분이 각각의 반응 마스터 믹스에 추가되도록 각 단계에서 수행되어야한다. 우리는 생성 된 표를 인쇄하는 자동 반응 마스터 믹스 계산을 수행하는 반응 테이블에 기초하여 공식화 된 스프레드 시트를 생성하고,이를 마스터 믹스를 첨가 한 후 각 항목을 확인 바랍니다. 우리는 고품질 시퀀싱 결과 (도 2)를 확인하기 위해 프로토콜을 통하여 품질 관리 방법들을 이용한다. 각 칩의 반응은 세 가지 기본 구성 요소가 포함되어 있습니다 : 1) intere의 세포에서 염색질 추출물을 초음파세인트 관...

여기에서는 단백질-DNA 상호 작용의 염기쌍에 가까운 해상도를 달성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이는 염색질 면역침전(ChIP-exo)으로 선택적으로 농축된 DNA 단편의 엑소뉴클레아제 처리에 이어 고처리량 염기서열분석(high throughput sequencing)을 통해 얻을 수 있습니다.

칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 DNA 상호 작용을 확인

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

이 기능적 게놈 기술의 전반적인 목표는 주어진 단백질이 살아있는 세포에서 차지하는 정확한 게놈 위치를 식별하는 것입니다. 이 방법은 유전자 조절 및 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 전사 기계가 염색질의 맥락에서 어떻게 조립되고 작동하는지와 같은 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 낮은 배경으로 거의 염기 사전 해상도에서 단백질 DNA 상호 작용에 대한 정확한 게놈 위치를 밝힌다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 프로토콜이 복잡하고 전체적으로 세부 사항에 주의를 기울여야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 핵 용해물을 초음파 처리하려면 먼저 핵 추출물이 들어있는 15 밀리리터 폴리스티렌 튜브에 수지 어댑터를 배치하십시오. 얼음처럼 차가운 물 중탕에서 용해물을 30초 동안 켜고 30초 동안 끄고 총 15분 세션 2회 초음파 처리합니다.초음파 처리 결과를 확인하려면 각 튜브에서 1.5 밀리리터 튜브로 10 마이크로 리터 샘플 2 개를 옮깁니다. 그런 다음 처음 10 마이크로 리터 샘플과 10 마이크로 리터의 TE-RNase A 및 0.2 마이크로 리터의 단백질 분해 효소 K를 결합하여 30 분 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다. 그런 다음 4마이크로리터의 6X 자일렌 DNA 염료를 추가합니다.두 번째 10 마이크로리터 샘플에 2 마이크로리터의 6X 자일렌 DNA 염료를 첨가하여 가교를 보존합니다. 140볼트의 1.5% 아가로스 젤에서 두 샘플을 약 30-45분 동안 두 샘플을 모두 실행하여 후자의 브로모페놀 염료가 젤 아래의 3/4이 될 때까지 실행합니다. 초음파 처리에 성공하면 초음파 처리 된 용해물을 150 마이크로 리터의 10 % Triton X-100 및 와류를 포함하는 2 개의 밀리리터 튜브로 옮겨 혼합합니다.펠릿은 20, 10 분 동안 4 섭씨 온도에 20, 000 시간 g에 초음파 처리 된 lysatate를 회전시켜서 불용해성 염색질 및 파편을 펠릿화하십시오. 그런 다음 상등액을 새로운 2 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 샘플을 섭씨 영하 80도에서 무기한 보관하십시오.각 염색질 면역침전 또는 ChIP 반응에 대해 1.5 ml의 초음파 추출물과 1.5 millil 튜브에 항체 비드 접합체를 결합합니다. 미니 튜브 회전판의 튜브를 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 9도의 속도로 배양합니다. 몇 분 후에 샘플이 누출되지 않고 제대로 혼합되고 있는지 확인하십시오.다음 날, 튜브를 아주 잠깐 돌려 캡에 액체를 모으고 튜브를 1분 동안 마그네틱 랙에 놓습니다. 그런 다음 추출물을 흡인합니다. 각 튜브에 0.75ml의 RIPA 버퍼를 추가합니다.그런 다음 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 여러 번 뒤집어 혼합합니다. 잠시 회전한 후 튜브를 자석에 다시 놓고 상층액을 흡인합니다. 마지막 세척 후 각 튜브에 0.75ml의 10밀리몰 Tris HCL을 추가합니다.마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 샘플을 여러 번 뒤집어 혼합합니다. 잠시 회전한 후 튜브를 랙에 다시 놓고 상층액을 흡입합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 연마 및 상세 반응을 수행한 후 ligation master mix 계산을 작성합니다.그런 다음 얼음과 피펫에 1.5ml 튜브에 결찰 혼합물을 만들어 용액을 혼합합니다. 마그네틱 랙에 있는 샘플 튜브를 사용하여 48마이크로리터의 P7 결찰 마스터 믹스와 2마이크로리터의 다른 어댑터 인덱스를 각 샘플 수지에 추가합니다. ThermoMixer에서 시료를 섭씨 25도에서 3배 g으로 2시간 동안 배양합니다.샘플을 세척하고 텍스트 프로토콜에 따라 Phy 29 흠집 복구 및 키나아제 반응을 수행한 후 람다 엑소뉴클레아제 마스터 믹스 계산을 작성하고 얼음 위의 1.5ml 튜브에서 람다 엑소뉴클레아제 혼합물을 만듭니다. 50마이크로리터의 람다 엑소뉴클레아제 혼합물을 마그네틱 랙에 있는 동안 각 샘플 수지에 추가합니다. 그런 다음 ThermoMixer에서 섭씨 37도에서 g을 3회 가열하여 30분 동안 샘플을 배양합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마지막 세척을 흡인한 후 RecJf 마스터 믹스 계산을 작성하고 얼음에서 RecJf 믹스를 만들어 RecJf 뉴클레아제 반응을 수행합니다. 마그네틱 랙의 각 샘플 레진에 50마이크로리터의 RecJf 혼합물을 추가합니다. 그런 다음 ThermoMixer에서 섭씨 37도에서 g을 3회 가열하여 30분 동안 샘플을 배양합니다.마지막 세척을 흡인한 후 ChIP 용출 완충액과 proteinase K 마스터 믹스를 준비하고 각 샘플 수지에 200마이크로리터의 용액을 추가합니다. ThermoMixer에서 섭씨 65도에서 3회 g으로 하룻밤 동안 가열된 뚜껑을 열어 응결을 방지합니다. 다음 날, 샘플을 간단히 회전시키고 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓습니다.그런 다음 200마이크로리터의 상등액을 200마이크로리터의 TE 완충액이 들어 있는 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. DNA 추출, P7 1차 확장 및 ATL 반응 후 P5 어댑터 결찰표 마스터 믹스 계산을 작성하고 얼음 위에서 결찰 마스터 믹스를 만듭니다. 20마이크로리터의 결찰 혼합물을 각 샘플에 추가하고 혼합할 피펫을 추가합니다.그런 다음 섭씨 25도의 열 순환기에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 DNA 정제 및 정량화를 수행합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 100에서 500 염기쌍 사이의 DNA 단편을 생성하는 고품질 염색질 추출물을 얻기 위해 초음파 처리 조건을 최적화하는 데 시간을 할애할 가치가 있습니다.그리고 전기영동 이동성 이동 분석법은 초음파 처리된 추출물에 DNA 단편의 슈퍼 시프트로 명백한 온전한 단백질 DNA 가교가 포함되어 있는지 확인하는 데 사용됩니다. 배경 신호를 평가하기 위해 반응에 항체가 없는 상태에서 모의 ChIP를 일상적으로 수행합니다. 고품질 ChIP 엑소 라이브러리는 ChIP-seq 라이브러리 준비에 비해 모의 샘플에서 배경 지식을 거의 제공하지 않습니다.여기에 표시된 것은 ChIP-exo 라이브러리에 대한 바이오분석기 평가입니다. 분석은 라이브러리 크기 분포를 정확하게 보장하고 125개의 염기쌍에서 실행되는 오염 어댑터 이량체를 검출합니다. 이 패널은 증식하는 K562 세포의 인간 RPS12 유전자에서 중합효소 II, TFIIB 및 TBP에 대한 가닥 분리된 ChIP-exo 태그 5개의 프라임 N이 원활하게 분포하는 것을 보여줍니다.이 그림에는 단백질 코딩 유전자의 전사 시작 부위와 관련된 평균 ChIP-엑소 패턴이 나와 있습니다. 복합 플롯에서 TBP, TFIIB 및 중합효소 II의 주요 피크 위치는 인간 전사 시작 복합체의 게놈 조직을 반영합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4일 안에 완료할 수 있습니다.개발 후,이 기술은 유전자 조절 분야의 연구자들이 효모의 assymetry에서 핵 아래 구조의 분자 세부 사항을 탐구 할 수있는 길을 열었습니다. 이 절차에 따라 RNase 탐색 발현 프로파일링과 같은 다른 방법을 수행하여 주어진 요인이 주변 유전자의 발현에 영향을 미치는지 여부와 같은 질문을 해결할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 효소 단계에 대해 마스터 믹스 표를 주의 깊게 작성하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.발암 물질 및 기타 부식제로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 고품질 ChIP-exo 라이브러리를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

the-chip-exo-method-identifying-protein-dna-interactions-with-near

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)에 의한 염색질 상호 작용 분석을위한...

염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

이 비디오에서는 단백질 결합 염색질 단편의 선택적 면역침전을 통해 희소돌기아교세포 전구체 세포의 게놈 DNA의 특정 영역에서 단백질 결합 부위를 식별하는 염색질 면역침전 기술을 보여줍니다. 이 방법은 유전자 조절에 관여하는 전사 인자를 포함한 여러 조절 단백질의 상호 작용을 연구하는 데 도움이 됩니다.

게놈 DNA의 표적 단백질 결합 부위를 확인하기 위한 크로마틴 면역침전(chromatin immunoprecipitation)

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

이 비디오 문서는 두 개의 구성 요소 시스템 응답 레귤레이터 유전자 표적 및 결합 부위를 결정하기 위해 시험 관내 마이크로 어레이 기반의 방법을 설명한다.

세균에 대한 두 개의 구성 요소 규제 시스템을 유전자 표적을 확인하는 DNA 친화력 - 정제 칩 (DAP-칩) 방법

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

DNA 리간드를 이용한 ATP 의존형 크로마틴 리모델링기의 상호 작용은 CD 분광법을 사용하여 설명된다. 생성된 봉우리에 의해 분석된 유전자 프로모터에 대한 유도된 변형 변화는 전사 조절의 메커니즘을 이해하는 데 사용될 수 있다.

DNA 단백질 상호 작용을 연구하는 CD 분광법

CUT&amp;RUN 및 그 변이체는 크로마틴에 대한 단백질 점유율을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 단일 세포 uliCUT&amp;RUN을 사용하여 크로마틴에 대한 단백질 국소화를 결정하는 방법을 설명합니다.

표적 하에서 초저 입력 절단을 이용한 크로마틴에 대한 단일 세포 인자 국소화 및 뉴클레아제를 이용한 방출

직접 lncRNA-단백질 상호작용을 식별하는 자외선 기반 ChIRP 방법.

LncRNA와 직접 상호작용하는 단백질을 검증 가능한 확인을 위한 자외선 기반 ChIRP 방법 - 배양된 세포부터 마우스 고환까지"

학습하세요 ChIP-exo 방법으로 단백질-DNA 상호작용을 가까운 염기쌍 해상도로 정밀 매핑하는 기법을. 이 프로토콜은 유전자 조절 및 후성유전학 연구에서 낮은 배경 소음으로 정확한 결합 위치를 식별합니다.

칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 DNA 상호 작용을 확인

더 많은 동영상 탐색