Name: 비 형질 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포의 수립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 배우세요 정상 인간 섬유아세포에서 증식성 사배체 세포를 수립하는 방법을. 스핀들 독소 demecolcine 처리와 shake-off 기법을 활용하여 이세체 세포 없이 순수한 사배체 세포를 확보할 수 있습니다. 이 기술은 염색체 불안정성과 초기 발암 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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마츠모토 선생님의 기술 지원에 감사드립니다.

1. 세포 배양 <ol><li> tetraploidy을 유도하는 세포를 얻습니다. 최신으로이 기술은 인간 섬유 아세포 세포주 TIG-1, BJ, IMR-90 및 텔로 머라 - 불멸화 TIG-1 (TIG-HT)에 적용 할 수있는 것이 확인되었다. </li><li> α 변형 혹은 10 % (v / v)의 5 %에서 배양함으로써 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS) (V / 보충 공부 될 세포 유형에 적합한 임의의 다른 세포 배양액 최소 필수 배지에서 세포 성장 V) CO 37 ° C에서 2 분위기. 통로 세포는 subconfluent 밀도를 초과마다 3 사일 없습니다. 주 : 인구 배증 레벨 (PDL)는 세포 성장 및 세포 연령 평가에서 계대마다 계산되어야한다. PDL은 접시 (N1) 및 다음 식 (X 초기 PDL이다)를 사용하여 다음 계대 (N2)에서 수확 한 세포 수로 접종 세포 수로부터 계산 될 수있다. PDL은 = X + (N1 로그 - N2 로그) / 2 로그 </li></ol> 2. 유도 및 사령관이배체 섬유 아세포에서 배체 세포의 blishment <ol><li> 흔들림 오프없이 tetraploidy 유도한다. 참고 : 일부 세포주 (예 : TIG-1)은 다음과 같이 데메 콜신 (DC)로 거의 완전히 배체 연속 처리에 의한 될 수 있습니다. <ol><li> 치료 전날에 하나 또는 두 개의 100mm 접시에 통로 세포는 tetraploidy 유도합니다. 일반적으로 배체 세포의 유도를 위해 접시 당 5 × 10 5 6 10 × 1 세포를 준비합니다. </li><li> 4 일 동안 0.1 μg의 / ㎖의 DC를 포함하는 매체가 기하 급수적으로 증가 세포 치료. </li><li> 마약없는 매체와 매체를 DC가 함유 교체하고 37 ° C에서 (v / v)의 CO 2 분위기 5 %에서 세포를 배양한다. 세포는 통상 1 주일 이내에 증식을 다시 시작합니다. </li></ol></li><li> 흔들림 오프로 tetraploidy 유도한다. 주 : 대부분의 세포는 DC와 간단한 처리의 결과로서 이배체 및 사배체 집단의 혼합물이 상기 (2.1)에 설명된다. 는 P의 따라서 일부 수정rocedure (그림 1)을 다음과 같이 이배체 인구가 필요합니다 제거합니다. <ol><li> 여러 T75에 통로 세포는 tetraploidy을 유도하는 치료 전날 플라스크. 일반적 배체 세포를 유도하기위한 적어도 5 × 106 세포 (플라스크 당 1 × 106 세포)를 준비한다. </li><li> 유사 분열에서 셀을 체포 18 시간 - 16 0.1 μg의 / ㎖의 DC를 포함하는 매체가 기하 급수적으로 증가 세포 치료. 유사 분열에서 세포를 저지하기 위해 필요한 시간은 표적 세포에 의존 할 수 있고, 가능한 한 많은 유사 분열 세포를 얻기 위해 예비 실험에 의해 결정되어야한다. 예를 들어, 느린 성장 세포는 빠르게 성장하는 세포보다 긴 시간 동안 DC로 처리해야합니다. 주 : 셀이 너무 길면,이 단계에서의 치료를하는 경우, 그들은 유사 분열 슬립을 겪을 수 있으며 불가능 다음 단계에서 흔들림 차단하여 세포 분열을 수집하게 식기 표면에 부착. </li><li> 어에서 흔들림 오프 법에 의해 DC-체포 유사 분열 세포를 수집ICH 느슨하게 부착 유사 분열 세포는 원심 분리 플라스크 중간 세척 부드러운 진탕 (300 XG, 5 분)에 의해 수집된다. 이 단계에서 적절한 방법으로 세포 수를 계산합니다. </li><li> 60mm 배양 접시에 수집 유사 분열 세포를 다시 시드 및 추가 3 일간 0.1 μg의 / ㎖의 DC와 세포를 치료. 세포의 10 % 미만이 처리를 견딜 수 있으므로, 접시 당 이상 1 × 10 6 세포 유사 분열을 시드. </li><li> 마약없는 매체와 매체를 포함-DC를 교체하고 세포는 통상 1 주일 이내에 발생 확산을 재개 할 때까지 기다립니다. </li></ol></li><li> 마찬가지로 원래 이배체 세포 통로 세포. </li></ol> DNA의 배수성 3. 시험 참고 :이 잘 설립 절차 및 기술 설명서는 자세한 절차 및 기술 도움말을 참조해야합니다. <ol><li> 수확 세포 (5 × 10 5 - 1 × 6) 솔루션 콘과 배양 세포에 의한37 ° C에서 10 분 동안 0.05 % 트립신 및 0.02 % EDTA를 이닝, 및 10 % FBS를 함유하는 배지에서 트립신을 중화. </li><li> 매체에 원심 분리기 세포와 원심 분리 (300 XG, 5 분) 다음 인산염 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)에 재현 탁하여 그들을 씻는다. </li><li> 다음 두 가지 방법 중 하나에 의해 DNA 분석을 위해 세포를 준비 <ol><li> 고정되지 않은 셀 (10)을 분석하기위한 방법 주 :이 방법은 세포주기 분석을 위해 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 수행 될 수있다. 세포가 절차에 고정 핵이 시간이 지남에 따라 손상되어 염색되지 않기 때문에이 방법으로 제조 된 샘플은 즉시 분석되어야한다. <ol><li> 250 MM의 자당을 함유하는 40 mM의 시트 레이트 버퍼와 세포를 씻으십시오. 이어서 실온에서 10 분 동안 250 mM의 자당을 함유하는 200 μL의 40 mM의 시트르산 완충액, 0.1 % (V / V)의 Nonidet P40, 30 μg의 / ㎖ 트립신 250 μL로 셀을 처리한다. </li><li> 0.5 μg의 / ㎖의 트립신 INH의 200 μL를 추가실온에서 10 분 동안 ibitor 250 mM의 수크로오스를 포함하는 40 mM의 시트르산 완충액 0.1 μg의 / ㎖의 RNase A, 및 세포 배양한다. </li><li> 0.4 mg을 200 μL를 추가 / 250 mM의 자당을 함유하는 40mm의 시트르산 완충액 ㎖의 프로피 디움 요오다 이드 (PI), 및 세포 핵을 염색을 실온에서 10 분 동안 세포를 배양한다. </li></ol></li><li> 고정 된 세포를 분석하기위한 방법 <ol><li> 세포 현탁액을 혼합하고 실온에서 30 분 동안을 남기고 100 % EtOH로 적가 4㎖를 첨가, PBS 1 ㎖로 세포를 현탁하여 80 % 에탄올로 세포를 고정한다. 이 정착액의 셀은 여러 주 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> PBS 5ml에 재현 탁하여이를 세포 씻어 원심 분리 (300 × g으로 5 분) 하였다. 0.5 ㎎ / ㎖의 RNase A의 세포를 취급를 50㎍ / ㎖의 프로피 디움 요오다 이드 (PI) (0.5 ㎎ / ㎖의 RNase (A)의 475 μL 1 ㎎을 25 μL / ㎖ PI)을 실온에서 30 분 동안로 얼룩. </li></ol></li></ol></li><li> t의 DNA 함량을 분석그는 488 nm의 적색 레이저 발광 채널 필터로 유동 세포 계측기를 사용하여 세포 (긴&gt; 내지 610 단계). 표적 세포의 배수성을 평가하는 동시에 정품 이배체 세포로부터 제조 된 기준 샘플을 분석한다. <ol><li> 대안 적으로, 이배체 세포 대 비드의 형광 강도의 비율을 평가하기 위해 표준 형광 비드를 추가한다. 사이토 단일 배체 세포와 이배체 세포 (11)의 덩어리를 구별하는 흐름의 옵션 &#39;펄스 폭 대 펄스 높이&#39;를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 염색체 수와 핵형 분석 4. 시험 참고 :이 모든 잘 확립 된 절차이며, 기술 매뉴얼 또는 제조사의 프로토콜 세부 절차 및 기술 도움말을 참조해야합니다. <ol><li> 중기 세포를 체포하기 위해 4 시간 동안 0.1 μg의 / ㎖의 DC와 함께 기하 급수적으로 증가 세포 치료. </li><li> 염색체 슬라이드를 준비합니다. <ol><l난&gt; 트립신 처리하여 수확 세포 (적어도 5 × 10 5 세포)와 FBS를 포함하는 배지에서 일시 중지합니다. </li><li> 배지에서 세포 원심 분리 (300 × g으로 5 분), 10 분 동안 37 ° C에서 저장성 용액 (0.075 M KCl을 5 mL)로 처리한다. </li><li> 수정하고 Carnoy의 정착액 세포를 정지 (메탄올 : 아세트산 = 3 : 1). </li><li> 세포 현탁액의 - (35 μL 25) 작은 볼륨을 드롭하여 유리 슬라이드에 세포를 확산. 이러한 뜨거운 증기에 노출되는 등의 추가 단계가 확산 염색체를 개선해야 할 수도 있습니다. </li></ol></li><li> 현장 하이브리드의 염색체 개수 또는 핵형 분석 또는 여러 가지 빛깔의 형광에 대한 얼룩 세포 (mFISH). <ol><li> 염색체 수가. <ol><li> 20 분 - 5 % 김사 솔루션 (또는 형광 현미경 0.5 ㎎ / ㎖의 RNase A를 포함하는 5 μg의 / ML의 PI) 15와 얼룩 세포. </li><li> 디지털 적어도 50 중기 세포를 사진. </li><li> 이미지 분석을 이용 softwa 셀당 염색체 수를 계산터치 및 사진 편집 소프트웨어를 사용하여 염색체 중복 설명서를 분리 한 후 다시. 염색체 번호를 수동으로 득점 할 수 있지만, 컴퓨터 채점하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 핵형 분석 참고 :이 분석은 숙련 된 기술자 또는 전문 회사가 수행해야합니다. <ol><li> 표준 G 밴딩 기술 (12)에 따라 얼룩 세포. </li><li> 표준 karyograms (12)를 만들기 위해 염색체를 분석합니다. </li></ol></li><li> mFISH 참고 :이 단계는 선택 사항이며 필요한 경우 수행해야합니다. <ol><li> 제조 업체의 프로토콜 (13)에 따라 인간의 염색체에 대한 여러 가지 빛깔의 물고기 프로브를 사용하여 얼룩 세포. </li><li> 적절한 필터를 사용하여 형광 현미경 분석 mFISH (13)를위한 소프트웨어를 사용하여 염색체 분석. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Rabinovitch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+progression+in+Barrett%27s+esophagus+III%3A+baseline+flow+cytometric+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables.</a> Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).</li>
<li>Galipeau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSAIDs+modulate+CDKN2A%2C+TP53%2C+and+DNA+content+risk+for+progression+to+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma.</a> PLoS Med. 4 (2), e67(2007).</li>
<li>Olaharski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploidy+and+chromosomal+instability+are+early+events+during+cervical+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-independent+abrogation+of+a+postmitotic+checkpoint+contributes+to+human+papillomavirus+E6-induced+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy.</a> Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).</li>
<li>Davoli, T., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+causes+and+consequences+of+polyploidy+in+normal+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).</li>
<li>Fox, D., Duronio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoreplication+and+polyploidy%3A+insights+into+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease.</a> Development. 140, 3-12 (2013).</li>
<li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+failure+generating+tetraploids+promotes+tumorigenesis+in+p53-null+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells.</a> Nature. 437, 1043-1047 (2005).</li>
<li>Ganem, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+failure+triggers+hippo+tumor+suppressor+pathway+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation.</a> Cell. 158 (4), 833-848 (2014).</li>
<li>Kuznetsova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability%2C+tolerance+of+mitotic+errors+and+multidrug+resistance+are+promoted+by+tetraploidization+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells.</a> Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).</li>
<li>Vindeløv, L., Christensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+and+proteolytic+enzyme-based+techniques+for+nuclear+isolation+and+DNA+content+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Juan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content+measurement+for+DNA+ploidy+and+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis.</a> Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5(2001).</li>
<li>Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+analysis+guidelines+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genet+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Chromosome analysis guidelines preliminary report.</a> Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).</li>
<li>Liehr, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+FISH+probe+sets+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Multicolor FISH probe sets and their applications.</a> Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bipolar+spindles+with+two+centrosomes+in+tetraploid+cells+established+from+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts.</a> Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+proliferative+tetraploid+cells+from+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts.</a> Front. Oncol. 3, 198(2013).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+proliferative+tetraploid+cells+from+telomerase-immortalized+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosome+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts.</a> Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).</li>
<li>Di Leonardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+rereplication+in+the+presence+of+mitotic+spindle+inhibitors+in+human+and+mouse+fibroblasts+lacking+either+p53+or+pRb+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function.</a> Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).</li>
<li>Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploid+state+induces+p53-dependent+arrest+of+nontransformed+mammalian+cells+in+G1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).</li>
<li>Vogel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+of+the+mitotic+spindle+assembly+checkpoint+with+p53+to+prevent+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy.</a> Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).</li>
<li>Aylon, Y., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+Guardian+of+ploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">p53: Guardian of ploidy.</a> Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).</li>
<li>Uetake, Y., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+progression+after+cleavage+failure+%3A+mammalian+somatic+cells+do+not+possess+a+%26%2334%3Btetraploidy+checkpoint%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a &#34;tetraploidy checkpoint&#34.</a> J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).</li>
<li>Ganem, N., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+the+proliferation+of+polyploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Limiting the proliferation of polyploid cells.</a> Cell. 131, 437-440 (2007).</li>
<li>Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+of+p53+for+maintaining+chromosomal+stability+during+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization.</a> Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 관심이 없음을 선언합니다.

화학 약품에 의한 이배체 세포에서 tetraploidy의 유도에 큰 문제 중 하나 세포질 분열 억제제 또는 스핀들 억제제에 의해 세포가 종종 배체 및 배체 집단의 혼합물이 될 것입니다, 그리고 배체 세포는 이배체 세포로부터 분리해야합니다. 이배체 세포의 무료 배체 인구의 절연을위한 가장 일반적인 방법은 희석을 제한하여 FACS 또는 복제를 사용합니다. 그러나 이러한 과정은 힘들고 수행하기 쉽지 않다. 이 보고서에서 우리는 정상적인 인간의 섬유 아 세포에서 이배체 인구의 무료 증식 배체 세포를 확립 할 수있는 새로운 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 유사 분열에서 이배체 세포를 체포하기위한 스핀들 독 DC를 사용하고 접시 표면에 부착 이배체 간기 세포에서 떨이로 구분됩니다 유사 분열 세포를 체포했다. 수집 된 세포는 추가로 3 일간 DC로 처리되고, 유사 분열 이배체 세포는 아마도 DC B이 장기간 처리하여 G1 배체 세포로 변환Y 체크 포인트 적응 (또한 유사 분열 미끄러짐라고도 함). 이 세포는 약물 제거의 며칠 동안 성장...

배수성은 포유 동물 종의 전문 조직에서뿐만 아니라, 암과 같은 퇴행성 질환의 병리 적 상태의 다양한뿐만 관찰되었다. 배수체 (주로 배체) 세포는 종종 경부 3,4의 바렛 식도 2 또는 편평 상피내 병변 인간 조직의 발암 병변 관찰하고, 그 조직을 5 이수성 악성 세포의 근원으로 간주되어왔다 6. 이 이수성 배체 세포로의 전환이 종양 형성의 초기 단계에서 중요한 이벤트가 될 수 있다고 제시되어 있지만,이 과정에 관여하는 메커니즘은 완전히 이해되지 않는다. 이 비 형질 배수체 인간의 세포를 전파 할 수있는 더 체외 모델을 사용할 수 없었다 부분적으로 있기 때문이다. 일부 연구자들은 INH로 이핵 세포의 생성을 통해 비 형질 인간의 상피 세포에서 tetraploidy을 유도 한세포질 분열 7-9 ibiting. 그러나이 방법 불필요한 이배체 세포 -7,8- 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 제거해야 또는 희석 9를 제한하여 클로닝. 이러한 절차를 수행하기 쉬운 힘들고 없기 때문에 간단한 방법은 비 형질 배체 세포가이 분야의 연구를 위해 요구되는 설정합니다. 본 보고서에서, 우리는 비교적 간단한 절차에 의해 정상적인 인간 섬유 아세포 또는 텔로 머라 아제 - 불후의 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포를 확립하기위한 프로토콜을 설명합니다. 절차는 또한 DC로 처리 떨고에 의해 수집 된 유사 분열에서 이배체 세포 및 유사 분열 세포를 체포 스핀들 독 데메 콜신 (DC)를 사용합니다. 오랜 시간 동안 DC 처리 이배체 유사 분열 세포는 G1 배체 세포로 변환하고, 이들 세포는 약물의 제거 다음의 며칠 동안 성장 정지 후 같은 배체 세포 증식. 이 프로토콜은 제공염색체 불안정성 배수체 인간 종양 세포의 전위 사이의 관계를 연구하는 유용한 모델을 생성하는 효과적인 방법.

<table><tbody><tr><td>MEM-&알파;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Demecolcine 용액 (10 &mu; g/mL in HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1925-10ML</td><td></td></tr><tr><td>BD CycleTES Plus DNA 시약 키트</td><td>BD Biosciences</td><td>#340242</td><td>유세포 분석에 의한 DNA ploidy 검사</td></tr><tr><td>인간 염색체 다색 FISH 프로브 24XCyte</td><td>MetaSystems</td><td>#D-0125-060-DI</td><td>mFISH 분석을 위한 특수 필터 세트 및 소프트웨어가 필요합니다.</td></tr><tr><td>mFISH가 있는 Isis 이미징 시스템&nbsp; 소프트웨어&nbsp;</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>Specialized 프로브 키트가 필요합니다.</td></tr></tbody></table>

비 형질 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포의 수립

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

배수체(대부분 사배체) 세포는 인간 조직의 종양 이전 병변에서 종종 관찰되며 이들의 염색체 불안정성은 이러한 조직의 발암에 책임이 있는 것으로 간주되어 왔습니다. 증식성 배수체 세포는 배수체 세포의 염색체 불안정성을 분석하는 데 필요하지만, 변형되지 않은 인간 세포에서 이러한 세포를 만드는 것은 다소 어렵습니다. 화학 작용제에 의한 사배체의 유도는 일반적으로 이배체와 사배체 집단의 혼합을 초래하며, 대부분의 연구에서는 이배체 세포에서 사배체를 분리하기 위해 희석을 제한하여 형광 활성화 세포 분류 또는 복제를 사용했습니다. 그러나 이러한 절차는 시간이 많이 걸리고 힘들다. 본 보고서는 이배체 세포에 의한 오염을 최소화하면서 정상적인 인간 섬유아세포로부터 증식성 사배체 세포를 유도하는 비교적 간단한 프로토콜을 설명합니다. 간단히 말해서, 프로토콜은 다음과 같은 단계로 구성됩니다: demecolcine(DC)에 의한 유사분열 상태에서 세포 정지, 털어낸 후 유사분열 세포 수집, 수집된 세포를 추가로 3일 동안 DC로 배양, 약물이 없는 배지에서 세포 배양(며칠 이내에 사배체 세포로 증식을 재개함). 세포 유형에 따라 shaking에 의한 유사분열 세포의 수집은 생략될 수 있습니다. 이 프로토콜은 정상적인 인간 섬유아세포에서 증식성 사배체 세포를 확립하는 간단하고 실현 가능한 방법을 제공합니다. 이 방법으로 확립된 사배체 세포는 염색체 불안정성과 배수체 인간 세포의 발암 가능성을 연구하는 데 유용한 모델이 될 수 있습니다.

우리의 경험에 의하면, TIG-1 세포 4 일 0.1 μg의 / mL의 DC (그림 2A)와 간단한 연속 처리에 의해 거의 완전히 배체 할 수있다. 대조적으로, 예 BJ 또는 IMR-90 및 TIG-HT 세포와 같은 다른 섬유 아세포 균주, 흔들림 오프 법에 의해 이배체 동일한 처리 다음 배체 집단, 및 유사 분열 세포의 분리 혼합물되었다이 과정에서 필요한 (- 치료 시작 후 18 시간 일반적으로 16) (도 2B, C) DC 치료. 3 일간 DC와 추가 처리 후, 세포 성장 체포를 시행하고 대형 전시, 며칠 동안 형태를 평평. 일반적으로 일주일 이내에, 작은 증식 세포는 큰 평평한 세포 사이 (그림 3) 나타났다. DC 처리 후 삼주 - 세포는 거의 완전히 배체 2가되었다. 설립 배체 세포 모달 염색체 번호 exce, 대부분의 경우 92이었다PT TIG-HT 세포로부터 설정된 ...

다배체 세포의 염색체 불안정성을 분석하기 위해서는 증식 배수체 세포가 필요하지만, 변형되지 않은 인간 세포에서 이러한 세포를 만드는 것은 쉽지 않습니다. 본 보고서는 정상적인 인간 섬유아세포로부터 이배체 집단이 없는 증식성 사배체 세포를 확립하기 위한 비교적 간단한 절차를 설명합니다.

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

이 절차의 전반적인 목표는 정상적인 인간 섬유아세포로부터 이배체 집단이 없는 증식성 사배체 세포를 확립하는 것입니다. 이 방법은 발암 초기 단계에서 이수성 세포가 어떻게 발달하는지와 같은 발암 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이배체 집단이 없는 증식성 사배체 세포를 비교적 간단한 절차로 확립할 수 있다는 것입니다.일부 균주는 방추 독인 demecolcine을 사용한 간단한 처리로 완전히 사배체가 되지만, 대부분은 이배체 집단을 모방하기 위해 처리 중에 쉐이크오프 방법으로 처리해야 합니다. 쉐이크오프(shake-off) 방법 없이 사배체(tetraploidy)의 유도를 시작하려면 1/5 배양된 세포에 100mm 접시에 약 5배 배의 배양을 배양합니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 분위기에서 24시간 동안 접시를 배양합니다.그 후, 기하급수적으로 성장하는 세포를 4일 동안 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 분위기에서 밀리리터 DC.Incubate 당 0.1마이크로그램을 포함하는 배지로 처리합니다. 그런 다음 DC 함유 배지를 무약물 배지로 교체합니다. 증식이 재개될 때까지 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 배양합니다.쉐이크오프(shake-off) 방법을 사용하여 사배체를 유도하려면 배양된 세포를 T-75 플라스크에 통과시키고 각 플라스크에 1/6 세포의 10배가 1배 이상 포함되어 있는지 확인합니다. 플라스크를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 분위기에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날, 16-18시간 동안 DC를 함유한 배지로 세포를 처리하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유사분열 상태로 세포를 정지시킵니다.배양 후 반전 위상차 현미경으로 플라스크의 세포를 확인합니다. 그런 다음 각 플라스크를 부드럽게 흔들어 느슨하게 부착된 유사분열 세포의 수집을 시작합니다. 격렬하게 흔들거나 피펫 팁으로 플라스크 표면을 만지는 것과 같은 부주의한 취급은 피해야 합니다.부착 된 계면 세포로 유사 분열 세포를 오염시키지 마십시오. 따뜻한 배지로 플라스크를 부드럽게 세척하고 세포를 원심분리 튜브로 옮깁니다. 원자 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다.세포 계수 후 300배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 수집된 유사분열 세포를 16mm 배양 접시에 다시 파종합니다. 그런 다음 도금 된 세포를 3 일 동안 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 밀리리터 DC.Incubate 당 0.1 마이크로 그램을 포함하는 매체로 처리하십시오.그런 다음 DC 함유 배지를 무약물 배지로 교체하십시오. 증식이 재개될 때까지 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 대기에서 배양합니다. DNA ploidy를 분석하려면 PBS로 세포를 세척합니다.그런 다음 0.05%트립신과 0.02%EDTA가 함유된 용액을 세포에 추가합니다. 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮깁니다.그리고 10%fetal bovine serum를 포함하는 매체를 추가해서 trypsin를 중화하십시오. 배지에서 300배 g으로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 5ml의 PBS에 세포를 재현탁합니다.그런 다음 300회 g에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 다음으로, 1ml의 PBS에 세포를 재현탁합니다. 100% 에탄올 4ml를 섞으면서 적방울 방향으로 첨가합니다.현탁액을 실온에서 30분 동안 그대로 두어 세포를 고정합니다. 그 후, 고착액에 세포를 300 회 g에서 5 분 동안 원심 분리한다. 그리고 5ml의 PBS에서 세포를 재현탁합니다.현탁액을 300회 g에서 5분 동안 원심분리한다. 그런 다음 475마이크로리터의 0.5mg/밀리리터 RNA 용액으로 세포를 처리합니다. 25 마이크로리터의 밀리리터 프로피듐 요오드 용액 1mg을 첨가하여 세포를 염색합니다.그런 다음 섞습니다. 서스펜션을 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오. 다음으로, 488 나노미터 레이저와 적색 채널 방출 필터가 있는 유세포 분석기를 사용하여 세포의 DNA 함량을 분석합니다.표적 세포의 ploidy를 평가하기 위해 실제 이배체 세포에서 준비된 참조 샘플을 분석합니다. 먼저 기하급수적으로 성장하는 세포를 밀리리터 DC당 0.1마이크로그램을 함유한 배지로 4시간 동안 처리하여 중기에서 세포를 정지시킵니다. 그 후, 트립신화(trypsinization)에 의해 1/5 세포의 10배를 5배 이상 수확한다.FBS를 함유하는 배지에 수확된 세포를 현탁시킵니다. 현탁액을 300회 g에서 5분 동안 원심분리한다. 그런 다음 0.075 몰 염화칼륨 용액 5 밀리리터를 추가합니다.섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 배양이 완료된 후 현탁액을 300회 g에서 5분 동안 원심분리합니다. Carnoy's fixative 5ml에 세포를 재현탁시킵니다.그런 다음 5 분 동안 300 회 g에서 현탁액을 원심 분리하십시오. 그런 다음 상등액을 흡인하고 0.5ml의 Carnoy's fixative에 세포를 재현탁합니다. 30마이크로리터의 셀 현탁액을 유리 슬라이드에 떨어뜨립니다.마지막으로, 염색체 수 또는 핵형 분석을 통해 세포를 염색하고 분석합니다. 이 연구에서는 이배체 집단이 없는 증식성 사배체 세포를 정상적인 인간 섬유아세포에서 배양합니다. 일부 세포 균주는 DC로 지속적인 처리에 의해 완전히 사배체가 될 수 있지만, 대부분의 세포는 이배체 집단을 제거하기 위해 DC 처리 과정에서 쉐이크 오프 방법으로 처리해야 합니다.3개의 섬유아세포 균주에서 사배체의 유도에 대한 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. TIG-1 균주는 DC를 사용한 간단한 연속 처리를 통해 거의 완전히 사배체가 되지만, 이 처리로 인해 BJ 및 TIG-hT 균주가 이배체와 사배체 개체군의 혼합물이 됩니다. 따라서 처리 과정에서 쉐이크 오프 방법에 의한 유사 분열 세포의 분리가 필요합니다.염색체 계수는 확립된 사배체 세포에서 수행됩니다. 보시다시피 모달 염색체 수는 TIG-1 세포와 BJ 세포 모두 92이고 TIG-hT 세포는 91입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2주 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안, 쉐이크 오프 단계에서 플라스크를 부드럽게 흔드는 것이 중요하며, 부착 계면 세포에 의해 유사분열 세포가 오염되지 않도록 해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 인간의 요인 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Lin28의 lentivirus - 중재 전송을 사용하여 인간의 체세포에서 유도된 pluripotent 줄기 세포의 생성에 대한 프로토콜을 보여줍니다. Pluripotency는 형태학 및 배아 줄기 (ES) 세포 특정 마커의 존재에 의해 확인되었다.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

암종 - 관련 섬유아 세포 (CAFs) 종양의 기질 내에 존재 myofibroblasts 풍부한은 종양의 진행을 운전에 중요한 역할을한다. 우리는 실험적으로 인간의 섬유아 세포에서 mammary CAFs 창출을위한 coimplantation 종양의 xengraft 모델을 개발했습니다. 프로토콜 tumourigenesis을 추진하는 능력을 습득 카페인 myofibroblasts을 수립하는 방법에 대해 설명합니다.

인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

우리는 렌티바이러스 기반의 재프로그래밍 및 특성화된 무인자 인간 유도 만능 줄기세포를 유도하고 추정되는 임상 등급 조건으로 전환하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다.

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

여기 우리 재활 요인 인코딩 수정된 mRNAs를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 인간의 기본 섬유 아 세포를 재 설 정할 임상 관련, 높은 효율, 피더 무료 메서드를 설명 하 고 성숙한 예측에 관한-367/302 모방. 또한는 재활 효율성을 평가 하는 방법 클론 iPSC 식민지 확장 및 pluripotency 마커 TRA-1-60의 식을 확인 있습니다.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

이 문서에서는 OP9/DLL1 공동 배양 시스템을 사용하여 기능성 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 CD8αβ+ 단일 양성 T 세포를 생성하는 방법을 설명한다.

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

이 프로토콜은 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하는 전사 인자 GATA2, GFI1B 및 FOS의 발현을 강제함으로써 인간 진피 섬유아세포에서 혈생 프로그램의 유도를 입증한다.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

배우세요 정상 인간 섬유아세포에서 증식성 사배체 세포를 수립하는 방법을. 스핀들 독소 demecolcine 처리와 shake-off 기법을 활용하여 이세체 세포 없이 순수한 사배체 세포를 확보할 수 있습니다. 이 기술은 염색체 불안정성과 초기 발암 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

비 형질 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포의 수립

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