Name: 단일 벽 탄소 나노 튜브에 바이오 모방 고분자와 공학 분자 인식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 학습하세요 단일벽 탄소나노튜브에 바이오모방 고분자를 이용한 분자 센서 개발 방법을. 근적외선 형광을 활용해 살아있는 조직에서 도파민 같은 소분자를 실시간 검출할 수 있습니다.

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이 연구는 CASI(Scientific Interface)의 Burroughs Wellcome Fund Career Award, Simons Foundation 보조금 및 Brain and Behavior Research Foundation 젊은 연구자 보조금의 지원을 받았습니다.

주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (SDS)를 참조하십시오. 나노 물질은 벌크 재료 대응에 비해 추가적인 위험이있을 수 있습니다. 공학적 관리 (흄 후드, 소음 인클로저) 및 개인 보호 장비를 포함한 모든 적절한 안전 관행 사용 (안전 안경, 고글, 실험실 코트, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발). 버퍼, 계면 활성제 및 폴리머 솔루션 1. 준비 <ol><li> 100 mM의 NaCl 용액의 제조 <ol><li> 탈 이온수 80 mL에 염화나트륨 584 mg을 녹이고. 100 mL의 총 부피를 가지고 탈 이온수를 추가합니다. </li></ol></li><li> 3 % 나트륨 도데 실 설페이트의 제조 (SDS) 용액 <ol><li> 탈 이온수 80 mL의 SDS의 3g을 녹인다. 100 mL의 총 부피를 가지고 탈 이온수를 추가합니다. </li></ol></li><li> 2 % 소듐 콜레이트의 제조 (SC) 용액 <ol><li> 잔디의 2g을 녹여IUM 탈 이온수 80 ml에 수화물 콜레이트. 100 mL의 총 부피를 가지고 탈 이온수를 추가합니다. </li></ol></li><li> 촬상 완충액의 제조 (1X 트리스 20 mM의 트리스, 100 mM의 NaCl) <ol><li> 트리스 염기 22.23 g 및 자기 교반 막대 및 플레이트를 이용하여 탈 이온수 500 ㎖의 염화나트륨 58.44 g을 녹인다. </li><li> 8.1의 pH에 ​​도달 할 때까지 진한 HCl을 조심스럽게 추가한다. </li><li> L. 한 최종 부피에 도달하기 위해, 탈 이온수를 추가 </li></ol></li><li> RITC-PEG-RITC 중합체의 합성 <ol><li> 디클로로 메탄 및 디메틸 포름 아미드 (DMF)의 1 : 1 혼합물 1 1 ㎖ 아민 difunctionalized 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (5 kDa의 20 kDa의 0.1 몰 / L) 및 로다 민 이소 티오 시아 네이트 (RITC 0.2 몰 / L)을 녹인다. </li><li> 0.2 몰의 N / L, N의 디 이소 프로필 에틸 아민 (DIEA)를 추가합니다. </li><li> 3 시간 후, 감압 여과 한 다음, 디 에틸 에테르의 10 배 부피의 침전. </li><li> DMF에 재용 에테르 침전 FOLLO을 반복진공 여과에 의해 결부. 참고 : 동일한 방법을 사용하여 다른 이소 티오 시아 네이트 개질 된 분자 (예를 들면, 형광 염료, FITC)는 PEG 또는 다른 아민 변성 중합체에 부착 될 수있다. </li></ol></li><li> 페 길화-DNA의 조제 (PEG-DNA) <ol><li> 100 트리스 (2- 카르복시 에틸) 44.9 μL와 포스 핀 히드로 클로라이드 (TCEP) 용액 (0.5 M, pH를 7.0)의 μL 5&#39;- 티올 - 개질 된 DNA (1 밀리그램 / 0.1 M NaCl을 10 μL) 및 4.855 mL의 추가 겸용 탈 이온수. </li><li> 1 시간 동안 교반한다. </li><li> 인산염 완충 염수 5 mL에 메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 말레이 미드 500 mg을 녹인다. </li><li> DNA와 PEG 용액 (10 ㎖ 총)을 합하여 24 시간 동안 교반한다. </li></ol></li></ol> 단일 벽 탄소 나노 튜브 (SWNT를) 정학 2. 준비 <ol><li> 단일 벽 탄소 나노 튜브의 세척은 촉매 및 불순물을 제거합니다. <ol><li> 플라스틱 원심 분리기 튜브 접점에 씻지 단일 벽 탄소 나노 튜브의 200 ~ 300 mg을 추가탈 이온수 45 mL의 ining. </li><li> 소용돌이 2 분간 초음파 처리하고 5 분 동안 욕조 초음파 처리기를 사용하는 용액. 설정이 악기 악기에서 변화가 초음파기를 참고하기 때문에 단일 벽 탄소 나노 튜브가 분산되고 있음을 보장하기 위해 단일 벽 탄소 나노 튜브 용액 증가의 광학 밀도 (즉, 검게) 있는지 확인합니다. </li><li> 16,100 XG에서 20 분에 대한 솔루션을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 신선한 탈 이온수의 약 45 ML을 추가합니다. </li><li> 단계를 반복 2.1.2-2.1.4 8 배까지. </li><li> 수는 펠렛 단일 벽 탄소 나노 튜브를 방해하고 공기 건조에 SWNT 펠렛을 허용하지 않도록주의만큼 물을 제거합니다. </li></ol></li><li> 단일 벽 탄소 나노 튜브의 현탁액 핵산 <ol><li> 100 ㎎ / ㎖의 농도로 0.1 M의 NaCl에서의 핵산 (NA)를 녹인다. </li><li> 정전기 방지 건을 사용 일회용 주걱, 마이크로 원심 튜브 및 SWNT의 재고에서 정전기를 제거합니다. 흄 후드에서 0 980 μL로 NA 용액 20 μL를 추가0.1 M NaCl을 1 mg을 단일 벽 탄소 나노 튜브를 첨가 하였다. </li><li> 3mm 직경의 팁과 함께 초음파를 사용하여, 빙 냉하 40 % 진폭에서 10 분 동안 상기 용액을 초음파 처리. </li><li> g X 16,100에서 90 분 동안 두 번 DNA-SWNT 솔루션을 원심 분리기. PEG-DNA를 사용하는 경우, 100 kDa의 스핀 필터를 사용하여 초과 및 미 반응 DNA와 PEG를 정화. 1.5 분 동안 9,300 XG에 스핀 필터와 스핀을 채우기이 세척 단계를 3 번 ​​반복하기에 충분한 PBS를 추가합니다. </li><li> 수집 및 CNT 번들 집계를 포함하는 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 상층 액을 유지합니다. 나노 물질에 대한 적절한 제도적 유해 폐기물의 절차에 따라 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 램버트 - 비어의 법칙 및 적절한 희석 인자에 따라 ε = 0.036 L / cm · 정제 법 현탁 SWNT를 대략적인 농도를 결정하기 위해 UV / 비스 분광 광도계를 사용하여 632 nm에서의 용액의 흡광도를 측정한다. </li></ol></li><li> 양친 매성 고분자 현탁액단일 벽 탄소 나노 튜브의 <ol><li> 일회용 주걱, 마이크로 원심 분리기 튜브 및 SWNT의 재고에서 정전기를 제거합니다. 흄 후드에서 2 % SC 용액 5 ㎖에 5 mg을 단일 벽 탄소 나노 튜브를 추가 (또는, SDS 용액을 사용할 수있다). </li><li> 6mm 직경의 팁과 함께 초음파를 사용하여, 빙 냉하 40 % 진폭에서 1 시간 동안 용액을 초음파 처리. </li><li> 초 원심 분리기를 사용하여 조심스럽게 상층 액을 수집 4 시간 동안 150,000 XG에 원심 분리기 샘플. </li><li> (예를 들어, RITC-PEG-RITC) SC-SWNT 용액 양친 성 고분자의 1 중량 %를 용해. </li><li> 탈 이온수 1 L에 대해 3.5 kDa의 투석막을 이용하여 중합체 - SC-SWNT 용액을 투석 또는 5 일 동안 버퍼. 물을 변경할 정도로 그것이 선택의 계면 활성제의 제거를 허용하는, 시간 2 시간 4 클수록 투석막이 사용될 수 후 버퍼 있지만 SWNT 및 양친 성 중합체 모두 보존. </li><li> 결정하기 위해 UV / 비스 분광 광도계를 사용하여 632 nm에서의 용액의 흡광도를 측정램버트 - 비어의 법칙과 적절한 희석 배수에 따라 ε = 0.036 L / cm * mg의 사용 중단 단일 벽 탄소 나노 튜브의 대략적인 농도. </li></ol></li></ol> 표면 고정화 SWNT 센서 3. 준비 <ol><li> BSA - 비오틴과 뉴트라 비딘의 재고 솔루션의 준비 <ol><li> 4 ° C에서 10 ㎎ / ㎖ 원액 저장을 1 mL의 탈 이온수에 10 mg의 동결 건조 BSA - 비오틴을 녹인다. </li><li> 5 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 탈 이온수 2 ml에 10 mg의 비딘 단백질 (NAV 아비딘 탈글 라이코 실화 된 단백질)을 녹인다. -20 ° C에서 보관 씩. 해동 된 분액을 4 ℃에서 수 일 동안 유지 될 수있다. </li></ol></li><li> BSA - 비오틴 코팅 현미경 슬라이드를 준비합니다 <ol><li> 메탄올, 아세톤 및 탈 이온수의 최종 린스 현미경 슬라이드 및 탈 이온수 0.17 mm 용 커버 유리 (또는 현미경 대물 대한 적절한)을 청소한다. </li><li&gt; 깨끗한 현미경 슬라이드에 약 5mm 간격 양면 테이프의 여러 조각을 배치하여 채널을 만듭니다. 긴 유리 커버 슬립을 고려하여 양면 테이프의 상단에이를 눌러 채널을 밀봉. 커버 슬립 및 슬라이드의 가장자리가 플러시되지 않도록 그것이 현미경 슬라이드를 중심으로되어 있는지 확인합니다. </li><li> 1 mg / ml의 최종 농도를 900 μL의 1X 트리스 완충액에 BSA 비오틴 스톡 용액 100 μL를 추가한다. </li><li> 한쪽 끝으로 솔루션을 피펫 팅과 조직을 사용하여 다른에서 솔루션을 멀리 심지하여 채널에 BSA - 비오틴 용액 50 μL 흐름. 0.1 M NaCl을 50 μL로 3-5 플러시 다음 5 분 동안 품어. </li><li> 0.2 ㎎ / ㎖의 최종 농도 960 μL 1X 트리스 완충액에 5 ㎎ / ㎖ 스톡 NAV 40 μL 희석. </li><li> 일단 부에 상기 용액을 피펫 팅하여 조직을 사용하여 다른에서 용액을 얻어 위킹에 의해 상기 채널에 NAV 용액 50 μL를 흐른다. 2-5분 품어0.1 M NaCl을 50 μL 3-5 플러시 하였다. </li><li> 1-10 ㎎ / ℓ의 농도로 촬상 완충액의 SWNT의 원액을 희석하고, 채널 내로 용액 50 μL를 흐르게하고 5 분 동안 배양한다. </li><li> 부드럽게 이미지 버퍼의 50 μL를 사용하여 여분의 단일 벽 탄소 나노 튜브를 멀리 씻어. </li></ol></li><li> APTES 실란 현미경 슬라이드의 준비 주 : APTES는 슬라이드 방식이 유리 기판의 표면에 음전하 DNA 감싸 벽 탄소 나노 튜브를 고정 할 수 있도록 실란 화. <ol><li> 에탄올 (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 (APTES)의 10 % 용액을 제조 하였다. </li><li> 3.2.2에 설명 된 단계를 사용하여 만든 채널을 사용하여, 100 μL 1 배의 트리스 버퍼에 흐른다. </li><li> APTES 솔루션 채널을 세척하고 5 분 동안 품어. 1X 트리스 버퍼로 씻으십시오. </li><li> 1-10 밀리그램 / 랜드 흐름의 농도 채널 incub로 용액 50 μL로 촬상 완충액 DNA-SWNT로의 원액을 희석5 분 동안 먹었다. </li><li> 부드럽게 이미지 버퍼의 50 μL를 사용하여 여분의 단일 벽 탄소 나노 튜브를 멀리 씻어. </li></ol></li></ol> 4. 형광 분광학 및 단일 벽 탄소 나노 튜브 센서의 현미경 <ol><li> NIR 형광 현미경 <ol><li> 레이저 여기 및 이미징을위한 InGaAs로 센서 어레이와 복을 거꾸로 현미경을 이용하여 표면에 고정 된 단일 벽 탄소 나노 튜브의 이미징을 수행합니다. </li><li> 조정기구 학적 마운트에 거울 포트 높이로 설정 후 장착 홍채의 쌍을 이용하여 역 현미경의 후면 조명 포트에 입력되는 레이저 빔을 지향. 빔이 수준 확인 및 후속 거울 사이가 조명 포트에 들어가기 전에 둘 때 바로 확인하여 두 붓꽃을 통과한다. 필요한 경우, 잠망경 조립체를 사용하여 빔의 높이를 조정한다. 빔을 감쇠 것이다 조명 포트에 어떤 짧은 패스 열 필터를 제거합니다. </li><li> 현미경으로 적절한 필터 큐브를 삽입목적에 여기 광을 반사 및 방출 빛을 수집합니다. 이것은 일반적으로 여기 파장 상기 절단 (예, 750 LP) 및 상기 센서 타격로부터 산란 된 여기 광을 최소화하기 위해 배출 긴 통과 필터 (예를 들어, 850 LP)와 이색 긴 통과 필터로 구성된다. 또한, 배출 필터는 특정 키랄성의 SWNT의 발광을위한 선택적으로 선택 될 수있다. </li><li> 1mm의 작은 구멍을 포함하는 두 개의 오프셋 젖 디스크 대물 교체 적절한 정렬 큐브를 삽입하여 광 배향 미세 조정을 수행한다. 두 하부 및 상부 배향막의 디스크의 중심으로 빔을 맞추고. </li><li> 센서의 크기를 수용하기 위해 필요하면 적절한 어댑터 및 0.5X 렌즈를 사용 현미경 측 촬상 포트 차원의 InGaAs 센서 어레이를 부착. </li><li> 100X 오일 침지 대물 (NA 1.4)를 사용하여 형광이없는 침지 오일을 적용하고 immobi 배치현미경 단계에 진입하게 안정적 SWNT 샘플. </li><li> 오일에 접촉 할 때까지 상기 커버 유리의 바닥 (# 1.5, 170 ㎛의 두께)를 목적으로 상향한다. 촬상 조건, 예를 들면, 온도, 유리 두께 등 대물 칼라 조정 필요합니다 </li><li> 천천히에 여진 원과 목적을 올리고 InGaAs로 카메라의 형광 신호를 모니터링한다. 초점면이 표면에 접근하고 고정 된 센서는 초점이 같은 형광 강도가 점차 증가 할 전망이다. </li></ol></li><li> NIR 형광 분광학 참고 : 형광 분광법은 같은 현미경 설정을 사용하여 수행하지만, 현미경 몸 밖으로와 분광계와의 InGaAs 선형 배열 검출기로 수집 된 빛을 연출하여 할 수 있습니다. <ol><li> NIR 정격 학적 마운트와 거울을 사용하여, 분광기의 입구 슬릿쪽으로 광로를 지시. 관심 장소에 빛을 초점입구는 집광 렌즈를 이용하여 NT 슬릿 상 (예를 들면, 평 볼록, F = 150mm). 이 배향은 &lt;1 mW의 레이저 파워를 감쇠 및 1 &quot;거울 현미경 대물 렌즈를 교체하고, 50/50 빔 분할 필터 큐브를 사용하여 달성된다. 여기 광은 출구 포트를 통해 현미경 본체 떠날 수 것 입구 슬릿에 상기 빔을 포커스하는 거울 및 렌즈를 조절하기 위해 사용되는. </li><li> 현미경 대물 긴 통과 필터를 교체 한 후, 스테이지 상에 웰 플레이트를 배치하고, 분광기 및 InGaAs로 어레이를 이용한 합초 샘플의 스펙트럼을 기록한다. </li></ol></li><li> 도파민에 (GT) 15 DNA-단일 벽 탄소 나노 튜브의 가역 반응을 측정 <ol><li> 마운트 센서 현미경 스테이지로 채널을 코팅 및 100X 대물 오일 및 InGaAs로 카메라를 이용하여 초점 가져온다. 유동 채널 레코드로 포스페이트 완충 염수 100 μM 도파민 용액 (PBS)의 50 μL를 추가형광 강도의 변화. </li><li> 인산염 완충 생리 식염수를 사용하여 도파민 솔루션을 씻어 내고 개별 SWNT 센서의 형광의 변화를 관찰한다. </li></ol></li><li> 단일 벽 탄소 나노 튜브 센서의 분석 응답을 잘 플레이트 심사 주의 : 다른 분석 물질의 스크리닝이 전동 스테이지를 사용하여 제어 투명 웰 플레이트를 사용하여 수행 될 수있다. 이상적인 잘 판 표시 및 IR에 투명하고 우물 사이의 크로스 토크를 최소화하기 위해 검은 측벽이 있습니다. <ol><li> 일시 중단 된 SWNT 센서 (예를 들어, 5 ㎎ / ℓ 농도) 각 웰, 충분한으로는 384 웰 플레이트의 96 웰 플레이트에 대해 잘 균일하게, 일반적으로&gt; 100 μL의 바닥&gt; 30 μL 다루의 피펫 동일한 볼륨 . </li><li> 피펫 분석 (예를 들어, 2 μL, 100 μM 최종 부피)를 웰 플레이트에 라이브러리를 스크리닝에서. 잠재적 잘 - 투 - 잘 변화, fluctuat을 고려하여 세중의 각 분석 준비여기 강도, 또는 온도의 이온. </li><li> 대물 상향 (예를 들어, 20X achroplan 0.45 NA) 분광계 및 InGaAs로 어레이를 이용한 방출 스펙트럼을 보면서. 대물 최적 위치 측정 강도의 최대 값과 일치해야 웰에서 샘플 볼륨의 중앙에 대략 초점 평면을 둘 것이다. </li><li> 각 샘플 웰의 경우, 스펙트럼을 수집 1-10의 노출을 기록한다. </li><li> 형광 반응을 정량화하기 위해 추가 분석 물없이 단지 단일 벽 탄소 나노 튜브를 함유하는 제어를 각 웰에 대한 발광 스펙트럼을 비교한다. </li></ol></li></ol>

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얻어진 SWNT 폴리머 하이브리드의 콜로이드 분산 물에 의해 제공되는 광학 밀도의 증가에 의해 표시된 바와 같이 단일 벽 탄소 나노 튜브는 용이 SDS 또는 ssDNA를 직접 초음파를 통해 수용액에 현탁된다. SDS와 ssDNA를이 분산 및 소수성 또는 파이 - 파이 상호 작용을 통해 단일 벽 탄소 나노 튜브 표면에 흡착하여 단일 벽 탄소 나노 튜브의 번들을 가용화. 또한, 이러한 게놈 DNA, 양친 성 중합체, 공액 중합체 및 지질과 같은 다른 중합체, 또는 SC SDS를 사용하여 현탁 시료 투석 벽 탄소 나노 튜브의 표면에 흡착 될 수있다. 예컨대 PEG와 같은 친수성 중합체, 블록 공중 합체의 표면 흡착을 가능하게하는 등의 RITC 또는 FITC 소수성 &quot;앵커&quot;와 최종 수정 될 수있다. 또는 SWNT하는 낮은 결합 친 화성을 가진 폴리머에 대한 프로브 팁 초음파의 높은 힘에 노출시 전단 또는 분해에 민감한 폴리머를 들어, 투석 안정적인 SWNT 폴리머 서스펜션을 생산하는 가장 좋은 방법입니다. 폴리머 e...

단층 카본 나노 튜브 (SWNT로)를 원자 적으로 탄소수 박층 고유 전자 및 광학 특성을 나타내는 길고 얇은 실린더로 압연된다. 1 이러한 특성은 지역 환경에 매우 민감 여기자 재조합을 통해 근적외선 (NIR) 형광 방출을 생산하는 밴드 갭을 포함한다. 단일 벽 탄소 나노 튜브의 근적외선 발광 광의 관통 깊이가 생체 조직에 대한 최대 인 근적외선 윈도우 내에. , SWNT 전시 큰 스톡스 이동 photobleach하지 않으며, 깜박하지 않습니다 : 2,3는 또한 단일 벽 탄소 나노 튜브는 유기 형광 달리 비정형 몇 가지 독특한 특징을 나타낸다. 4 최근, 이러한 특성을 활용하는 생물학에 응용 프로그램과 새로운 분자 센서의 구색의 개발을 주도하고있다. 5,6- 미 변성 그러나, 단일 벽 탄소 나노 튜브는 물에 불용성이며, 개별 단일 벽 탄소 나노 튜브의 현탁액을 얻는 것이 어려울 수있다. 7, 8 BundliNG 및 솔루션의 단일 벽 탄소 나노 튜브의 응집이 감지 애플리케이션에 적합을 렌더링 자신의 밴드 갭 형광, 2를 당황하게 할 수 있습니다. 수용액 중에서 개개의 탄소 나노 튜브를 분산하는 것은 소수성 구동 응집을 방지하기 위해 그 표면을 수정이 필요하다. 공유 변형의 SWNT를 수용성 10 렌더링뿐만 아니라 화학 특이 적 결합을 부여 할 수 있지만 9 SWNT 격자의 결함 부위를 감소 또는 형광 방출을 경감. 소수성 및 PI-PI 스태킹 상호 작용을 통해 나노 튜브 표면에 흡착 13 - 대신 SWNT 기능화 계면 활성제, 지질, 폴리머 및 9,11 DNA를 사용하여 달성 될 수있다. 표면 작용 화 된 단일 벽 탄소 나노 튜브를 둘러싼 얻어진 화학적 환경의 코로나 단계로 지칭된다. 코로나 위상 섭동은 불소 SWNT하는 변조를 일으키는 나노 튜브 표면 상에 여기자 이동에 큰 영향을 미칠 수있다방출을 escence. 이 코로나 위상 SWNT의 큰 표면적 상에 특이 적 결합 양상을 통합하여 새로운 분자 센서를 개발하는 데 이용 될 수 SWNT 형광 간의 중요한 관계이다. 분석 물을 결합시 SWNT 코로나 위상 섭동은 로컬 유전체 환경의 변화로 이어질 전하 전송 또는 신호 전달기구로 사용하기 위해 단일 벽 탄소 나노 튜브의 형광 방출을 조절할 수 모두의 격자 결함을 도입 할 수있다. (14)이 방법은 DNA 분자를 포함한 다양한 종류의 검출, 15, 16 17 글루코스 및 ATP와 같은 작은 분자에 대한 신규 한 형광 센서의 개발에 사용되는 18 반응성 산소 종 (19) 및 산화 질소. (20, 21) 그러나, 이러한 접근법들은 표적 피검위한 공지 결합 양상의 존재에 의존하는 것을 제한한다. 최근,보다 일반적인 응용 프로그램형광 센서를 설계에 바퀴벌레가 아닌 공유 양친 heteropolymers, 인지질 및 다핵 산으로 기능화 된 단일 벽 탄소 나노 튜브를 사용하여 개발되었다. 특히 단백질의 26, 27 또는 신경 전달 물질 도파민을 포함한 소형 분자를 결합 할 수있는 독특한 코로나 단계 25 - 이들 분자는 개별 단일 벽 탄소 나노 튜브 (22)의 매우 안정한 현탁액을 생성하기 위해 탄소 나노 튜브 표면에 흡착. 28-30 공학의 SWNT와 특이 적으로 결합 분석 대상 물질을 분산시키는 코로나 상으로서 코로나 위상 분자 인식 (CoPhMoRe)이라한다. (28) 작은 크기, 낮은 독성, 높은 안정성 및 CoPhMoRe SWNT 센서의 unbleaching 근적외선 형광 그들에게 오랜 시간 해결 측정을위한 생체 감지를위한 우수한 후보자를합니다. (6) 최근 연구 반응성 질소와 산소 종의 광학 검출을위한 식물 조직에서 응용 프로그램을 보여 주었다. (31)이러한 전기 화학적 검출 또는 면역 조직 화학 염색과 같은 다른 기술, 공간 해상도, 시간 해상도 및 특이성의 부족으로 고통 곳 CoPhMoRe SWNT 센서 특히 흥미로운 응용 프로그램은 생체 내에서 도파민과 같은 신경 전달 물질의 라벨없는 검출에 대한 가능성이다. 디자인 및 발견 CoPhMoRe SWNT 센서는 지금까지 특정 대상을위한 센서를 찾을 가능성을 제한 분산제 라이브러리의 크기, 화학적 다양성을 억제하고있다. 지금까지 연구에만 사용할 복합, 공동 블록, 생물학적, SWNT 센서에 대한 기능적 활성 분산제를 제공 할 수 생체 모방 고분자의 표면을 긁어있다. 여기, 우리는 모두 단일 벽 탄소 나노 튜브를 분산과 높은 처리량 검사 및 단일 SWNT 센서 분석을 위해 자신의 형광을 특성화하기위한 다른 방법을 제시한다. 구체적으로, 우리는 다핵 산 oligom와 코팅의 SWNT 절차 개요ERS 투석에 의해 계면 활성제 교환을 통해 양친 매성 고분자와 단일 벽 탄소 나노 튜브를 기능화하는 방법뿐만 아니라 직접 초음파를 사용하여. 우리는 예로서 로다 민 이소 티오 시아 네이트 (RITC-PEG-RITC)와 작용 (GT) 15 -DNA 및 폴리에틸렌 글리콜을 사용합니다. 우리는 도파민 검출 용 센서로서 CoPhMoRe (GT) 15 -DNA 벽 탄소 나노 튜브의 사용을 입증한다. 마지막으로, 특성 또는 단일 분자 검출에 사용할 수있는 단일 분자 센서 측정을 수행하는 과정을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>콜레이트나트륨 수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>C6445</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스(트리즈마 베이스)</td><td>시그마 알드리치</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>아민-PEG-아민, NH2-PEG-NH2</td><td>Nanocs Inc</td><td>PG2-AM-5k</td><td></td></tr><tr><td>로다민 B 이소티오시아네이</td><td>트 시그마 알드리치</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이</td><td>트 시그마 알드리치</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>디클로로메탄</td><td>시그마 알드리치</td><td>676853</td><td></td></tr><tr><td>디메틸포름아미드</td><td>시그마 알드리치</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>N,N-디이소프로필에틸아민</td><td>시그마 알드리치</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>디에틸 에테르</td><td>시그마 알드리치</td><td>673811</td><td></td></tr><tr><td>트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>C4706&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>5'-티올 변형 DNA&nbsp;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63187</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa 스핀 필터</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes</td><td>Integris</td><td>HiPco SuperPurified</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>정전기 방지 총</td><td>Milty</td><td>Milty Zerostat 3</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기</td><td>Cole Parmer</td><td>CV18</td><td></td></tr><tr><td>투석 카세트</td><td>Thermo scientific</td><td>Slide-A-Lyzer G2 87722</td><td></td></tr><tr><td>BSA-biotin</td><td>Thermo scientific</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin protein</td><td>Thermo scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td></td></tr><tr><td>kinematic mirrors</td><td>ThorLabs</td><td>KM200-E03</td><td></td></tr><tr><td>잠망경</td><td>ThorLabs</td><td>RS99</td><td></td></tr><tr><td>침수 오일</td><td>Zeiss</td><td>Immersol 518f</td><td></td></tr><tr><td>100X 대물렌즈</td><td>Zeiss</td><td>Plan-apochromat 100X 오일, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000</td><td></td></tr><tr><td>20X objective</td><td>Zeiss</td><td>N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>Healthrow Scientific</td><td>HS159879H</td><td></td></tr><tr><td>도파민 하이드로클로라이드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>적외선 2D 어레이 카메라</td><td>프린스턴 인스트루먼트</td><td>NIRvana</td><td></td></tr><tr><td>적외선 1D 센서 어레이</td><td>프린스턴 인스트루먼트</td><td>PyLoN IR</td><td></td></tr><tr><td>nIR 분광기</td><td>프린스턴 인스트루먼트</td><td>SCT-320</td><td></td></tr><tr><td>평면 볼록 렌즈</td><td>ThorLabs</td><td>LA1384</td><td></td></tr><tr><td>웰 플레이트 (유리 바닥)</td> <td>코닝</td><td>4580</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 벽 탄소 나노 튜브에 바이오 모방 고분자와 공학 분자 인식

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

반도체 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)는 근적외선에서 형광을 발하는 광학 활성 나노 물질의 한 종류로, 생물학적 샘플이 가장 투명한 광학 창과 일치합니다. 여기에서는 양친매성 폴리머와 폴리핵산을 SWNT 표면에 흡착하여 코로나 단계를 엔지니어링하고 소분자 및 단백질을 위한 새로운 분자 센서를 만드는 기술을 간략하게 설명합니다. 이러한 기능화된 SWNT 센서는 생체 적합성 및 안정성을 모두 갖추고 있습니다. 폴리머는 SWNT와 폴리머의 직접 초음파 처리 또는 계면 활성제를 사용하여 SWNT를 현탁 한 후 폴리머로 투석하여 나노 튜브 표면에 흡착됩니다. 표적 분석물에 대한 이러한 센서의 형광 방출, 안정성 및 반응은 흡광도 및 근적외선 형광 분광법을 사용하여 확인됩니다. 또한, 유리 슬라이드에 대한 센서의 표면 고정을 시연하여 단일 분자 형광 현미경 검사가 고분자 흡착 및 분석물 결합 역학을 특성화할 수 있도록 합니다.

단일 벽 탄소 나노 튜브는 계면 활성제 및 직접 초음파에 의해 투석 교환에 의한 양친 성 고분자를 모두 사용하는 수용액에 현탁시켰다. 도 1은 SC, RITC-PEF20-RITC를 사용하여 현탁 철 카르 보닐 촉매 법 (HiPCO)를 이용하여 성장하고, 단일 벽 탄소 나노 튜브를 도시한다 (GT) 15 -DNA. SDS (또는 폴리머)와 단일 벽 탄소 나노 튜브의 광학 밀도는 초음파 처리 후에 급격히 증가하고, 원심 분리로 정제를 통해 집계 및 오염물을 제거 (도 1)에 따라 감소한다. 현탁 SWNT의 농도를 정량 632 nm의 흡광도를 측정. (28) 단일 벽 탄소 나노 튜브 현탁액의 광 물리 특성은 흡수 및 형광 분광법을 사용하여 특징이다. 그...

우리는 양친매성 폴리머와 DNA를 사용하여 근적외선 형광 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)의 코로나 단계를 엔지니어링하여 알려진 인식 요소가 없는 분자 표적에 대한 센서를 개발하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

이 절차의 전반적인 목표는 생체 모방 폴리머를 사용하여 기능화된 분자 감지를 위한 근적외선 형광 단일벽 탄소 나노튜브를 준비하는 것입니다. 이러한 나노센서는 생체 조직에서 시간 분해 이미징을 가능하게 할 수 있습니다. 예를 들어, 뇌에서 도파민을 감지하는 데 사용할 수 있습니다.이 센서의 주요 장점은 고유한 근적외선 형광으로 조직 깊숙이 이미징할 수 있다는 것입니다. 합성 센서를 사용하면 자연적인 분자 인식 요소 없이 분자를 감지할 수 있으므로 이 일반적인 센서 개발 방법은 저분자 감지에 특히 유용합니다. SWNT의 핵산 현탁액을 준비하려면 먼저 0.1 몰 염화나트륨에 핵산을 100 밀리리터 당 100 밀리그램의 농도로 용해시킨다.흄 후드에서 정전기 방지 건을 사용하여 일회용 주걱, 미세 원심분리기 튜브 및 SWMT 스톡에서 정전기를 제거합니다. 다음으로, 20 마이크로 리터의 핵산 용액을 980 마이크로 리터의 0.1 몰 염화나트륨에 첨가합니다. 그런 다음 혼합물을 초음파 처리하기 전에 생성된 핵산 용액에 세척된 SWNTs 1mg을 첨가합니다.초음파 처리 중 프로브 팁을 배치하는 것은 매우 중요합니다. 거품이 발생하면 프로브 팁의 위치를 조정하고 amp위도를 낮추십시오. 또는 서스펜션이 불량한 상태로 유지되는 경우 초음파 처리 또는 목욕 초음파 처리를 시도할 수 있습니다.직경 3mm 팁의 초음파를 사용하여 얼음 수조에서 40% 진폭으로 10분 동안 용액을 초음파 처리합니다. DNA SWNT 용액을 16, 100 xg에서 90분 동안 두 번 원심분리합니다. 상층액을 수집하고 보관하되 탄소 나노튜브 다발과 응집체가 포함된 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.나노 물질에 적합한 기관 유해 폐기물 절차에 따라 펠릿을 폐기하십시오. UV-vis 분광 광도계를 사용하여 632나노미터에서 용액 흡광도를 측정하여 Lambert-Beer의 법칙에 따라 부유 SWNT의 대략적인 농도와 적절한 희석 계수를 측정합니다. 양친매성 폴리머 현탁액의 경우 먼저 일회용 주걱, 마이크로 원심분리기 튜브 및 SWNT 스톡에서 정전기를 제거합니다.흄 후드에서 5ml의 2% 나트륨 콜레이트 용액에 5mg의 SWNT를 추가합니다. 직경 6mm 팁의 초음파를 사용하여 얼음 수조에서 40% 진폭으로 1시간 동안 용액을 초음파 처리합니다. 150, 000 xg에 표본을 주의깊게 상층액을 모으기 전에 초원심분리기를 사용하여 4 시간, 원심 분리하십시오.다음으로, 양친매성 폴리머 1 중량을 scSWNT 용액에 용해시킨다. 그런 다음 3.5 킬로달톤 투석막을 사용하여 1리터의 탈이온수 또는 완충액에 대해 5일 동안 고분자 scSWNT 용액을 투석합니다. 2 시간과 4 시간에 물이나 버퍼를 교체하십시오.UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 632나노미터에서 용액 흡광도를 측정하여 부유 SWNT의 대략적인 농도를 측정합니다. BSA-비오틴 코팅 슬라이드를 준비하려면 현미경 슬라이드와 0.17mm 커버 유리를 탈이온수로 세척한 다음 메탄올, 아세톤을 세척하고 탈이온수를 마지막으로 헹굽니다. 깨끗한 현미경 슬라이드에 약 5mm 간격으로 여러 개의 양면 테이프를 배치하여 채널을 만듭니다.긴 유리 커버 슬립을 가져 와서 양면 테이프 상단에 눌러 채널을 밀봉합니다. 커버 슬립과 슬라이드의 가장자리가 같은 높이가 되지 않도록 현미경 슬라이드의 중앙에 놓으십시오. 다음으로, 100마이크로리터의 BSA-비오틴 원액을 900마이크로리터의 1x Tris 완충액에 첨가하여 최종 농도가 밀리리터당 1밀리그램이 되도록 합니다.50마이크로리터의 BSA-비오틴 용액을 한쪽 끝으로 피펫팅하고 조직을 사용하여 다른 쪽 끝에서 용액을 흡수하여 채널로 흐르게 합니다. 용액을 5분 동안 배양한 후 50마이크로리터의 0.1몰 염화나트륨으로 3-5회 세척을 수행합니다. 다음으로, 40 마이크로 리터의 5 밀리리터 NAV 원액을 960 마이크로 리터의 1x Tris 버퍼에 희석하여 최종 농도 0.2 밀리리터 당 밀리그램으로 만듭니다.용액을 한쪽 끝으로 피펫팅하고 조직을 사용하여 다른 쪽 끝에서 용액을 심지로 제거하여 50마이크로리터의 NAV 용액을 채널로 흐릅니다. 슬라이드를 2-5분 동안 배양한 후 50마이크로리터의 0.1몰 염화나트륨으로 3-5회 플러시를 수행합니다. 그런 다음 현탁 SWNT와 이미징 버퍼의 원액을 리터당 1-10밀리그램의 농도로 희석합니다.이 용액 50마이크로리터를 채널로 흘려 넣고 5분 동안 배양합니다. 50마이크로리터의 이미징 버퍼를 사용하여 과도한 SWNT를 부드럽게 헹굽니다. 도파민에 대한 GT15 DNA-SWNT의 가역 반응을 측정하려면 먼저 센서 코팅 채널을 형광 현미경 스테이지에 장착합니다.100X Oil Objective와 인듐 갈륨 비소 카메라를 사용하여 채널에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 인산염 완충 식염수에 50마이크로리터의 100마이크로몰 도파민 용액을 유동 채널에 추가하고 형광 강도의 변화를 기록합니다. 인산염 완충 식염수를 사용하여 도파민 용액을 세척하고 개별 SWNT 센서의 형광 변화를 관찰합니다.생체 모방 폴리머 SWNT의 분석물 반응에 대한 웰 플레이트 스크리닝을 수행하려면 동일한 부피의 부유 SWNT 센서를 각 웰에 피펫팅합니다. 우물 바닥을 균일하게 덮을 수 있을 만큼 충분한 부피를 사용하십시오. 그런 다음 스크리닝 라이브러리의 분석물을 웰 플레이트로 피펫팅합니다.각 분석물을 3회씩 준비하여 잠재적인 웰 변동과 여기 강도 또는 온도의 변동을 고려합니다. 분광계와 인듐 갈륨 비소 어레이를 사용하여 방출 스펙트럼을 모니터링하면서 목표를 높입니다. 대물렌즈의 최적 위치는 초점면을 대략 s의 중간에 놓을 것입니다.amp웰의 부피, 이는 측정된 강도의 최대값에 해당해야 합니다.각 샘플 웰에 대해 1-10초 노출을 기록하여 스펙트럼을 수집합니다. 각 웰의 방출 스펙트럼을 추가 분석물 없이 SWNT만 포함된 대조군과 비교하여 형광 반응을 정량화합니다. GT15 DNA 나노튜브 센서의 흡광도 스펙트럼은 서로 다른 키랄성의 잘 분산된 탄소 나노튜브에 해당하는 여러 피크를 보여줍니다.GT15 DNA 나노튜브 센서의 근적외선 형광을 보여줍니다. 흥미롭게도, 형광 강도는 도파민에 대한 반응으로 약 두 배가 됩니다. 이 그림에서 근적외선 형광 현미경은 유리 커버 슬립 표면에 고정된 단일 GT15 DNA 나노튜브 센서를 보여줍니다.앞으로는 예를 들어 분자 경쟁자를 포함하도록 분석물 라이브러리를 확장하고, 생물학적으로 관련된 농도 영역에서 반응의 선형성을 테스트하고, 가역성을 테스트하는 등 센서를 생체 내 사용을 위해 테스트하는 것이 중요합니다. 일단 숙달되면 이 접근 방식은 알려진 분자 인식 요소가 없는 분자에서 다양한 합성 센서 라이브러리를 만드는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

온 - 칩 photopolymerization 기술을 사용하여 폴리머 microarray의 형성에 대한 설명입니다. 원자 힘 현미경, 물 접촉 각도 측정, X-선 광전자 분광법 및 비행 차 이온 질량 분광법과 세포 부착 분석 시간을 사용하여 높은 처리량 표면 특성도 설명되어 있습니다.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

우리는 제조 장치 및 탄소 나노 튜브 기반의 고주파 바이오 센서를위한 측정 프로토콜을 설명합니다. 높은 주파수 감지 기술은 근본적인 이온 (의 Debye) 선별 효과를 완화하고 기존의 전자 바이오 센서가 실패 높은 이온 강도 솔루션을 운영 할 나노 튜브 바이오 센서 수 있습니다. 우리의 기술은 점의 배려 (POC) 생리학 관련 조건에서 작동하는 전자 바이오 센서의 고유 한 플랫폼을 제공합니다.

높은 이온 강도 솔루션에 감지하기위한 탄소 나노 튜브 고주파 나노 바이오 센서의 제작

우리는 나노 구조 기질과 고정화된 단백질 및 압타머와 인터페이스하는 나노 생물학적 시스템의 제조 및 특성화를 설명합니다. 나노 구조 기판의 리소그래피 제작, 생체 기능화 및 표면 강화 라만 분광법(SERS) 특성화와 관련된 관련 실험 단계가 보고됩니다. 표면 고정 단백질의 SERS 검출 및 단백질-리간드 및 압타머-리간드 결합의 프로빙이 입증되었습니다.

표면 EBL 날조 된 나노 구조 기판을 사용하여 생체 분자의 라만 분광학 감지 강화

구조 조정 가능한 고분자 캡슐화 층을 갖는 탄소 나노튜브의 기능화 및 소각 중성자 산란을 사용한 구조적 특성화 방법이 제시됩니다.

작은 각도 중성자 산란에 의한 열 가역적 블록 공중 합체 및 특성 단일 벽 탄소 나노 튜브의 기능화

핵산은 생물학적 시스템을 평가하기 위한 일반적인 분석물입니다. 그러나 효소 조작으로 인한 편향은 우려를 야기할 수 있습니다. 여기에서는 폴리아닐린을 사용하여 핵산을 표지 없이 검출하는 방법에 대해 설명합니다. 이 민감하고 비용 효율적인 센서 기술은 분자 간의 단일 뉴클레오티드 차이를 구별할 수 있습니다.

핵산 폴리아닐린 계 센서

여기, 우리가 준비하고 차 구조를 시각화하는 프로토콜을 제시한다 (예를 들면, 섬유, 도넛 형 아키텍처 및 나노 분야) 나선형 폴리 카 보디에서 유래. 두 원자 힘 현미경 (AFM) 및 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 특징 형태는 분자 구조, 농도, 및 원하는 용매에 의존하는 것으로 나타났다.

나선형 폴리 카 보디이 미드 공중 합체 및 이들의 트리아 졸 유도체로부터 획득 자기 조립 모폴로지

Semiflexible 폴리머 생명체가 광범위 하 게 적용 되는 독특한 기계적 속성을 표시 합니다. 그러나, biopolymers에 대 한 체계적인 연구는 폴리머 강성 같은 속성은 액세스할 수 없습니다 이후 제한 됩니다. 이 원고는이 제한 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브, 강성 필 라 멘 트의 영향에 대 한 실험 연구를 활성화 하 여 우회는 어떻게 설명 합니다.

Semiflexible 고분자 공부를 다양 한 도구로 DNA 나노튜브

프로시저를 연속 화학 수정을 사용 하 여 폴리스 티 렌 투입 multiwalled 탄소 나노튜브의 합성 단계를 선택적으로 sidewalls에 폴리머 체인 소개와 그들의 자기 조립을 통해 이방성 patchiness입니다 제시.

자기 집합에 있도록 폴리스 티 렌과 이방성 Patchiness Multiwalled 탄소 나노튜브를 접목

여기, 선물이 커패시턴스 바이오 센서와 함께에서 각 인 분자를 사용 하 여 복잡 한 솔루션에서 검색 및 낮은 풍부한 분자의 정량화에 대 한 프로토콜.

분자 각 인을 사용 하 여 생체의 磁 검출 용량 성 바이오 센서 기반

이 연구에서는 특정 세포 표적화를 위한 항체로 자성 나노물질을 생체 기능화하는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 암세포를 표적으로 삼기 위해 철 나노 와이어를 사용합니다.

자성 나노 물질의 생체 기능화

DNAzyme 기반 나노머신은 핵산의 매우 선택적이고 민감한 검출에 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 무료 소프트웨어를 사용하여 10-23 코어를 가진 DNAzyme 기반 나노머신을 설계하기 위한 자세한 프로토콜과 Epstein-Barr 바이러스 단편 검출에 대한 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

학습하세요 단일벽 탄소나노튜브에 바이오모방 고분자를 이용한 분자 센서 개발 방법을. 근적외선 형광을 활용해 살아있는 조직에서 도파민 같은 소분자를 실시간 검출할 수 있습니다.

단일 벽 탄소 나노 튜브에 바이오 모방 고분자와 공학 분자 인식

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