비 형질 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포의 수립

이 절차의 전반적인 목표는 정상적인 인간 섬유아세포로부터 이배체 집단이 없는 증식성 사배체 세포를 확립하는 것입니다. 이 방법은 발암 초기 단계에서 이수성 세포가 어떻게 발달하는지와 같은 발암 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이배체 집단이 없는 증식성 사배체 세포를 비교적 간단한 절차로 확립할 수 있다는 것입니다.

일부 균주는 방추 독인 demecolcine을 사용한 간단한 처리로 완전히 사배체가 되지만, 대부분은 이배체 집단을 모방하기 위해 처리 중에 쉐이크오프 방법으로 처리해야 합니다. 쉐이크오프(shake-off) 방법 없이 사배체(tetraploidy)의 유도를 시작하려면 1/5 배양된 세포에 100mm 접시에 약 5배 배의 배양을 배양합니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 분위기에서 24시간 동안 접시를 배양합니다.

그 후, 기하급수적으로 성장하는 세포를 4일 동안 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 분위기에서 밀리리터 DC.Incubate 당 0.1마이크로그램을 포함하는 배지로 처리합니다. 그런 다음 DC 함유 배지를 무약물 배지로 교체합니다. 증식이 재개될 때까지 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 배양합니다.

쉐이크오프(shake-off) 방법을 사용하여 사배체를 유도하려면 배양된 세포를 T-75 플라스크에 통과시키고 각 플라스크에 1/6 세포의 10배가 1배 이상 포함되어 있는지 확인합니다. 플라스크를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 분위기에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날, 16-18시간 동안 DC를 함유한 배지로 세포를 처리하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유사분열 상태로 세포를 정지시킵니다.

배양 후 반전 위상차 현미경으로 플라스크의 세포를 확인합니다. 그런 다음 각 플라스크를 부드럽게 흔들어 느슨하게 부착된 유사분열 세포의 수집을 시작합니다. 격렬하게 흔들거나 피펫 팁으로 플라스크 표면을 만지는 것과 같은 부주의한 취급은 피해야 합니다.

부착 된 계면 세포로 유사 분열 세포를 오염시키지 마십시오. 따뜻한 배지로 플라스크를 부드럽게 세척하고 세포를 원심분리 튜브로 옮깁니다. 원자 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다.

세포 계수 후 300배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 수집된 유사분열 세포를 16mm 배양 접시에 다시 파종합니다. 그런 다음 도금 된 세포를 3 일 동안 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 밀리리터 DC.Incubate 당 0.1 마이크로 그램을 포함하는 매체로 처리하십시오.

그런 다음 DC 함유 배지를 무약물 배지로 교체하십시오. 증식이 재개될 때까지 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 대기에서 배양합니다. DNA ploidy를 분석하려면 PBS로 세포를 세척합니다.

그런 다음 0.05%트립신과 0.02%EDTA가 함유된 용액을 세포에 추가합니다. 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

그리고 10%fetal bovine serum를 포함하는 매체를 추가해서 trypsin를 중화하십시오. 배지에서 300배 g으로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 5ml의 PBS에 세포를 재현탁합니다.

그런 다음 300회 g에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 다음으로, 1ml의 PBS에 세포를 재현탁합니다. 100% 에탄올 4ml를 섞으면서 적방울 방향으로 첨가합니다.

현탁액을 실온에서 30분 동안 그대로 두어 세포를 고정합니다. 그 후, 고착액에 세포를 300 회 g에서 5 분 동안 원심 분리한다. 그리고 5ml의 PBS에서 세포를 재현탁합니다.

현탁액을 300회 g에서 5분 동안 원심분리한다. 그런 다음 475마이크로리터의 0.5mg/밀리리터 RNA 용액으로 세포를 처리합니다. 25 마이크로리터의 밀리리터 프로피듐 요오드 용액 1mg을 첨가하여 세포를 염색합니다.

그런 다음 섞습니다. 서스펜션을 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오. 다음으로, 488 나노미터 레이저와 적색 채널 방출 필터가 있는 유세포 분석기를 사용하여 세포의 DNA 함량을 분석합니다.

표적 세포의 ploidy를 평가하기 위해 실제 이배체 세포에서 준비된 참조 샘플을 분석합니다. 먼저 기하급수적으로 성장하는 세포를 밀리리터 DC당 0.1마이크로그램을 함유한 배지로 4시간 동안 처리하여 중기에서 세포를 정지시킵니다. 그 후, 트립신화(trypsinization)에 의해 1/5 세포의 10배를 5배 이상 수확한다.

FBS를 함유하는 배지에 수확된 세포를 현탁시킵니다. 현탁액을 300회 g에서 5분 동안 원심분리한다. 그런 다음 0.075 몰 염화칼륨 용액 5 밀리리터를 추가합니다.

섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 배양이 완료된 후 현탁액을 300회 g에서 5분 동안 원심분리합니다. Carnoy's fixative 5ml에 세포를 재현탁시킵니다.

그런 다음 5 분 동안 300 회 g에서 현탁액을 원심 분리하십시오. 그런 다음 상등액을 흡인하고 0.5ml의 Carnoy's fixative에 세포를 재현탁합니다. 30마이크로리터의 셀 현탁액을 유리 슬라이드에 떨어뜨립니다.

마지막으로, 염색체 수 또는 핵형 분석을 통해 세포를 염색하고 분석합니다. 이 연구에서는 이배체 집단이 없는 증식성 사배체 세포를 정상적인 인간 섬유아세포에서 배양합니다. 일부 세포 균주는 DC로 지속적인 처리에 의해 완전히 사배체가 될 수 있지만, 대부분의 세포는 이배체 집단을 제거하기 위해 DC 처리 과정에서 쉐이크 오프 방법으로 처리해야 합니다.

3개의 섬유아세포 균주에서 사배체의 유도에 대한 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. TIG-1 균주는 DC를 사용한 간단한 연속 처리를 통해 거의 완전히 사배체가 되지만, 이 처리로 인해 BJ 및 TIG-hT 균주가 이배체와 사배체 개체군의 혼합물이 됩니다. 따라서 처리 과정에서 쉐이크 오프 방법에 의한 유사 분열 세포의 분리가 필요합니다.

염색체 계수는 확립된 사배체 세포에서 수행됩니다. 보시다시피 모달 염색체 수는 TIG-1 세포와 BJ 세포 모두 92이고 TIG-hT 세포는 91입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2주 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안, 쉐이크 오프 단계에서 플라스크를 부드럽게 흔드는 것이 중요하며, 부착 계면 세포에 의해 유사분열 세포가 오염되지 않도록