Name: SorLA 및 CLC : 웨스턴 블로 팅, 리소좀 효소의 억제 및 면역 세포에 의해 입증으로 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 웨스턴 블로팅과 면역세포화학법을 이용하여 SorLA와 CLC:CLF-1이 CNTFRα의 용소체 분해를 매개하는 과정을 연구하는 방법입니다. 이 비방사성 기법은 막 단백질 회전율 분석에 적합합니다.

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CNTFRα 해물 1. 웨스턴 블로 팅 <ol><li> 전체 길이 sorLA 및 Myc와-태그 CNTFRα 인간 배아 신장에 구축 표현 된 pcDNA3.1 / ZEO 사용하여 293 (HEK293) 세포 (-) 및 한 pcDNA3.1 / HYG을 (-), 각각. 작 제물은 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 형질 감염 시약을 이용하여 HEK293 세포를 형질 감염. 150 μg의 / mL로 오신 및 / 또는 500 μg의 / mL의 하이 그로 마이신 B 골드 (13)를 포함하는 배지에서 안정적인 클론을 선택합니다. </li><li> HEK293의 씨앗 동일한 번호는 표현 중 하나 CNTFRα-Myc와 또는 형질의 공동 발현 Eagle&#39;s 중간 (DMEM) 수정 된 둘 베코의 세포가 10 %의 태아 보충 그림 1. 문화에서와 같이 두 개의 4 웰 플레이트에 CNTFRα-Myc와 / sorLA을 소 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린, 37 ℃에서 5 % 이산화탄소 배양기에서 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 (완전 배지). </li><li> 80 % 합류 - 세포가 50 때까지 기다립니다. </li><li> 로부터 매체를 제거우물, 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)로 한번 세척하고, 또는 (제어) 10 나노 CLC없이 신선한 전체 매체를 추가 : CLF-1도 1에 나타낸 바와 같이. 37 ℃에서 세포를 품어. </li><li> 배양의 0 ~ 5 시간 후, 매체를 복구하고 1.5 mL의 튜브를 4 ℃에서 보관합니다. 이어서 각 웰에 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 (1 분, 4 ℃)으로 보충 된 1 % 트리톤 X-100 용해 완충액 (20 mM의 트리스 -HCl, 10 mM의 EDTA, pH를 8.0)을 추가한다. 그 후, 1.5 ㎖의 튜브 (4 ℃)에 세포 용 해물을 전송합니다. </li><li> 배지 및 세포 용해질 (3000 XG, 3 분, 4 ℃)를 포함하는 튜브를 회전 및 1.5 ㎖의 튜브 (4 ℃)하여 상청액을 전송. 펠렛을 폐기하십시오. 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 각각 파쇄 상등액 5 μL 이전 - 이후 단백질 함량을 측정하기 위해 그들을 사용 (170 단계). 즉시 모든 상청액을 비 환원 LDS 샘플 완충액을 추가 샘플을 소용돌이. </li><li> PROT를 측정하는 5 μL 분취 액을 사용하여제조사의 프로토콜에 따라 상업적 단백질 분석법을 사용하여 세포 용 해물의 상청액 EIN 콘텐츠. </li><li> 5 분 동안 95 ℃에서 시료를 가열한다. </li><li> (5 13 블 롯팅 SDS-PAGE (13)을 감소시키고 웨스턴 각 시료에서 단백질의 동량을 대상 방지 sorLA 16의 토끼를 사용하여 배지에 상기 세포 용 해물에 sorLA, β 액틴 및 CNTFRα-Myc와의 내용을 시각화 μg의 / ㎖), 마우스 항 β 액틴 (0.4 μg의 / ㎖) 및 항 - 마우스 나 Myc (1 μg의 / ㎖) 항체 및 적절한 HRP 결합 된 이차 항체 (1 : 2000). </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 농도계에 의해 밴드를 정량화. </li></ol> 리소좀 억제제와 병용 2. 면역 세포 화학 <ol><li> 그림 2와 같이 종자 HEK293 세포를 안정적으로 4 웰 플레이트에서 커버 슬라이드에 CNTFRα-Myc와 / sorLA로 형질. 문화 상기 완전 배지에서 세포. </li><li>40 % - 셀 합류 20 때까지 기다립니다. </li><li> 우물에서 매체를 제거하고 그림 2에 나타낸 바와 같이, 또는 류 펩틴의 50 μg의 / mL를하지 않고 세포에 펩 스타틴 A (레우 / PEP) (억제 리소좀 가수 분해 효소)의 전체 매체를 추가합니다. 37 ℃에서 세포를 품어. 매체는 배양 다음 24 시간 동안 매 6 시간을 교체해야합니다. </li><li> 24 시간 배양 한 후, 다시 한 번 (레우 / 격려와 함께 또는없이) 매체를 교체하고이 시간은 10 나노 CLC 추가 : CLF-1. 5 시간 동안 37 ℃에서 세포를 품어. </li><li> PBS에 한 번 세포를 세척하고 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드, pH가 7을 수정합니다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 피부, 눈 및 점막에 닿지 않도록, 매우 독성이다. 장갑, 보호 안경 착용과 솔루션은 흄 후드 내에서해야한다. </li><li> PBS에 한 번 세포를 씻고 PBS에 희석 사포닌에서 RT에서 5 분 (0.5 % 사포닌)의 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> 염소 항 CNTFRα 희석 (1 μg의 / ㎖) (특히아니라 마우스 항 Myc와 0.5 % 사포닌의 웨스턴 블롯), 마우스 안티 LAMP-1 (15 μg의 / ㎖) 항체를 사용하고 RT에서 2 시간 동안 항체와 세포를 배양한다. </li><li> 0.5 % 사포닌의 셀 4 배 (5 분) 세척 및 당나귀 방지 염소 알렉사 488-와 당나귀 항 - 마우스 알렉사 568 - 복합 이차 항체 (6 μg의 / mL)을 실온에서 2 시간 동안 함께 세포를 배양. </li><li> 두 번 탈 이온수 (1 분)에, 0.5 % 사포닌의 셀 4 배 (5 분) 세척 및 설치 미디어를 사용하여 슬라이드 현미경 커버 슬라이드를 탑재합니다. </li><li> 63X C-고차 색지움 물 침지 목표, NA 1.2 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 공 초점 현미경으로 세포의 항체 염색을 분석합니다. </li></ol> pSTAT3 수준 3. 서양 얼룩 검출 <ol><li> 도 3에 도시 된 바와 같이, 4- 웰 플레이트 (CNTFRα의 내인성 수준을 발현) 시드 - HEK293 세포 sorLA. 문화 상기 완전 배지에서 세포. </li><li> 때까지 기다립니다80 % 합류 - 셀 (50)이다. </li><li> , 우물에서 매체를 제거 PBS에 한 번 세척하고, 나노 CLC 또는 10 않고 신선한 전체 매체를 추가 : CLF-1 세포에 그림 3에 나타낸 바와 같이. 5 시간 동안 37 ℃에서 세포를 품어. </li><li> , 매체를 제거 비추 DMEM에서 두 번 세포를 씻어 (빈 매체, FBS와 항생제없이), 다음 빈 배지에서 90 분 (37 ℃)에 대한 세포를 reincubate. </li><li> 그림 3에 나타낸 바와 같이 (STAT3 인산화를 시작합니다) CLF-1 : 다시 한번, 매체를 제거하고 또는 5 나노 CLC없이 비어있는 새 매체를 추가합니다. 37 ℃에서 15 분 동안 품어. </li><li> 빠르게 (1 분, 4 ℃)는 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 및 포스파타제 억제제가 보충 1 % 트리톤 X-100 용해 완충액 (20 mM의 트리스 -HCl, 10 mM의 EDTA, pH를 8.0)을 첨가하여 세포를 배지를 제거하고 용균 각 웰에 칵테일입니다. 그 후, 1.5 ㎖의 튜브 (4 ℃)에 세포 용 해물을 전송합니다. </li><li> 이전 5 μL 오F 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 각각 상등액 - (380 단계) 이후, 단백질 함량을 측정하도록 사용한다. 즉시 모든 상청액을 비 환원 LDS 샘플 완충액을 추가 샘플을 소용돌이. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 단백질 분석을 이용하여 5 μL 분취 액의 단백질 함량을 측정한다. </li><li> 더 이상 점착성 (약 1 분) 다음에있는 5 분 동안 95 ℃에서 가열을 RT까지 각 샘플을 초음파 처리 없음. </li><li> SDS-PAGE (13) 및 웨스턴 13 블 각 샘플로부터 단백질의 동량을 대상 토끼에게 항 pSTAT3 (1 : 2000)를 사용하여 세포 용 해물에서 pSTAT3의 내용 및 전체 STAT3 시각화 항 STAT3 및 마우스 (1 : 1000 ) 항체 및 해당 HRP-연결된 마우스와 토끼 보조 항체 (1 : 2000). </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 농도계에 의해 밴드를 정량화. </li></ol>

<ol><li>Elson, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLF+associates+with+CLC+to+form+a+functional+heteromeric+ligand+for+the+CNTF+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CLF associates with CLC to form a functional heteromeric ligand for the CNTF receptor complex.</a> Nat Neurosci. 3 (9), 867-872 (2000).</li>
<li>Senaldi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+neurotrophin-1%2FB+cell-stimulating+factor-3%3A+a+cytokine+of+the+IL-6+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel neurotrophin-1/B cell-stimulating factor-3: a cytokine of the IL-6 family.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 11458-11463 (1999).</li>
<li>Elson, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-like+factor-1%2C+a+novel+soluble+protein%2C+shares+homology+with+members+of+the+cytokine+type+I+receptor+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokine-like factor-1, a novel soluble protein, shares homology with members of the cytokine type I receptor family.</a> J Immunol. 161 (3), 1371-1379 (1998).</li>
<li>Lelievre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+recruited+by+the+cardiotrophin-like+cytokine%2Fcytokine-like+factor-1+composite+cytokine%3A+specific+requirement+of+the+membrane-bound+form+of+ciliary+neurotrophic+factor+receptor+alpha+component%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways recruited by the cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor-1 composite cytokine: specific requirement of the membrane-bound form of ciliary neurotrophic factor receptor alpha component.</a> J Biol Chem. 276 (25), 22476-22484 (2001).</li>
<li>Zou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Death+in+Mice+Lacking+Cardiotrophin-Like+Cytokine+%28CLC%29+is+Associated+with+Multifocal+Neuronal+Hypoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neonatal Death in Mice Lacking Cardiotrophin-Like Cytokine (CLC) is Associated with Multifocal Neuronal Hypoplasia.</a> Vet Pathol. 46 (3), 514-519 (2008).</li>
<li>Forger, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiotrophin-like+cytokine%2Fcytokine-like+factor+1+is+an+essential+trophic+factor+for+lumbar+and+facial+motoneurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 is an essential trophic factor for lumbar and facial motoneurons in vivo.</a> J Neurosci. 23 (26), 8854-8858 (2003).</li>
<li>Alexander, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suckling+defect+in+mice+lacking+the+soluble+haemopoietin+receptor+NR6%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Suckling defect in mice lacking the soluble haemopoietin receptor NR6.</a> Curr Biol. 9 (11), 605-608 (1999).</li>
<li>DeChiara, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+lacking+the+CNTF+receptor%2C+unlike+mice+lacking+CNTF%2C+exhibit+profound+motor+neuron+deficits+at+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mice lacking the CNTF receptor, unlike mice lacking CNTF, exhibit profound motor neuron deficits at birth.</a> Cell. 83 (2), 313-322 (1995).</li>
<li>Crisponi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crisponi+syndrome+is+caused+by+mutations+in+the+CRLF1+gene+and+is+allelic+to+cold-induced+sweating+syndrome+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Crisponi syndrome is caused by mutations in the CRLF1 gene and is allelic to cold-induced sweating syndrome type 1.</a> Am J Hum Genet. 80 (5), 971-981 (2007).</li>
<li>Crisponi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+recessive+disorder+with+muscle+contractions+resembling+neonatal+tetanus%2C+characteristic+face%2C+camptodactyly%2C+hyperthermia%2C+and+sudden+death%3A+a+new+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Autosomal recessive disorder with muscle contractions resembling neonatal tetanus, characteristic face, camptodactyly, hyperthermia, and sudden death: a new syndrome.</a> Am J Med Genet. 62 (4), 365-371 (1996).</li>
<li>Sohar, E., Shoenfeld, Y., Udassin, R., Magazanik, A., Revach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-induced+profuse+sweating+on+back+and+chest.+A+new+genetic+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cold-induced profuse sweating on back and chest. A new genetic entity.</a> Lancet. 2 (8099), 1073-1074 (1978).</li>
<li>Guillet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+active+fusion+protein+of+the+novel+composite+cytokine+CLC%2Fsoluble+CNTF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Functionally active fusion protein of the novel composite cytokine CLC/soluble CNTF receptor.</a> Eur J Biochem. 269 (7), 1932-1941 (2002).</li>
<li>Larsen, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-Like+Factor+1%2C+an+Essential+Facilitator+of+Cardiotrophin-Like+Cytokine%3ACiliary+Neurotrophic+Factor+Receptor+alpha+Signaling+and+sorLA-Mediated+Turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine-Like Factor 1, an Essential Facilitator of Cardiotrophin-Like Cytokine:Ciliary Neurotrophic Factor Receptor alpha Signaling and sorLA-Mediated Turnover.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).</li>
<li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li>
<li>Jacobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+a+novel+human+hybrid-type+receptor+that+binds+the+alpha2-macroglobulin+receptor-associated+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of a novel human hybrid-type receptor that binds the alpha2-macroglobulin receptor-associated protein.</a> J Biol Chem. 271 (49), 31379-31383 (1996).</li>
<li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+by+the+cytoplasmic+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+binding+receptor+SorLA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sorting by the cytoplasmic domain of the amyloid precursor protein binding receptor SorLA.</a> Mol Cell Biol. 27 (19), 6842-6851 (2007).</li>
<li>Jacobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sorLA+cytoplasmic+domain+interacts+with+GGA1+and+-2+and+defines+minimum+requirements+for+GGA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The sorLA cytoplasmic domain interacts with GGA1 and -2 and defines minimum requirements for GGA binding.</a> FEBS Lett. 511 (1-3), 155-158 (2002).</li>
<li>Klinger, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SorLA+regulates+the+activity+of+lipoprotein+lipase+by+intracellular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">SorLA regulates the activity of lipoprotein lipase by intracellular trafficking.</a> J Cell Sci. 124 (7), 1095-1105 (2011).</li>
<li>Kitago, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+amyloidogenic+peptide+recognition+by+sorLA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for amyloidogenic peptide recognition by sorLA.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 199-206 (2015).</li>
<li>Quistgaard, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligands+bind+to+Sortilin+in+the+tunnel+of+a+ten-bladed+beta-propeller+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ligands bind to Sortilin in the tunnel of a ten-bladed beta-propeller domain.</a> Nat Struct Mol Biol. 16 (1), 96-98 (2009).</li>
<li>Larsen, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sorCS1+binds+sortilin+and+hampers+its+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Human sorCS1 binds sortilin and hampers its cellular functions.</a> Biochem J. 457 (2), 277-288 (2014).</li>
<li>Larsen, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+facilitates+signaling+of+ciliary+neurotrophic+factor+and+related+helical+type+1+cytokines+targeting+the+gp130%2Fleukemia+inhibitory+factor+receptor+beta+heterodimer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sortilin facilitates signaling of ciliary neurotrophic factor and related helical type 1 cytokines targeting the gp130/leukemia inhibitory factor receptor beta heterodimer.</a> Mol Cell Biol. 30 (17), 4175-4187 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에 설명 된 프로토콜 sorLA 매개 CLC을 설명하기 위해 특별히 사용되는 수 CLF-1 의존성 하향 조절 및 CNTFRα 타겟팅 리소좀뿐만 아니라 CLC에 수반 약화 응답 : CLF-1 자극. 그들은 CNTFRα 및 sorLA 단지 사소한 내인성 발현을 명시 gp130을 / LIFRβ, 형질 쉬우 며 면역 세포 적합 대형 전지 본체를 갖고, 상기 HEK293 세포주는이 프로토콜에 적합하다. 그러나 이론적으로 유사한 특성을 가진 셀 라인은 잘 작동합니다. 이 프로토콜은 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫번째 관심사는 레우 / PEP 매체는 24 시간 동안 약 6 시간마다 교체해야하는 230 단계. 그렇게하지 않으면 활성 리소좀 효소 이하 또는 리소좀 단백질의 탐지되지 축적의 원인이 될 수 있습니다. 두번째 중요한 단계 (3.4) CLC 사전 인큐베이션에 세척 우려 : CLF-1. 그것은 메신저입니다으로 중요 어떤 언 바운드 리간드를 제거하고 세포의 시간이 비추 DMEM (빈 매체)에 (계속 자극을 피할 수) 복구 할 수 있도록. CLF-1 (단계 3.5) :이 CLC와 후속 다시 자극하는 동안 pSTAT3의 낮은 배경 수준을 보장합니다. 특히,도 6은 세포 반응 (pSTAT3)이 CNTFRα의 sorLA 매개 된 하향 조절과 평행하게 감소한다는 것을 보여준다. 이는 감소 된 응답이 CNTFRα 풀의 감소 (그리고 따라 예상 할 수있는)에 따른이지만,이 저 CNTFRα 식 단독 감소 세포 반응을 차지하는 것을 증명하지 않는다는 점을 강조해야한다. 따라서, 변경 - 프리 자극 또는 형질의 결과 - 상류 pSTAT3에 신호 전달 경로의 기능 요소 중 어느 하나가 변경된 응답에 기여 할 수 있습니다. 프로토콜의 기본 개념이이 특별히 한정되지 않는다LAR 수용체 시스템. (. 즉, 다른 세포주, 기타 항체, 기타 리간드 등) - 무관 sorLA&#39;s 개입 프로토콜을 수정하여 그것뿐만 아니라 다른 수용체의 리간드 - 유도 하향 조절을 결정하기 위해 사용될 수있다. 그러나, 웨스턴 블 롯팅에 의해 수용체 하향 조절의 분석은 주로 예 수용체 느린 회전율 및 자극되지 않은 세포에서의 새로운 합성의 낮은 정도를 나타내고, GPI 고정 - 수용체에 적합한 것을 주목해야한다. 따라서, 새로운 합성의 하이 레벨을 나타내는 수용체의 리간드 - 유도 수용체 하향 조절이 새로운 합성에 의해 보상 될 수있다. 21에 기술 된 바와 같이 이러한 상황에서 풀 수용체의 하향 조절 대신 대사 라벨링 펄스 추적 실험에 의해 결정될 수있다. 선택적으로, 수용체를 방해하지 요오드화 항체 (바람직 된 Fc 단편)의 &quot;태그&quot;를 RECEPT의 ectodomain하는데 사용될 수 바인딩또는, 상기 예상 하향 조절은 세포 펠릿과 배지 방사성 계수에 의해 결정될 수있다. 물류 이유로 우리는 CNTFRα 우리의 세포는 Myc와 태그를 들고 구성 형질, 본 프로토콜에서 마우스 항 - Myc와 항체 수용체의 웨스턴 블롯 검출에 사용되었다. 대조적으로, 염소 항 - CNTFRα 항체 LAMP-1 마우스 항체에 의해 검출되었을 때 면역 세포 및 이중 표지에 사용 된 - 분명 이차 항체 불특정 (중첩) 염색 초래 개의 기본 마우스 항체를 사용한다. 염소 항 - CNTFRα도 (도시 생략) 웨스턴 블 롯팅에서 작동하기 때문에, 프로토콜은 쉽게 수정 및 태그가없는 CNTFRα 형질 세포에 적용 할 수 있습니다. 고친 화도 22 CLF-1 : 마지막으로, 최근에는 세포 내 이입이 수용체 sortilin CLC 결합하는 것으로 나타났다. 따라서, 생각할 수있는 그 sortilin처럼이며sorLA는 CLC에 상호 : CLF-1을 통해 CNTFRα 및 세포 내 이입뿐만 아니라 CNTFRα의 대상으로 리소좀을 중재 할 수 있습니다. 대신 sorLA의 sortilin을 사용하여, 본 프로토콜은이 문제를 명확히하기 위해 사용될 수있다.

CLF-1 : 1-3 콜레 스테 릭 액정 및 CLF-1 이종 사이토킨 CLC의 두 서브 유닛을 구성한다. 셀룰러 신호 유도, CLC : CLF-1 제 대상은 CNTFRα 그 차 및 GPI-고정 리셉터는 멤브레인 결합 된 삼량 체 복합체를 형성한다. 콜레 스테 릭 액정 : CLF-1 : CNTFRα 단지 이후 모집 횡단은 야누스 키나제 / 신호 변환기 및 전사 3 (JAK / STAT3) 경로 4 활성제를 통해 신호를 중재 gp130을 / LIFRβ. 세 개의 서브 유닛 중 어느 결핍 마우스는 하나의 디스플레이와 같은 표현형 인한 안면 신경 불충분 유아 5-8의 감소 된 수의 출생 후 24 시간 이내에 사망한다. 인간의 연구 결과는 마찬가지로 세 개의 서브 유닛의 기능 일관성을 강조한다. 따라서, 인간의 돌연변이 (동형 접합체 또는 화합물) CLC의 원인이 장애 : CLF-1 또는 CNTFRα, 소위 감기에 의한 발한 / Crisponi 증후군의 모든 결과, 같은 impai 등의 증상을 특징으로하는 조건빨간색 유아 및 삼키는, 다양한 기형 기능, 온도 스파이크, 그리고 역설적 및 저온 9-11에서 땀 관류. 시험 관내에서, CLC 및 CNTFRα의 조합 및 gp130을 필요 / LIFRβ과의 상호 작용 및 셀 (12) 시그널링을 유도하기에 충분한 양이다. 반면에, CLF-1의 역할은 덜 명확하다. 직접적 시그널링에 관련되지 않고, 긴 주로 CLC 1의 세포 분비를 촉진하는 역할을 부록으로 간주되어왔다. 그러나, 최근의 연구 결과는 CLF-1 시그널링 및 CLC와 CNTFRα 회전율 모두 연루 추가 등 중요한 기능을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, CLF-1은 3 개의 독립적 인 결합 부위가 포함되어 있다고 표시 : 하나씩의 CLC 결합 공지; CNTFRα에 바인딩 직접 중재 한; 및 세포 내 이입 수용체 sorLA과의 상호 작용에 대한 세 번째 (높은 친 화성) 사이트. CLC 및 CLF-1 둘 것 &amp; #로(160), 상기 CLC보다 상당히 낮은 친화력과 CNTFRα를 대상으로 : CLF-1 복잡한, (그 CNTFRα 결합 사이트를 통해) CLF-1 CLC와 CNTFRα의 통일을 촉진하여 13 신호를 용이하게 생각할 수있다. sorLA CLF-1과의 상호 작용이 본 발표의 주요 문제는 완전히 다른 역할을한다. SorLA는 Vps10p 도메인 수용체 가족 (14)를 구성하는 다섯 가지 유형 (1) 수용체의 하나입니다. 이것은 다양한 조직이 아니라 뇌 신경 조직 (15) 내의 특정 표현된다. 다른 가족 구성원과 마찬가지로 sorLA는 Vps10p - 결합 도메인 N- 말단 리간드를 수행하지만, 또한,도 저밀도 지단백질 수용체 패밀리 (15)의 부재에 위치한 리간드 - 결합 요소를 포함하는 다른 도메인 유형을 포함한다. 그것의 세포질 꼬리 여러 어댑터 단백질, 예를 들어, 어댑터 단백질-1, -2, 그리고 sorLA와 상호 작용이 효율적으로 endocytos를 전달입니다뿐만 아니라 결합 단백질 16 ~ 18의 세포 내 정렬 및 전송. Vps10p 도메인은 CLF-1 (단, 특히, CLC 생략) (13)를 포함하여 리간드 무관하는 일련의 바인딩 큰 텐 β 블레이드 프로펠러 (19, 20)를 포함한다. CLF-1의 결합 부위가 액세스 후에도 sorLA뿐만 아니라 결합을 의미 CLC 및 CNTFRα 복잡한 형성 무료 CLF-1뿐만 아니라, CLC : CLF-1과 삼량 체 복잡한 CLC : CLF-1 : CNTFRα 13. SorLA은 CLF-1 및 CLC의 신속한 세포 내 이입 전달 : CLF-1이지만 CNTFRα는 GPI 앵커에 의해 막 표면에 고정되는 반면, 이러한 수용성 단백질이다. / 및 CLF-1 : : : CNTFRα이 sorLA 전체 단지를 내면화 할 수 있도록함으로써 CNTFRα의 표면 막 식 (CLF-1 신호 유도 및 CLC에 후속 세포 감수성)을 변경하는 문제는 CLC의 따라서 경우에 구속력을 또는 CNTFRα의 회전율. 본 실험에 기재된보고서는 다음과 같은 질문을 명확히하기 위해 설계되었습니다 : sorLA은 CLC를 매개 하는가 : 표면 막 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절? 이를 명확히하기 위해, 초기에 21에서 설명한 바와 같이 대사 라벨링 펄스 추적 실험에 의해 (부재와 sorLA의 존재하에) CNTFRα의 회전율을 결정하려고 시도 하였다. 그러나 CNTFRα는 [S (35)] 시스테인의 혼합물을 사용하여 [S (35)] 메티오닌은 방사능의 가난한 통합을 보였다 레이블을 시도합니다. 이것은 모든 확률 수용체의 급격한 상당한 손실을 보상 할 수 없을 것이다 새로운 합성은 매우 낮은 수준을 제안했다. CLC를 통해 상호 때 CNTFRα이 하향 조절되었는지 확인하려면 : CLF-1 sorLA, 그것은 따라서 단순히 이전과 CLC에 노출 된 후 (웨스턴 블로 팅 사용) CNTFRα의 총 세포 풀을 측정하기로 결정했다 : CLF-1 -과 결과를 비교 세포를 형질 전환 또는 형질하지에sorLA. sorLA은 리소좀에 CNTFRα을 대상으로합니까? 이 질문에, CNTFRα의 현지화에 대답하기 위해 - 그 CLC를 통해 내면화 : sorLA 결합 CLF-1 매개 - 면역 세포를 이용하여 조사하고, CNTFRα 향하는 항체 및 후기 엔도 좀 / 리소좀 마커 리소좀 관련 막 단백질 1 표시 (LAMP-1). 실험은 리소좀 효소의 억제제로 치료뿐만 아니라 처리 된 세포에서 수행 하였다. 아이디어는 CNTFRα이 리소좀에서 분해 된 경우 처리되지 않은 세포가 CNTFRα에 대해 거의 또는 전혀 염색을 보여줄 것입니다 반면, 효소 억제제로 치료 세포, LAMP-1 긍정적 인 소포에 축적 CNTFRα-염색을 제시 것을 물론이다. CLF-1 자극 : CNTFRα의 하향 조절은 CLC에 대한 세포 반응을 낮출 수 있나요? JAK / STAT3을 사용하여 gp130을 / LIFRβ 이질 통해 CLC, CLF-1을 CNTFRα 신호 이루어지는 삼량 체 복합체좁은 길. 따라서, 전지의 용량은 CLC에 응답하기 : CNTFRα의 하향 조절시 CLF-1 신호는 웨스턴 블롯 검출 및 sorLA의 형질 전환 체의 인산화 STAT3 (pSTAT3) / 총 STAT3 수준의 정량에 의해 탐험했다.

<table><tbody><tr><td>Zeocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-zn-1</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B Gold</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfection 시약&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 815 091 001</td><td></td></tr><tr><td>4웰 플레이트(Nunclon Delta Surface)</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle&acute; S Medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F/U1</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Phosphate Buffered Saline&nbsp; (디펜스)</td><td>하이클론</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>CLC:CLF-1</td><td>R& D Systems</td><td>1151-CL/CF</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티-LAMP-1&nbsp;</td><td>DSHP</td><td>H4A3</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티-sorLA</td><td></td><td></td><td>참조 16</td></tr><tr><td>마우스 안티-b-액틴&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti-Myc</td><td>Genscript</td><td>A00704</td><td></td></tr><tr><td>염소 anti-CNTFRa&nbsp;</td><td>R& D 시스템</td><td>AF-303</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티-pSTAT3&nbsp;</td><td>세포 신호 기술</td><td>9145s</td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti-STAT3&nbsp;</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>9139s</td><td></td></tr><tr><td>항 마우스 HRP 결합 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>7076s</td><td></td></tr><tr><td>항 토끼 HRP 결합 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>7074s</td><td></td></tr><tr><td>항 염소 HRP 결합 항체</td><td>Dako</td><td>P0160</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 항 염소 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 항-마우스 2차 항체, Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L8511-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A&nbsp;</td><td>시그마</td><td>P4265-5MG</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1388</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Merck</td><td>1,082,191,000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA:Titriplex III</td><td>Merck</td><td>1,084,180,250</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete mini EDTA free</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>04 906 837 001</td><td></td></tr><tr><td>LDS 샘플 버퍼(4x)</td><td>Novex</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 단백질 분석</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드(PFA)</td><td>VWR</td><td>97,135,000</td><td></td></tr><tr><td>사포닌</td><td>시그마</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 미디어</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr></tbody></table>

sorla 및 clc : 웨스턴 블로 팅, 리소좀 효소의 억제 및 면역 세포에 의해 입증으로 cntfrα의 clf-1에 의존 하향 조절

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

이종 사이토킨 Cardiotrophin 같은 사이토 카인 : 사이토 카인과 같은 인자 1 (CLC는 : CLF-1)합니다 (glycosylphosphatidylinositol (GPI)에이어서 130 / 백혈병 억제 인자 수용체 β 당단백 모집 삼량 체 복합체를 형성 CNTFRα을 -anchored 대상 gp130을 / 신호에 대한 LIFRβ). CLC 및 CNTFRα 모두 신호하지만 지금까지 CLF-1 만 CLC 분비의 추정 촉진제로 알려져있다위한 필요하다. 그러나, 최근 CLF-1 세 개의 결합 부위 포함 나타났다 : CLC 하나씩; CNTFRα 하나 (즉, 삼량 체 복합체의 어셈블리를 촉진 할 수있다); 및 세포 내 이입 수용체 sorLA 하나. CLF-1뿐 아니라, 삼량 체 (CLC : CLF-1 : CNTFRα) 후자 사이트 CLF-1 CLC의 결합 친 화성이 높은 제공 sorLA에 복잡하고 세포를 가용성 리간드 CLF-1 및 CLC를 sorLA 발현 : CLF-1은 빠르게 흡수하고 내장되어 있습니다. CNTFRα 및 sorLA 공동 발현하는 세포에서 CNTFRα 먼저 CLC 바인딩 : CLF-1은 형성한다멤브레인 - 관련 삼량 착체뿐만 아니라 CLF-1에서의 자유로운 sorLA 결합 부위 sorLA 통해 연결된다. 결과적으로, 자체적으로 엔도 시토 시스에 대한 능력이없는 CNTFRα는 함께 당 겼고되고 CLC의 sorLA - 매개 엔도 사이토 시스에 의해 내재화 : CLF-1. 본 프로토콜)는 sorLA 매개과 CLC 전을 설명하는 데 사용되는 실험 절차에 대해 설명 : 표면 막 CNTFRα 표현의 CLF-1에 의존 하향 조절을; ⅱ) 세포 내 이입과 CNTFRα의 대상으로 리소좀 sorLA이 매개; 및 ⅲ) CLC로 하향 조정 세포 반응 : CNTFRα의 sorLA 매개 하향 조절시 CLF-1-자극.

도 1은 셀 시드 및 CLC의 개략도 보여준다 프로토콜 2.도 3 CLF-1 배양 : 프로토콜 CLF-1 배양을 1도 2는 셀 시드 및 레우 / PEP와 CLC의 개략도를 도시 sorLA 매개 CLC 프로토콜 3. 그림 4 CLF-1 배양과 자극을 보여줍니다 : 셀 - 파종 및 CLC의 개략도를 보여줍니다 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절. 그림 5는 CNTFRα의 타겟팅 sorLA 매개 엔도 시토 시스와 리소좀을 보여줍니다. CNTFRα의 하향 조절 한 후 CLF-1 자극 : 그림 6은 CLC에 낮은 응답을 보여줍니다. CNTFRα-Myc와의 하향 조절이 sorLA의 형질 전환에 약한 밴드 afte에 의해 입증되는 반면 CNTFRα-Myc와을 상징하는 밴드, 시간 제로에서 비슷한 밀도를 가지고 있습니다R 5 시간 (그림 4). 그림 5는 CNTFRα-Myc와는 레우 / 응원 처리 된 세포의 LAMP-1 긍정적 인 소포에 축적 된 것을 알 수있다. 반대로 CNTFRα-Myc와 어떠한 축적 레우 / PEP 처리를 실시하지 세포에서 보이지 않는다. 이 CNTFRα-Myc와는 리소좀에 정렬되고 분해되는 것을 보여줍니다. CLF-1 :도 6에서 알 수있는 바와 같이 CLC에 노출되지 않은 세포에서의 수준과 비교해서 pSTAT3 수준은 상당히 예비 자극 된 세포에서 감소된다. 이것은 예비 자극 된 세포에서 관찰 된 CNTFRα sorLA 매개 된 하향 조절 (도 4)에 따른다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig1.jpg" /> 그림 1 : 두 4-에서 프로토콜 CLF-1 배양 1. 씨 HEK293-CNTFRα-Myc와 및 HEK293-CNTFRα-Myc와 / sorLA 세포 : 세포 파종 및 CLC의 도식 표현웰 플레이트 (0 ~ 5 시간) 및 CLC와 세포를 품어 : CLF-1 바와 같이. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig2.jpg" /> 그림 2 : 세포 파종 및 레우 / 단합과의 도식 표현 CLC : CLF-1 4 웰 플레이트에서 커버 슬라이드 프로토콜 2. 종자 HEK293-CNTFRα-Myc와 / sorLA 세포의 배양 및 또는 레우없이 세포를 배양 / 격려와 CLC : CLF-1 바와 같이. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig3.jpg" /> 그림 3 : </strong&gt; 세포 파종 및 CLC의 도식 표현 : 한 4 웰 플레이트에서 프로토콜 3. 씨 HEK293-sorLA 세포에서 CLF 배양과 자극 또는 CLC없이 세포 배양 : (. 사전 특급) CLF-1을 하향 조절하기 나타낸 바와 같이, STAT3 인산화을 시작 CLF-1 자극 (STIM.) : CNTFRα는 CLC 하였다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig4.jpg" /> 그림 4 : SorLA가 중재 것을 보여주는 결과 CLC : CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절. (A) HEK293-CNTFRα-Myc와 및 (B) HEK293-CNTFRα-Myc와 / sorLA 셀 부재 (10)의 나노 CLC (흰색 칼럼) 또는 존재 (회색 칼럼)에서 배양 하였다 : CLF-1. 0 후와5 시간은, 배양이 중지되고 상기 매체 (m)의 CNTFRα-Myc와의 함량 및 세포 용 해물을 (l) 웨스턴 블 롯팅에 의해 검출하고, 밀도 측정에 의해 정량 하였다. 상단 패널은 대표적인 실험 웨스턴 블롯 결과를 표시하고, 하부 패널은 세포 용 해물에서 발견 CNTFRα-Myc와의 검출 레벨을 나타낸다. 레벨은 0 시간에서 단일 및 이중 형질의 CNTFRα-Myc와 수준을 기준으로 표시됩니다. 각 컬럼은 평균 ± SEM를 나타낸다 (n = 3)를 나타낸다. P-값은 t-test를 이용하여 계산 하였다. 원래 그림 13 후 재현. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig5.jpg" /> 그림 5 :SorLA는 엔도 시토 시스와 CNTFRα의 대상으로 리소좀을 매개 것을 보여주는 결과. HEK293-CNTFRα-Myc와 / sorLA 세포는 10 나노 CLC 배양, 또는 레우 / PEP없이 처리 하였다 : 프로토콜에 기재된 CLF-1, 5 시간 반 CNTFRα 안티 LAMP-1 항체를 이용하여 고정하고, 마지막으로 염색 2. 스케일 바 : 5 μm의. 원래 그림 13 후 재현. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig6.jpg" /> 그림 6 : CLF-1 자극 : CNTFRα의 SorLA 매개 하향 조절이 CLC에 내려 세포 반응을 동반한다. HEK293-sorLA 셀 부재 (10) 또는 나노 CLC의 존재하에 예비 인큐베이션 하였다 (. 프리 EXP)을 5 시간 동안 CLF-1의 결핍 blan케이 90 분 동안 매체, 5 nM의 CLC로 자극 : (. STIM) CLF-1 15 분. (왼쪽) 열은 세포에서 pSTAT3의 상대적 수준을 보여줍니다. CLF-1이지만 CLC 자극 : CLF-1의 각 열은 CLC의 부재에서 전 배양 세포에서 pSTAT3 레벨 (N = 3)의 상대 ± SEM을 의미 나타낸다. t-test를 이용하여 계산 된 p- 값. (오른쪽) 웨스턴 블롯은 대표적인 실험에서 얻어진 pSTAT3와 STAT3의 응답을 보여줍니다. 원래 그림 13 후 재현. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55019/55019fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

본 프로토콜은 사이토 카인과 같은 인자 -1 (CLF-1 사이의 상호 작용에 의해 전달된다 섬모 향 신경성 인자 수용체 α (CNTFRα)의 하향 조절을 입증 할 수있는 방법을 웨스턴 블랏 및 리소좀 효소의 억제와 함께 면역 세포 설명 )와 세포 내 이입 수용체 sorLA.

SorLA 및 CLC : 웨스턴 블로 팅, 리소좀 효소의 억제 및 면역 세포에 의해 입증으로 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

이 프레젠테이션의 목적은 웨스턴 블로팅(western blotting) 및 면역세포화학(immunocytochemistry)을 사용하여 인간 세포 트랜스펙턴트에서 CNTF 수용체의 SorLA 및 CLC:CLF-1 매개 하향 조절 및 리소좀 분해를 입증하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 내포성 수용체 SorLA와의 동시 발현 시 GPI 고정 CNTF 수용체의 회전율 및 둘을 상호 연결하는 CLC:CLF에 대한 노출과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 방사능을 포함하지 않으며 소량의 분해만 나타내고 자극되지 않은 세포에서 합성을 사용하는 막 단백질에 적합하다는 것입니다.Myc-tagged CNTF 수용체 또는 Myc-tagged CNTF 수용체 및 SorLA를 co-expressing하는 human embryonic kidney 293 transfectant의 안정적인 클론을 사용합니다. 두 개의 4웰 플레이트에 동일한 수의 세포를 파종합니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM인 전체 배지에서 세포를 배양합니다.세포가 50-80% 합류하면 웰에서 배지를 제거합니다. Dulbecco PBS로 한 번 세척 한 후 두 플레이트의 각 세포 유형에 10 나노 몰 CLC : CLF-1을 포함하거나 포함하지 않은 신선한 전체 배지를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.0시간 및 5시간 배양 후 배지를 회수하고 1.5ml 튜브에 섭씨 4도에서 보관하십시오. 그런 다음 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 1%Triton X-100 용해 완충액을 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 세포 용해물을 1.5ml 튜브로 옮깁니다.다음으로, 배지와 세포 용해물이 들어 있는 튜브를 회전시킵니다. 완료되면 상등액을 1.5ml 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 각 세포 용해물 상등액 5마이크로리터를 단백질 함량 측정에 사용할 1.5ml 튜브로 옮깁니다.그런 다음 즉시 비환원 LDS 샘플 버퍼를 모든 상등액에 추가하고 샘플을 와류로 만듭니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 단백질 분석을 사용하여 세포 용해물 상등액의 단백질 함량을 측정합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다.각 샘플에서 동일한 양의 단백질을 SDS 페이지 및 웨스턴 블로팅을 줄이고 배지 및 세포 용해물에서 SorLA, 베타 액틴 및 Myc 태그 CNTF 수용체의 함량을 시각화합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 밀도 측정법(densitometry)으로 개별 밴드를 정량화합니다. Myc-tagged CNTF 수용체와 SorLA로 안정적으로 transfection된 seed human embryonic kidney 293 세포는 4-well plate의 커버 슬라이드입니다.세포가 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 커버 슬라이드에 부착되도록 합니다. 앞서 설명한 바와 같이 전체 배지에서 세포를 배양합니다. 세포가 20-40% 융합되면 웰에서 배지를 제거하고 루펩틴 및 펩스타틴 A의 밀리리터당 50마이크로그램 유무에 관계없이 전체 배지를 세포에 추가합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 류펩틴 및 펩스타틴 A 배지는 24시간 동안 약 6시간마다 교체해야 합니다. 그렇게 하지 않으면 활성 리소좀 효소가 생성되고 리소좀에서 검출 가능한 단백질 축적이 줄어들거나 전혀 발생하지 않을 수 있습니다.24 시간의 배양 후 배지를 교체하고 CLC : CLF-1 10 나노 몰을 첨가하십시오. 세포를 섭씨 37도에서 5시간 동안 배양한 후 PBS에서 한 번 세척하고 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정합니다. PBS에서 세포를 한 번 세척한 후 PBS의 0.5%사포닌을 넣고 실온에서 5분 동안 세포를 투과시킵니다.다음으로, 염소 항-CNTF 수용체와 마우스 항-LAMP-1 항체를 PBS에서 0.5%사포닌에 희석하고 실온에서 2시간 동안 항체와 함께 세포를 배양합니다. PBS에서 0.5% 사포닌으로 세포를 4회 세척한 후, 당나귀 항염소 Alexa 488과 당나귀 항-마우스 Alexa 568이 접합된 2차 항체를 각각 밀리리터당 6마이크로그램씩 배양하고 어둠 속에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS의 0.5% 사포닌으로 세포를 4회 세척하고 탈이온수로 2회 세척합니다.그런 다음 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 커버 슬라이드를 장착합니다. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 컨포칼 현미경으로 세포의 항체 염색을 분석합니다. 인간 배아 신장 SorLA 세포를 4웰 플레이트에 파종합니다.앞서 설명한 바와 같이 전체 배지에서 세포를 배양합니다. 세포가 50-80% 합류하면 웰에서 배지를 제거합니다. PBS에서 한 번 세척하고 10 나노 몰의 CLC : CLF-1을 포함하거나 포함하지 않은 신선한 전체 배지를 세포에 첨가합니다.섭씨 37도에서 5시간 동안 세포를 배양한 후 배지를 제거합니다. 그런 다음 보충되지 않은 DMEM인 빈 배지에서 세포를 두 번 세척합니다. 90 분 동안 재 배양 한 후 배지를 제거하고 5 나노 몰의 CLC : CLF-1을 포함하거나 포함하지 않은 새로운 빈 배지를 추가합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 배지를 신속하게 제거하고 프로테아제 억제제 칵테일과 인산가수분해효소 억제제 칵테일이 보충된 1%Triton X-100 용해 완충액을 각 웰에 첨가하여 세포를 용해합니다. 그런 다음 세포 용해물을 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다.다음으로, 각 상등액 5마이크로리터를 단백질 함량을 측정하는 데 사용할 1.5ml 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 즉시 비환원 LDS 샘플 버퍼를 모든 상등액에 추가하고 샘플을 와류로 만듭니다. 샘플 버퍼를 즉시 추가하는 것은 반응을 중지하고 탈인산화를 방지하는 데 중요합니다.제조업체의 프로토콜에 따라 상용 단백질 분석을 사용하여 세포 용해 상등액의 단백질 함량을 측정합니다. 이제 더 이상 점성이 없을 때까지 실온에서 각 샘플을 초음파 처리합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다.각 샘플에서 동일한 양의 단백질을 SDS 페이지 및 웨스턴 블로팅에 적용하고 적절한 항 STAT3 항체 및 HRP 결합 2차 항체를 사용하여 세포 용해물에서 인산화된 STAT3 및 총 STAT3의 함량을 시각화합니다. CNTF 수용체의 SorLA 매개 CLC:CLF-1 의존성 하향 조절은 다음과 같습니다. Myc-tagged CNTF receptor 및 CLC:CLF-1 stimulated and unstimulated single transfectants를 나타내는 bands는 두 시점에서 유사합니다.대조적으로, Myc-tagged CNTF 수용체의 하향 조절은 5시간 후 자극된 이중 transfectants에서 비교적 약한 밴드에 의해 반영됩니다. CNTF 수용체의 SorLA 매개 세포내이입 및 리소좀 표적화는 Myc-표지된 CNTF 수용체가 류펩틴 및 펩스타틴 A 처리한 세포의 LAMP-1 양성 소포에 축적되었음을 보여줍니다. 대조적으로, Myc-표지된 CNTF 수용체의 축적은 치료를 받지 않은 세포에서 볼 수 없으며, 이는 Myc-표지된 CNTF 수용체가 리소좀으로 분류되어 분해됨을 보여줍니다.pSTAT3 수치는 CLC:CLF-1에 사전 노출되지 않은 세포의 수치에 비해 사전 자극된 세포에서 현저히 감소합니다. 이는 앞서 보여준 바와 같이 사전 자극된 세포에서 관찰된 CNTF 수용체의 SorLA 매개 하향 조절에 따른 것입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 CNTF 수용체의 SorLA 매개 및 CLC:CLF-1 의존성 하향 조절 및 리소좀 분해를 보여주기 위해 웨스턴 블로팅(western blotting) 및 면역세포화학(immunocytochemistry)을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

sorla-clcclf-1-dependent-downregulation-cntfr-as-demonstrated-western

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

Clathrin - 중재 endocytosis는 화물선 선택과 clathrin 코트 어셈블리를 조정 어댑터 단백질에 따라 달라집니다. 우리가 모델로 효모 endocytic 어댑터 단백질 Sla1p를 사용하여 어댑터 clathrin 물리적 상호 작용과 라이브 셀 이미징 방법을 연구하는 절차를 설명합니다.

생체내 및 아답터 - clathrin 상호 작용의 체외 연구에서

Chromatin 반복; 유전자 규칙에 있는 중요 한 역 그러나, chromatin 루프의 선택적이 고 가역 수정 허용 하는 아무 기술 발전 되었습니다. 여기 우리가 chromatin 루프 개편에 대 한 강력한 시스템 설명 loci를 대상으로 선택적으로 고 역에서 유전자 발현 조절에 CRISPR-dCas9 (CLOuD9)을 사용 하 여.

CRISPR 중재 Chromatin 루프 구조 개편

이 프로토콜에서는 수지상 필로포디알 사이의 특이적이고 강한 친화력을 활용하여 배양된 해마 뉴런상의 식수컵형 돌출 구조로부터 수지상 필로포디아가 풍부한 분획을 정화하는 방법을 소개합니다. 접착 분자, TLCN, 및 세포외 매트릭스 분자, vitronectin.

수지상 필로포디아 풍부한 분획의 정화

이 프로토콜은 1 차적인 만성 림프구성 백혈병 세포에서 핵 및 세포질 분획의 최적화 그리고 연속적인 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 견본은 세포 자극 및 약 처리에 핵과 세포질 구획 사이에서 일어나는 단백질 인신 매매에 있는 단백질 현지화 그리고 변경을 결정하기 위하여 이용됩니다.

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

본 연구에서, 발현은 특정 shRNA를 사용하여 PERK 경로의 두 가지 다운스트림 신호 전달 성분인 세포보호 칼시뉴린 및 프로-아폽토시스 CHOP의 녹다운됩니다. 반대로, 이들은 소포체 스트레스 유도 후 신경돌기 위축에 대한 일차 피질 뉴런의 감수성을 조절합니다.

소포체 스트레스 뉴런에서 렌티바이러스 전달 특정 shRNA에 의한 분자 조절

형광-활성화된 세포 분류-방사성리간드 처리된 조직(FACS-RTT)은 알츠하이머병에서 세포 규모로 18kDa 트랜스로케이터 단백질 또는 세로토닌 5HT2A-수용체 발현의 역할을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 TgF344-AD 래트 모델에서 FACS-RTT의 생체외 적용을 기술한다.

형광-활성화된 세포 분류-방사성 신호의 세포 기원을 결정하기 위한 방사성리간드 처리조직(FACS-RTT)

여기에서는 인간 limbal niche 세포를 분리하고 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Limbal Niche 세포의 분리 및 식별

전기생리학은 이온 채널 활성을 조사하기 위한 황금 표준입니다. 그러나 광학적 방법을 포함하여 많은 대체 접근 방식이 있습니다. 여기에서는 FRET(inter-subunit Förster 공명 에너지 전달) 기반 방법을 사용하여 8채널(LRRC8) 형성된 음이온 채널을 포함하는 류신이 풍부한 반복의 활성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

SE-FRET(Sensitized-Emission Förster Resonance Energy Transfer)를 사용하여 8채널(LRRC8/VRAC) 활성을 포함하는 류신이 풍부한 반복 모니터링

효소 스크리닝을 위한 고처리량 분석에 대해 설명합니다. 즉시 사용 가능한 이 멀티플렉스 분석 키트는 사전 선택된 Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) 기질과 complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) 기질로 구성됩니다. 표적 효소는 다당류를 분해하는 내효소(endo-enzymes)와 프로테아제(protease)입니다.

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

이 논문은 얼음 재결정 억제 활성과 얼음 화성 정제를 사용하여 원시 IBPS의 후속 분리의 평가를 통해 동결 내성 식물 얼음 - 결합 단백질의 동정을 설명합니다.

식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별

배우세요 웨스턴 블로팅과 면역세포화학법을 이용하여 SorLA와 CLC:CLF-1이 CNTFRα의 용소체 분해를 매개하는 과정을 연구하는 방법입니다. 이 비방사성 기법은 막 단백질 회전율 분석에 적합합니다.

SorLA 및 CLC : 웨스턴 블로 팅, 리소좀 효소의 억제 및 면역 세포에 의해 입증으로 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절

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