Name: 무 혈청의 수집 및 공급 장치없이 마우스 배아는 세포 자유로운 접근을위한 세포 조절 중간 줄기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 배우세요 마우스 배아줄기세포 조건배양액을 무혈청 및 피더세포 없이 수집하는 방법을. 노화 관련 질환 치료를 위한 세포 없는 치료 접근법 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 기초 과학 연구 프로그램 (2013R1A1A2060930) 및 의료 연구 센터 프로그램 (2015R1A5A2009124) 한국 연구 재단을 통해 (NRF), 과학, ICT의 교육부에 의해 투자 및 미래 계획에 의해 지원되었다. 이 연구는 또한 병원 아픈 어린이를위한 (HK) 성에서 시작해서 운영 그랜트에 의해 지원됩니다. 우리는 G4 MESC 라인을 제공하기 위해이 원고 박사 안드라스 나기 편집에서 우수한 도움 로라 Barwell 사라 JS 김에게 감사의 말씀을 전합니다.

주 : 무 혈청 피더없는 CM 컬렉션 프로토콜의 개략도는도 1에 도시되어있다. 1. 재료 (MEFs에의 준비, 중간, 플레이트 및 솔루션) <ol><li> 문화 MEFs에 중간의 500 ml의를 준비합니다. 10 % FBS (ESC 품질), 50 단위 / ㎖ 페니실린, 50 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 둘 베코의 변형 이글의 중간 (DMEM)을 보충합니다. </li><li> 설립 루틴 프로토콜 (13) 다음 배아에서 MEFs에 격리와 MEF 매체를 유지한다. </li><li> 문화에 mESCs를 배지 500 ml의를 준비합니다. DMEM은 15 % FBS와 2 mM L- 글루타민, 100 μM 비 필수 아미노산 (NEAA), 100 μM의 β 머 캅토 에탄올, 100 유닛 / ㎖ 백혈병 억제 인자 (LIF), 50 단위 / ㎖ 페니실린, 50로 보충 ㎎을 / ㎖ 스트렙토 마이신. </li><li> 0.1 % 젤라틴 용액 5 ㎖의 10cm 세포 배양 접시를 도포하여 젤라틴 화 플레이트 (5 젤라틴 화 플레이트 / MESC 1 판)을 준비한다. 적어도 10 분 동안 인큐베이션<html> 실온에서 첨가 하였다. </li><li> mESCs의 무 혈청 조건을 감소 세럼 중간의 500 ml의를 준비합니다. 중탄산 나트륨 1.2 g (PH 7.0) 혈청 미디어 감소 보완. 0.2 μm의 병 톱 필터를 통해 필터링합니다. </li><li> 노화 관련 β - 갈 락토시다 아제 (SA β-GAL) 노화 세포의 검출을위한 염색 액 조제 1 ㎎ / ㎖ X-GAL를 40 mM의 시트르산 / 소듐 포스페이트 완충액 (pH 6.0) (디메틸 포름 아미드, DMF에 용해) 5 mM의 페리 시안화 칼륨, 5mM의 칼륨 페로시 아나이드, 150 mM의 염화나트륨, 2 밀리미터의 MgCl 2 (14). 주의 : (유해) DMF는 독성과 부식성 솔루션입니다. 솔루션을 처리 할 때 개인 보호 복 (예를 들어, 니트릴 또는 라텍스 장갑, 실험실 코트, 고글)을 착용 할 것. 흄 후드를 사용합니다. </li><li> 문화 인간 피부 섬유 아세포 (HDFS, NHDF - 광고 - 데르 - 섬유 아세포)에 배지 500 ml의를 준비합니다. 10 % FBS, 100 단위 / ml의 페니실린 및 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신과 DMEM을 보충합니다. </li></ol>마우스 배아 줄기 세포의 jove_title &quot;&gt; 2. 문화 (그림 1A 및 2A) 참고 : 세포 배양 생물 안전 후드의 모든 단계를 수행합니다. <ol><li> 15cm 세포 배양 접시에 마이 토마 이신 C의 10 ㎍ / ml를 함유 MEF 배지 20 mL로 MEFs에 치료. 37 ° C에서 2 시간 5 % CO 2 품어. </li><li> MEFs에에서 매체를 기음. PBS로 3 회 세포를 씻으십시오. 트립신 EDTA (TE, 1 배)의 3 ML을 추가하고 37 ° C에서 3 분 5 % CO 2 품어. 3 분 후, 300 x g에서 3 분 동안 원심 분리 MEF 매체 6 mL로 중화 TE. </li><li> MEF 배지 5ml에 재현 탁. 트리 판 블루 염색법과 혈구를 사용하여 생성 된 세포 현탁액 중의 세포 수를 결정한다. MEF 배지에서 10 cm 세포 배양 접시 당 2 × 106 세포의 밀도로 불 활성화 된 MEFs 플레이트 (공급). 37 ° C에서 24 시간 5 % CO 2 품어. </li><li> 온 (피더 도금 후 MESC 매체와 MEF 매체 24 시간 교체다음날). </li><li> MESC 매체와 피더에 2 × 106 세포의 밀도로 플레이트 mESCs (G4 F1 하이브리드 ES 세포). 37 ° C에서 48 시간 5 % CO 2 품어. 참고 MESC-CM의 노화 방지 효과가 하부 통로 번호 mESCs는 15-17 사용될 때 예상 강하다. 우리는 Lunenfeld - 타넨 바움 연구소, 마운트 시나이 병원, 25 Orde 거리, 토론토, ON, M5T 3H7, 캐나다에서 박사 안드라스 나기에서 G4 MESC 라인을 인수했다. </li><li> 70-80% 서브 합류 상태에서 상대적으로 높은 밀도 및 통로에서 세포를 유지합니다. 매일 신선한 MESC 매체와 매체를 교체합니다. </li></ol> 3. 무 혈청의 수집 및 피더없는 조건 중간 (그림 1B 및 2B) 참고 : 세포 배양 생물 안전 후드의 모든 단계를 수행합니다. <ol><li> PBS 5 ㎖로 MESC 판을 씻어. TE (2.5 배)의 1 ML을 추가하고 37 ° C에서 3 분 5 % CO 2 품어. 3 분 후, MESC의 mediu 2 ㎖로 TE를 중화m 및 300 X g에서 3 분간 원심 분리기. </li><li> MESC 매체의 각 젤라틴 코팅 된 배양 접시 (젤라틴 화 플레이트 5 / 1 MESC 판)에 MESC 매체 판 1ml를 5ml에 재현 탁. 37 ° C에서 문화와 5 % CO 2 80 ~ 85까지 %의 포화 상태에 도달한다. </li><li> 세 세척의 총, 세척 당 10 분 동안 세포 (10cm 접시 당 8 ml)에 충당하기 위해 충분한 PBS로 mESCs을 씻으십시오. 37 ° C에서 24 시간 5 % CO 2 절감 세럼 중간에 품어. 주 : 세정 공정은 FBS 오염을 방지하는 것이 중요하다. 이 배양 시간 (18, 19)를 수행하는 것이 중요합니다. </li><li> 2,500 × g으로 20 분 동안 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 MESC-CM를 수집합니다. 원심 분리 후 상등액 (CM)를 수집한다. 0.2 μm의 병 톱 필터를 통해 필터링합니다. </li></ol> 마우스 배아 4. 효과 줄기 세포 에어컨 중간 (MESC-CM) 참고 : MESC-CM의 효과는 다음과 같은 몇 가지 방법에 의해 확인되었다SA β-gal을 분석, 세포주기 분석, QRT-PCR. <ol><li> SA의 β-gal을 분석 (그림 3A) <ol><li> HDF 매체 6- 웰 플레이트에 웰당 2 × 104 세포의 밀도로 시드 HDFS. 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하고, 5 % CO 2. </li><li> 밤새 배양 한 후,를 폐기 HDF 매체의 절반은 MESC-CM 및 제어 매체를 추가 할 수 있습니다. 37 ° C에서 72 시간 5 % CO 2 품어. 제어 매체 mESCs의 부재 젤라틴 코팅 접시 (세럼 미디어 감소) 무 혈청 배지로부터 유도된다. </li><li> 두 세척 총 워시 30 초 동안 세포 (6- 웰 플레이트에 2 ㎖) 덮을 PBS로 세포를 세척 하였다. 고정을 위해 3.7 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션. 주의 : (유해) 파라 포름 알데히드는 독성과 부식성 솔루션입니다. 솔루션을 처리 할 때 개인 보호 복 (예를 들어, 니트릴 또는 라텍스 장갑, 실험실 코트, 고글)을 착용 할 것.흄 후드를 사용합니다. </li><li> 고정 용액 대기음. 단계 4.1.3에 설명 된대로 두 번 PBS와 고정 된 세포를 씻으십시오. </li><li> (1-2 ml의 당 잘 6 잘 플레이트)에 SA β-여자 염색 솔루션을 추가합니다. 37 ° C에서 17.5 시간 동안 품어. 주 :이 CO 2 배양기에서 배양 될 수 없습니다. </li><li> 동방 β-여자 염색 솔루션을 대기음 단계 4.1.3에 설명 된대로 두 번 PBS로 세포를 씻어. </li><li> 반 염색에 대한 에오신 솔루션을 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션. 단계 4.1.3에 설명 된대로 두 번 PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 후속 분석을 위해 부착 된 디지털 카메라를 사용하여 광학 현미경 캡처 이미지를 사용하여 100 배의 배율에서 이미지 셀. 주 : 세포의 갯수가 블라인드 방식으로 계산 될 수 있고, SA의 β - 갈 양성 푸른 세포의 비율이 계산 될 수있다. </li></ol></li><li> 세포주기 분석 (그림 3B) <ol><li> 의 밀도에 씨앗 HDFSHDF 매체에서 6cm 세포 배양 접시에 웰 당 8 × 104 세포. 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하고, 5 % CO 2. </li><li> 밤새 배양 한 후,를 폐기 HDF 매체의 절반은 MESC-CM 및 제어 매체를 추가 할 수 있습니다. 37 ° C에서 24 시간 5 % CO 2 품어. </li><li> 300 x g에서 5 분 동안 3.1 설명한 공정 및 원심 분리와 같이 세포를 Trypsinize. 차가운 PBS 용액으로 세포를 씻으 2,500 X g에서 3 분 동안 두 번 원심 분리기 (PBS 0.5 mM의 염화칼슘 2와 2 % FBS, 1.5 ML 튜브 당 1 ml를 포함). 차가운 PBS 용액 100 ㎕에 재현 탁. </li><li> 텍싱 동안 차가운 에탄올 200 μl를 놓는 방법으로 세포를 고정합니다. 적어도 1 시간 동안 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 단계 4.2.3에서 설명 된 바와 같이, 회 냉 PBS 용액으로 세포를 세척 하였다. </li><li> 를 50㎍ / ㎖의 RNase를 함유하는 구연산 나트륨 완충액 250 μL (1.12 %, pH가 8.5)에 세포를 재현 탁. 37 ° C에서 30 분 동안 품어. </li><li> 구연산 나트륨 250 μl를 추가버퍼는 50 μg의 / ㎖ 프로피 디움 요오드를 포함. 실온에서 20 분 동안 인큐베이션. </li><li> 20 유세포 분석을 이용하여 각각의 샘플에서 10,000 세포를 측정한다. </li></ol></li><li> QRT-PCR (그림 3C) <ol><li> 단계 4.1.1과 4.1.2에 설명 된대로 씨 HDFS하고, MESC-CM을 추가합니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따른 RNA 추출 키트를 사용하여 전체 RNA로부터 HDFS 격리. 분광 광도계 (21)를 사용하여 추출 된 총 RNA를 정량화. </li><li> 제조자의 프로토콜 (20)에있어서, 올리고 (DT)과 프라이머 M-MLV 역전사 효소를 함유하는 반응 액 20 μL에 총 RNA 1 μg의 추가하여 cDNA를 합성. </li><li> 녹색 PCR 마스터 믹스 및 유전자 특이 프라이머 (부록 표 1)을 사용하여, 실시간 PCR 시스템과의 cDNA의 증폭을 측정한다. GAPDH 식 데이터를 정상화. 다음 PCR 프로토콜을 사용하여 초기 드95 ° C에서 10 분 동안 naturation; 95 ° C에서 15 초 45주기, 55 ° C에서 20 초, 72 ° C에서 35 초; 95 ° C, 60 ℃에서 1 분, 95 ° C에서 30 초, 60 ° C에서 15 5 초에서 15 초 동안 용융 곡선 스테이지. </li></ol></li></ol>

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무 혈청 피더없는 MESC-CM의 성공적인 회수를 들어, 다음 방법이 고려되어야한다. 가장 중요한 요인은 MESC-CM의 컬렉션에 대한 초기 통로 mESCs를 사용합니다. 이전에는 초기 통로 MESC-CM 늦게 통과 mESCs에 비해 더 나은 안티 에이징 효과를 가지고 있음을 보였다. mESCs의 통과 수는 그들의 발달 잠재력 (16) 및 다 능성 (17)에 영향을 미치는 것으로보고되었다. 추가적인 연구가 항 노화 효과를 유도 MESC의 secretome의 특정 요소를 분석 할 필요가 있지만, 현재는 MESC-CM은 세포 수준에서 노화를 감소 충분하다고 결론 지을 수있다. 젊은 세포로 다시 노화 세포를 되돌릴 MESC 별 분비 요인의 식별은 미래 연구에 중요하다. 고품질은 항체 어레이 (15)를로 분비 분자에 대해 분석D secretome 분석은 매체 수집 프로세스 ...

이 프로토콜의 목표는 무 혈청 및 공급 장치가없는 배양 조건에서 마우스를 배아 줄기 세포 (MESC) -conditioned 매체 (MESC-CM)를 수집하고 그 생물학적 기능을 특성화하는 것입니다. 일반적으로 배아 줄기 세포 (는 ESC가)에 의한 자기 갱신 1-3에 대한 자신의 다 능성 및 용량에 재생 의학 및 세포 치료에 대한 큰 잠재력을 가지고있다. 그러나 줄기 세포의 직접적인 이식에는 면역 거부 및 종양 형성 4,5- 등 여러 한계를 가지고있다. 따라서, 무 세포 방법은 재생 의료 노화 개입 -6,7- 대한 다른 치료 전략을 제공 할 수있다. 노화는 성장 체포, 변형 된 세포 생리학과 행동의 영구적 인 상태에 의해 특징 조직과 장기의 노화에 휴대 대응으로 볼 수 있습니다. 암을 포함한 널리 질환, 심혈관 질환, t의 주요 위험 인자는 노화2 형 당뇨병을 YPE 및 신경 퇴행 8. 노화의 명백한 특성 중 하나는 줄기 세포 노화 및 배기 (9)에 의해 발생 조직의 재생 가능성의 감소이다. 많은 중요한 연구들은 일관 노화를 지연시키고 수명을 연장 할 수있는 능력을 가지고 라파 9 레스베라트롤 10 및 메트포르민 (11)과 혈액 유래 조직 인자, 즉 12 GDF11 같은 약물 분자를 보여 주었다. 본 연구에서는 MESC-CM은 혈청 요소 및 MEFs에에서 분비 인자의 오염을 제외 혈청없이 (소 태아 혈청, FBS) 및 공급 장치 (마우스 배아 섬유 아세포, MEFs에) 레이어를 수확하고있다. 결과적으로 MESC 별 분비 요인의 정확한 식별을 사용하도록 설정된 무 혈청 및 공급 장치가없는 CM 허용 이러한 조건. 이 제안 된 프로토콜은 상대적으로 매우 효율적인 비용 대비 효과, 쉽게한다작동합니다. 이 기술은 노화 관련 질환 등의 재생에 대한 개입을 향해 안전하고 잠재적으로 유리한 무 세포 치료 방법의 개발에 사용될 수있는 항 노화 효과를 매개 할 수 MESC 유래 가용성 요소의 특성화에 대한 통찰력을 제공한다 트리트먼트.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11960-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#30044333</td><td>20%, ES 세포 품질</td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>#15140</td><td>50 단위/ml 페니실린 및 50&nbsp; mg/ml 스트렙토마이신</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>인비트로겐</td><td>#25030</td><td>2&nbsp; mM</td></tr><tr><td>비필수 아미노산 (NEAA)</td><td>Invitrogen</td><td>#11140</td><td>100&nbsp; &마이크로; M</td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>시그마</td><td>#M3148</td><td>100&nbsp; &마이크로; M</td></tr><tr><td>백혈병 억제 인자&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#ESG1107</td><td>100 단위/ml</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>#22600</td><td></td></tr><tr><td>X-gal&nbsp;</td><td>시그마</td><td>#B4252</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>시그마</td><td>P6148</td><td>3.70%</td></tr><tr><td>디메틸포름아미드(DMF)</td><td>시그마</td><td>#D4551</td><td></td></tr><tr><td>페리시아화칼</td>륨 <td>알드리치</td><td>#455946</td><td>5mM</td></tr><tr><td>페로시안화칼</td>륨 <td>알드리치</td><td>#455989</td><td>5mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>#S7653</td><td>150mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>#M2393</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>미토마이신 C</td><td>시그마</td><td>#M4287</td><td>10&nbsp; &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물&nbsp;</td><td>시그마</td><td>#P4170</td><td>50&nbsp; &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>#15596018</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV 역전사체-tase</td><td>Promega</td><td>#M170B</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR 마스터 믹스&nbsp;</td><td>응용 바이오시스템</td><td>#4367659</td><td></td></tr><tr><td>HDFs, NHDF-Ad-der-Fibroblast&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>#CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>병 상단 필터</td><td>Corning</td><td>#430513</td><td>0.2 &mu; 중</td></tr></tbody></table>

무 혈청의 수집 및 공급 장치없이 마우스 배아는 세포 자유로운 접근을위한 세포 조절 중간 줄기

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

배아줄기세포(ESC)와 유도만능줄기세포(iPSC)가 다양한 세포 유형을 생성할 수 있는 능력은 재생 의학 분야에서 새로운 길을 열었습니다. 그러나 이러한 이점에도 불구하고 배아줄기세포세포와 iPSC의 종양형성 잠재력은 오랫동안 임상 적용의 장벽이 되어 왔습니다. 흥미롭게도, 배아줄기세포는 조직 재생을 촉진하고 세포 노화를 지연시킬 수 있는 몇 가지 용해성 인자를 생성하는 것으로 나타났으며, 이는 배아줄기세포와 iPSC도 무세포 중재 방법으로 활용될 수 있음을 시사합니다. 따라서 혈청 성분(소 태아 혈청, FBS) 및 공급세포(마우스 배아 섬유아세포, MEF)의 오염을 최소화하면서 마우스 배아 줄기 세포(mESC) 조절 배지(mESC-CM)를 수확하는 방법에 대한 요구가 높아지고 있습니다. 본 연구는 혈청 및 피더가 없는 조건에서 mESC-CM을 수집하고 노화 관련 다중 판독을 사용하여 mESC-CM을 특성화하기 위한 최적화된 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 혈청 및 피더 오염 없이 순수한 mESC 특이적 분비 인자를 수집하는 방법을 제공합니다.

원래 mESCs는 FBS 및 기타 영양 보충제 (도 1A 및 2A)와 MESC 매체에서 MEF 공급 장치에 유지됩니다. CM은 피더 층, FBS, 기타 영양 보충제 (도 1B 및 2B)없이 감소 세럼 미디어에서 mESCs에서 수집 하였다. 이 배양 조건은 우리가 공급, FBS, 또는 다른 보조 식품의 요인에 의해 잠재적 인 오염없이 에어컨 매체 MESC 별을 수집 할 수 있습니다. 제어 매체 mESCs없이, 동일한 배양 조건 하에서 수집 하였다. ⅰ) 정상 MESC의 배양 조건 (그림 2A) 및 ⅱ) 무 혈청 및 공급 장치가없는 배양 조건 (그림 2B) : mESCs는 서로 다른 ...

이 프로토콜은 혈청에서 파생 마우스 배아 줄기 세포의 수집 (MESC) -conditioned 매체 (MESC-CM)하는 방법을 제공한다 (소 태아 혈청, FBS) - 및 공급 장치 (마우스 배아 섬유 아세포, MEFs에) 셀에 대한 - 무료 조건 - 무료 방법. 이는 노화 및 노화 관련 질환의 치료에 적용될 수있다.

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 혈청 및 공급자가 없는 배양 조건에서 마우스 배아 줄기 세포에서 조건화된 배지를 수집하고 이 배지의 생물학적 기능을 특성화하는 것입니다. 이 절차는 노화 관련 질병에 대한 안전하고 세포가 없는 치료 접근법의 개발을 위해 마우스 배아 줄기 세포에서 분비되는 가용성 인자의 노화 방지 활성에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구교수인 배윤기 박사입니다.생물학적 안전 후드에서 15cm 세포 배양 접시에 미토마이신 C가 보충된 20ml의 MEF 배지로 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF 세포 배양을 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 2시간 동안 처리합니다. 배양이 끝나면 PBS로 세포를 세 번 세척하고 섭씨 37도에서 3분 동안 3ml의 트립신 EDTA로 세포를 분리합니다. 세포가 플레이트 바닥에서 들어 올려졌을 때 6ml의 신선한 MEF 배지로 트립신을 중화합니다.원심분리로 세포를 채취한 후, 펠릿을 5ml의 MEF 배지에 다시 현탁시키고 신선한 MEF 배지에서 10cm 배양 접시당 6번째 불활성화 MEF를 10-6회 2회 플레이트화합니다. 24시간 동안 피더 세포를 배양합니다. 그런 다음 MEF 배지를 마우스 배아 줄기 세포 배지로 교체하고 최소 48시간의 공동 배양 동안 10번째에서 6번째 마우스 배아 줄기 세포를 사료에 2회 파종합니다.생물학적 안전 후드에서 마우스 배아 줄기 세포 플레이트를 5ml의 PBS로 헹구고 방금 시연한 것처럼 트립신과 EDTA로 세포를 분리합니다. 원심분리로 세포를 채취한 후, 줄기세포 펠릿을 5ml의 신선한 줄기세포 배지에 다시 현탁시키고 신선한 배아 줄기세포 배지에 담긴 접시당 1ml의 세포를 젤라틴으로 코팅된 세포 배양 접시 5개에 플레이트합니다. 배양액이 80-85% 농도에 도달할 때까지 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.그런 다음 플레이트당 최소 8ml의 PBS로 세포를 헹구어 10분 동안 3회 세척한 다음 환원된 혈청 배지에서 24시간 배양합니다. 24시간 이내에 원심분리를 위해 상등액을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 0.2 마이크로 미터 병 상단 여과기를 통해 여과합니다.노화 관련 베타 갈락토시다아제 분석에 의해 배아 줄기 세포 조건화 배지의 효과를 테스트하기 위해, 인간 피부 섬유아세포 배지의 6웰 플레이트에 인간 진피 섬유아세포를 파종합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 하룻밤 배양 후 배지의 절반을 신선한 마우스 배아 줄기 세포 조절 배지로 교체하여 또 다른 72시간 배양을 합니다. 배양 3일째에 웰당 2ml의 PBS로 세포를 헹구어 30초 동안 두 번 세척합니다.그런 다음 3.7% 파라포름알데히드에 세포를 실온에서 5분 동안 흄 후드에 고정합니다. 고정 후 방금 시연한 것처럼 2밀리리터의 PBS로 세포를 두 번 세척하고 이산화탄소 없이 섭씨 37도에서 17시간 30분 동안 1-2밀리리터의 SA 베타 갈 용액으로 세포에 라벨을 붙입니다. 염색 기간이 끝나면 방금 설명한 것처럼 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.그런 다음 실온에서 5분 동안 에오센으로 염색을 방지합니다. PBS를 한 번 더 세척한 후 광학 현미경으로 100배 배율로 세포를 이미지화합니다. 세포주기 분석을 위해 신선한 인간 피부 섬유아세포 배지의 6cm 세포 배양 접시에 웰당 10배에서 4번째 인간 진피 섬유아세포를 8번 파종하여 섭씨 37도에서 5%이산화탄소에서 하룻밤 배양합니다.다음 날 아침, 배지의 절반을 마우스 배아 줄기 세포 조건의 배지로 교체하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 24시간 후, 트립신 EDTA 해리로 세포를 수확한 후 1밀리리터의 PBS 용액을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 100마이크로리터의 차가운 PBS 용액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.그런 다음 와류를 일으키는 동안 200 마이크로 리터의 차가운 에탄올에서 드롭 와이즈 적용으로 세포를 고정합니다. 세포를 섭씨 4도에서 최소 한 시간 동안 보관하십시오. 그런 다음 새 PBS 용액으로 씻으십시오.두 번째 원심분리 후, 이산화탄소 없이 섭씨 37도에서 30분 동안 RNase가 보충된 250마이크로리터의 구연산나트륨 완충액으로 펠릿을 처리합니다. 배양이 끝나면 20분 동안 프로피듐 요오드화물이 함유된 250마이크로리터의 구연산나트륨 완충액으로 세포에 라벨을 부착합니다. 그런 다음 유세포 분석으로 각 샘플의 세포 주기 단계를 평가합니다.정량적 역전사효소 PCR 분석의 경우, RNA 추출 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 마우스 배아 줄기 세포 컨디셔닝 배지 처리된 인간 피부 섬유아세포에서 전체 RNA를 분리합니다. 분광 광도계를 사용하여 추출된 총 RNA를 정량화합니다. 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 올리고 데옥시티미딘 프라이머와 M-MLV 역전사효소를 포함하는 반응 혼합물을 공식화합니다.그런 다음 총 RNA 1마이크로그램을 반응 혼합물이 포함된 PCR 튜브에 추가합니다. 마지막으로, green PCR 마스터 믹스와 적절한 유전자 프라이머를 사용하여 real time PCR 기계로 cDNA의 증폭을 측정합니다. MEF 공급세포층에서 정상적인 마우스 배아 줄기세포 배양 조건에서 성장한 마우스 배아 줄기세포는 타원형과 광택 모양을 나타냅니다.혈청 및 무급유 배양 조건에서 성장한 마우스 배아 줄기세포는 편평하고 불규칙한 형태를 보여줍니다. 노화 인간 피부 섬유아세포를 마우스 배아 줄기 세포 조건화 배지로 처리하면 노화 관련 베타갈락토시다아제 양성 세포의 수가 감소합니다. 또한, 이러한 세포의 세포주기 분석은 마우스 배아 줄기 세포 조건화 배지 처리가 G0/G1 단계의 세포 수를 감소시키는 동시에 S 및 G2/M 단계의 세포 수를 극적으로 증가시키는 것으로 나타났습니다.또한, 마우스 배아 줄기 세포 조건화 배지 처리는 노화 관련 유전자 및 노화 표현형과 관련된 비서 사이토카인의 발현을 감소시킵니다. 이 절차를 시도하는 동안, 긴 배양은 세포 자가분해 또는 기아에 의한 세포사멸의 가능성을 증가시키기 때문에 24시간 후에 혈청과 피더 프리 배지를 수집하는 것을 기억하는 것이 매우 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 무세포 접근법을 위해 혈청 및 공급이 없는 마우스 배아 줄기세포 조절 배지를 수집하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.파라포름알데히드와 같은 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 이 시약을 흄 후드에서 취급하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

collection-serum-feeder-free-mouse-embryonic-stem-cell-conditioned

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

마우스 배아의 섬유아 세포 (MEFs)의 품질 등 CF-1과 같은 마우스의 오른쪽 변형에 의해 결정됩니다. 이들로부터 얻은 Pluripotency - 지원 MEFs 및 에어컨 매체 (CM) 공동 operatively 자기 갱신과 pluripotency를 유지에 Activin / 결절 및 FGF 경로에 필요한 Activin, 괴물과 Tgfβ1의 최적 농도를 포함해야합니다.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

이 비디오는 마우스 배아 줄기 세포에서 피질 중간뉴런 전구체를 생성하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 줄기세포의 증식 및 배아체(EB)로의 응집을 촉진하는 특정 소분자 억제제를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 수반합니다. 그 후, EB는 효소와 해리되고 접착 단백질로 코팅된 배양 플레이트 웰에 도금되어 피질 중간뉴런 전구체로의 분화를 촉진합니다.

Generating Cortical Interneuron Precursors from Mouse Embryonic Stem Cells(마우스 배아 줄기세포에서 피질 중간뉴런 전구체 생성)

이 동영상은 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 신경전구세포(NPC)를 체외에서 생성하는 방법을 보여줍니다. mESC는 현탁액에서 배양되어 배아체(EB)를 형성한 다음, 부착 배양에서 레티노산 처리를 통해 NPC로 분화하도록 유도됩니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 기술

배아 배양에 활용 혈청 특히 신호의 상호 작용을 포함하는 연구 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 알 수없는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 혈청 산소 배양 시스템을 활용하고 16-40 시간 동안 배양 한 중간 회임 마우스 배아가 자궁에서 개발 태아에 비해 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.

무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발

마우스 배아 줄기 세포는 OP9-DL1 공동 배양 시스템을 사용하여 in vitro에서 T 세포로 분화할 수 있습니다. 이 절차를 성공적으로 수행하려면 시약/세포 유지 관리 및 주요 기술에 민감한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 여기에서는 이러한 중요한 매개변수에 대해 논의하고 이 기술의 채택을 장려하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

T 세포의 유도 체외 마우스 배아 줄기 세포에서

이 프로토콜은 무혈청 단층 방법을 사용하여 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 전구 세포는 성숙한 신경 세포 유형을 유도하거나 신경 사양 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 복합 스크리닝을 위한 멀티웰 형식 확장에 적합합니다.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

단백질은 종종 다른 세포 기능을 발휘할 수있는 여러 도메인을 포함한다. 유전자 녹아웃 (KO)이 기능의 다양성을 고려하지 않는다. 여기, 우리는 다양한 기능 영역 또는 단백질의 변이의 분자 해부를 허용 KO 배아 줄기 세포에서 재조합 중재 카세트 교환 (RMCE) 기반 구조 - 기능 접근 방식을보고합니다.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

이 문서는 효율적으로 파생 하 고 만능 마우스 배아 줄기 세포 라인 blastocyst 단계에서 문화 프로토콜을 설명 합니다.

마우스 Preimplantation 배아에서 줄기 세포 라인의

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

여기, 우리는 칩 Seq를 수행 하는 방법을 설명 및 CARIP-Seq, 다음-세대 시퀀싱, 라이브러리 준비 등 글로벌 epigenomic 및 chromatin 관련 RNA 생성 하 ES 세포에 지도.

CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법

배우세요 마우스 배아줄기세포 조건배양액을 무혈청 및 피더세포 없이 수집하는 방법을. 노화 관련 질환 치료를 위한 세포 없는 치료 접근법 개발에 활용할 수 있습니다.

무 혈청의 수집 및 공급 장치없이 마우스 배아는 세포 자유로운 접근을위한 세포 조절 중간 줄기

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