라이브 영상은 탁 내성 유방암의 미세 소관 동적 불안정성을 연구하는

이 실험의 전반적인 목표는 도세탁셀 내성 유방암 세포에서 미세소관 동적 불안정성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 생리학적 조건 하에서 다양한 약물 치료 후 미세소관 동적 불안정성에 대한 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포의 미세소관 역학을 연구하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있으며 생리학적으로 적용 가능한 프로토콜을 제공한다는 것입니다.

절차를 시작하기 전에 섭씨 37도의 10cm 배양 접시에 완전한 배양 배지에서 유방암 세포를 성장시키고 5%의 이산화탄소를 적절한 포화 정도까지 성장시킵니다. 실험 전날, 24mm 폴리 L-라이신 코팅 유리 커버 슬립을 70% 알코올로 헹구고 슬립을 밤새 자외선에 노출시킵니다. 다음 날 아침, 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 하나의 커버 슬립을 놓습니다.

그런 다음 PBS로 배양액을 세척하고 0.5ml의 트립신 EDTA로 각 접시의 세포를 분리합니다. 세포가 플레이트 바닥에서 들어 올려지기 시작하면 5ml의 신선한 배양 배지로 트립신을 중화하고 세포를 계수합니다. 그런 다음 각 커버 슬립에 다섯 번째 세포 10개를 약 1배 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔든 다음 최소 36시간 동안 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다.

세포의 미세소관 역학을 분석하기 위해 GFP 태그가 지정된 알파 튜불린 스톡 용액을 역전에 의해 여러 번 혼합하여 와류 없이 균일한 용액을 보장합니다. 그런 다음 각 웰의 배양 배지를 40마이크로리터의 태그 튜불린을 함유한 2밀리리터의 새 배지로 교체합니다. 마커와 배양 배지가 완전히 혼합될 수 있도록 플레이트를 부드럽게 흔든 다음 플레이트를 다시 24시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.

다음날, 배양 배지를 도세탁셀이 함유된 새로운 배지로 교체하고 플레이트를 30분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 세포가 억제되는 동안 도립 형광 현미경을 켜고 샘플 홀더를 섭씨 37도로 예열합니다. 그런 다음 60X 1.42 NA 오일 대물 렌즈를 선택하고 첫 번째 커버 슬립을 샘플 홀더에 장착합니다.

배지를 함유한 섭씨 37도의 신선한 도세탁셀 1ml로 샘플을 덮고 명확하게 볼 수 있는 미세소관 구조와 함께 높은 GFP 태그가 지정된 알파 튜불린 형광 강도를 나타내는 편평한 세포 클러스터를 찾습니다. 클러스터에 있는 셀 중 하나의 주변 영역에 초점을 맞추고 이미지 획득 주파수에서 적절한 노출 시간을 설정합니다. 도세탁셀의 첫 번째 분취액을 투여한 후 정확히 50분이 지나면 2분 동안 미세소관 역학을 기록하기 시작하여 2초마다 사진을 얻습니다.

모든 이미지가 획득되면 각 도세탁셀 농도의 3개 웰 모두에서 총 5개의 세포에 대한 이미지가 캡처될 때까지 방금 설명한 대로 다음 세포를 이미지화합니다. 각 억제제 농도에 대한 모든 이미지를 획득했으면 현미경 시스템 내에서 디콘볼루션 프로그램을 열고 프로세스를 클릭합니다. 그런 다음 deconvolve를 선택하고 이미지 파일을 입력 창으로 드래그합니다.

do를 클릭하여 이미지를 디컨볼루션하고 디컨볼루션된 이미지 file 현미경 소프트웨어 내에서 엽니다. 파일을 클릭하고 동영상으로 저장합니다. 동영상 형식을 AV로 설정하고 애니메이션 스타일을 앞으로 설정합니다.

압축 품질을 100%로 설정하고 프레임 속도를 초당 5로 설정합니다. 그런 다음 시간을 통해 애니메이션 상자를 선택하고 do it을 클릭하여 비디오를 생성합니다. 이 대표적인 실험에서는 정상 및 도세탁셀 내성 유방암 세포를 도세탁셀로 처리하여 방금 시연된 바와 같이 영상화하였으나, 미세소관 성장 및 단축에 대한 치료의 효과는 비도세탁셀 내성 세포에서 가장 뚜렷

실제로, 0.5 마이크로몰 도세탁셀 치료 조건 하에서 미세소관의 성장 및 단축 속도를 측정하면 모세포의 튜불린 역학이 강력하게 억제되지만 도세탁셀에 내성이 없는 세포는 억제되지 않는 것으로 나타났습니다. 일단 숙달되면 기술이 제대로 수행되면 전체 프로세스를 60시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 GFP 튜불린 형광 강도가 높은 편평한 세포를 선택하고 여기 형광의 강도와 노출 기간을 모두 줄여 GFP 형광의 퇴색을 방지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 이후 이 기술은 세포 및 암 생물학 분야의 연구자들이 정상 세포와 암 세포에 대한 다양한 미세소관 표적 물질의 효과를 평가할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다양한 조건에서 살아있는 세포의 미세소관 동적 불안정성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.