칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 DNA 상호 작용을 확인

이 기능적 게놈 기술의 전반적인 목표는 주어진 단백질이 살아있는 세포에서 차지하는 정확한 게놈 위치를 식별하는 것입니다. 이 방법은 유전자 조절 및 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 전사 기계가 염색질의 맥락에서 어떻게 조립되고 작동하는지와 같은 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 낮은 배경으로 거의 염기 사전 해상도에서 단백질 DNA 상호 작용에 대한 정확한 게놈 위치를 밝힌다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 프로토콜이 복잡하고 전체적으로 세부 사항에 주의를 기울여야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 핵 용해물을 초음파 처리하려면 먼저 핵 추출물이 들어있는 15 밀리리터 폴리스티렌 튜브에 수지 어댑터를 배치하십시오. 얼음처럼 차가운 물 중탕에서 용해물을 30초 동안 켜고 30초 동안 끄고 총 15분 세션 2회 초음파 처리합니다.

초음파 처리 결과를 확인하려면 각 튜브에서 1.5 밀리리터 튜브로 10 마이크로 리터 샘플 2 개를 옮깁니다. 그런 다음 처음 10 마이크로 리터 샘플과 10 마이크로 리터의 TE-RNase A 및 0.2 마이크로 리터의 단백질 분해 효소 K를 결합하여 30 분 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다. 그런 다음 4마이크로리터의 6X 자일렌 DNA 염료를 추가합니다.

두 번째 10 마이크로리터 샘플에 2 마이크로리터의 6X 자일렌 DNA 염료를 첨가하여 가교를 보존합니다. 140볼트의 1.5% 아가로스 젤에서 두 샘플을 약 30-45분 동안 두 샘플을 모두 실행하여 후자의 브로모페놀 염료가 젤 아래의 3/4이 될 때까지 실행합니다. 초음파 처리에 성공하면 초음파 처리 된 용해물을 150 마이크로 리터의 10 % Triton X-100 및 와류를 포함하는 2 개의 밀리리터 튜브로 옮겨 혼합합니다.

펠릿은 20, 10 분 동안 4 섭씨 온도에 20, 000 시간 g에 초음파 처리 된 lysatate를 회전시켜서 불용해성 염색질 및 파편을 펠릿화하십시오. 그런 다음 상등액을 새로운 2 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 샘플을 섭씨 영하 80도에서 무기한 보관하십시오.

각 염색질 면역침전 또는 ChIP 반응에 대해 1.5 ml의 초음파 추출물과 1.5 millil 튜브에 항체 비드 접합체를 결합합니다. 미니 튜브 회전판의 튜브를 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 9도의 속도로 배양합니다. 몇 분 후에 샘플이 누출되지 않고 제대로 혼합되고 있는지 확인하십시오.

다음 날, 튜브를 아주 잠깐 돌려 캡에 액체를 모으고 튜브를 1분 동안 마그네틱 랙에 놓습니다. 그런 다음 추출물을 흡인합니다. 각 튜브에 0.75ml의 RIPA 버퍼를 추가합니다.

그런 다음 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 여러 번 뒤집어 혼합합니다. 잠시 회전한 후 튜브를 자석에 다시 놓고 상층액을 흡인합니다. 마지막 세척 후 각 튜브에 0.75ml의 10밀리몰 Tris HCL을 추가합니다.

마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 샘플을 여러 번 뒤집어 혼합합니다. 잠시 회전한 후 튜브를 랙에 다시 놓고 상층액을 흡입합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 연마 및 상세 반응을 수행한 후 ligation master mix 계산을 작성합니다.

그런 다음 얼음과 피펫에 1.5ml 튜브에 결찰 혼합물을 만들어 용액을 혼합합니다. 마그네틱 랙에 있는 샘플 튜브를 사용하여 48마이크로리터의 P7 결찰 마스터 믹스와 2마이크로리터의 다른 어댑터 인덱스를 각 샘플 수지에 추가합니다. ThermoMixer에서 시료를 섭씨 25도에서 3배 g으로 2시간 동안 배양합니다.

샘플을 세척하고 텍스트 프로토콜에 따라 Phy 29 흠집 복구 및 키나아제 반응을 수행한 후 람다 엑소뉴클레아제 마스터 믹스 계산을 작성하고 얼음 위의 1.5ml 튜브에서 람다 엑소뉴클레아제 혼합물을 만듭니다. 50마이크로리터의 람다 엑소뉴클레아제 혼합물을 마그네틱 랙에 있는 동안 각 샘플 수지에 추가합니다. 그런 다음 ThermoMixer에서 섭씨 37도에서 g을 3회 가열하여 30분 동안 샘플을 배양합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마지막 세척을 흡인한 후 RecJf 마스터 믹스 계산을 작성하고 얼음에서 RecJf 믹스를 만들어 RecJf 뉴클레아제 반응을 수행합니다. 마그네틱 랙의 각 샘플 레진에 50마이크로리터의 RecJf 혼합물을 추가합니다. 그런 다음 ThermoMixer에서 섭씨 37도에서 g을 3회 가열하여 30분 동안 샘플을 배양합니다.

마지막 세척을 흡인한 후 ChIP 용출 완충액과 proteinase K 마스터 믹스를 준비하고 각 샘플 수지에 200마이크로리터의 용액을 추가합니다. ThermoMixer에서 섭씨 65도에서 3회 g으로 하룻밤 동안 가열된 뚜껑을 열어 응결을 방지합니다. 다음 날, 샘플을 간단히 회전시키고 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓습니다.

그런 다음 200마이크로리터의 상등액을 200마이크로리터의 TE 완충액이 들어 있는 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. DNA 추출, P7 1차 확장 및 ATL 반응 후 P5 어댑터 결찰표 마스터 믹스 계산을 작성하고 얼음 위에서 결찰 마스터 믹스를 만듭니다. 20마이크로리터의 결찰 혼합물을 각 샘플에 추가하고 혼합할 피펫을 추가합니다.

그런 다음 섭씨 25도의 열 순환기에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 DNA 정제 및 정량화를 수행합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 100에서 500 염기쌍 사이의 DNA 단편을 생성하는 고품질 염색질 추출물을 얻기 위해 초음파 처리 조건을 최적화하는 데 시간을 할애할 가치가 있습니다.

그리고 전기영동 이동성 이동 분석법은 초음파 처리된 추출물에 DNA 단편의 슈퍼 시프트로 명백한 온전한 단백질 DNA 가교가 포함되어 있는지 확인하는 데 사용됩니다. 배경 신호를 평가하기 위해 반응에 항체가 없는 상태에서 모의 ChIP를 일상적으로 수행합니다. 고품질 ChIP 엑소 라이브러리는 ChIP-seq 라이브러리 준비에 비해 모의 샘플에서 배경 지식을 거의 제공하지 않습니다.

여기에 표시된 것은 ChIP-exo 라이브러리에 대한 바이오분석기 평가입니다. 분석은 라이브러리 크기 분포를 정확하게 보장하고 125개의 염기쌍에서 실행되는 오염 어댑터 이량체를 검출합니다. 이 패널은 증식하는 K562 세포의 인간 RPS12 유전자에서 중합효소 II, TFIIB 및 TBP에 대한 가닥 분리된 ChIP-exo 태그 5개의 프라임 N이 원활하게 분포하는 것을 보여줍니다.

이 그림에는 단백질 코딩 유전자의 전사 시작 부위와 관련된 평균 ChIP-엑소 패턴이 나와 있습니다. 복합 플롯에서 TBP, TFIIB 및 중합효소 II의 주요 피크 위치는 인간 전사 시작 복합체의 게놈 조직을 반영합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4일 안에 완료할 수 있습니다.

개발 후,이 기술은 유전자 조절 분야의 연구자들이 효모의 assymetry에서 핵 아래 구조의 분자 세부 사항을 탐구 할 수있는 길을 열었습니다. 이 절차에 따라 RNase 탐색 발현 프로파일링과 같은 다른 방법을 수행하여 주어진 요인이 주변 유전자의 발현에 영향을 미치는지 여부와 같은 질문을 해결할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 효소 단계에 대해 마스터 믹스 표를 주의 깊게 작성하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

발암 물질 및 기타 부식제로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 고품질 ChIP-exo 라이브러리를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.