무 혈청의 수집 및 공급 장치없이 마우스 배아는 세포 자유로운 접근을위한 세포 조절 중간 줄기

이 프로토콜의 전반적인 목표는 혈청 및 공급자가 없는 배양 조건에서 마우스 배아 줄기 세포에서 조건화된 배지를 수집하고 이 배지의 생물학적 기능을 특성화하는 것입니다. 이 절차는 노화 관련 질병에 대한 안전하고 세포가 없는 치료 접근법의 개발을 위해 마우스 배아 줄기 세포에서 분비되는 가용성 인자의 노화 방지 활성에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구교수인 배윤기 박사입니다.

생물학적 안전 후드에서 15cm 세포 배양 접시에 미토마이신 C가 보충된 20ml의 MEF 배지로 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF 세포 배양을 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 2시간 동안 처리합니다. 배양이 끝나면 PBS로 세포를 세 번 세척하고 섭씨 37도에서 3분 동안 3ml의 트립신 EDTA로 세포를 분리합니다. 세포가 플레이트 바닥에서 들어 올려졌을 때 6ml의 신선한 MEF 배지로 트립신을 중화합니다.

원심분리로 세포를 채취한 후, 펠릿을 5ml의 MEF 배지에 다시 현탁시키고 신선한 MEF 배지에서 10cm 배양 접시당 6번째 불활성화 MEF를 10-6회 2회 플레이트화합니다. 24시간 동안 피더 세포를 배양합니다. 그런 다음 MEF 배지를 마우스 배아 줄기 세포 배지로 교체하고 최소 48시간의 공동 배양 동안 10번째에서 6번째 마우스 배아 줄기 세포를 사료에 2회 파종합니다.

생물학적 안전 후드에서 마우스 배아 줄기 세포 플레이트를 5ml의 PBS로 헹구고 방금 시연한 것처럼 트립신과 EDTA로 세포를 분리합니다. 원심분리로 세포를 채취한 후, 줄기세포 펠릿을 5ml의 신선한 줄기세포 배지에 다시 현탁시키고 신선한 배아 줄기세포 배지에 담긴 접시당 1ml의 세포를 젤라틴으로 코팅된 세포 배양 접시 5개에 플레이트합니다. 배양액이 80-85% 농도에 도달할 때까지 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.

그런 다음 플레이트당 최소 8ml의 PBS로 세포를 헹구어 10분 동안 3회 세척한 다음 환원된 혈청 배지에서 24시간 배양합니다. 24시간 이내에 원심분리를 위해 상등액을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 0.2 마이크로 미터 병 상단 여과기를 통해 여과합니다.

노화 관련 베타 갈락토시다아제 분석에 의해 배아 줄기 세포 조건화 배지의 효과를 테스트하기 위해, 인간 피부 섬유아세포 배지의 6웰 플레이트에 인간 진피 섬유아세포를 파종합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 하룻밤 배양 후 배지의 절반을 신선한 마우스 배아 줄기 세포 조절 배지로 교체하여 또 다른 72시간 배양을 합니다. 배양 3일째에 웰당 2ml의 PBS로 세포를 헹구어 30초 동안 두 번 세척합니다.

그런 다음 3.7% 파라포름알데히드에 세포를 실온에서 5분 동안 흄 후드에 고정합니다. 고정 후 방금 시연한 것처럼 2밀리리터의 PBS로 세포를 두 번 세척하고 이산화탄소 없이 섭씨 37도에서 17시간 30분 동안 1-2밀리리터의 SA 베타 갈 용액으로 세포에 라벨을 붙입니다. 염색 기간이 끝나면 방금 설명한 것처럼 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.

그런 다음 실온에서 5분 동안 에오센으로 염색을 방지합니다. PBS를 한 번 더 세척한 후 광학 현미경으로 100배 배율로 세포를 이미지화합니다. 세포주기 분석을 위해 신선한 인간 피부 섬유아세포 배지의 6cm 세포 배양 접시에 웰당 10배에서 4번째 인간 진피 섬유아세포를 8번 파종하여 섭씨 37도에서 5%이산화탄소에서 하룻밤 배양합니다.

다음 날 아침, 배지의 절반을 마우스 배아 줄기 세포 조건의 배지로 교체하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 24시간 후, 트립신 EDTA 해리로 세포를 수확한 후 1밀리리터의 PBS 용액을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 100마이크로리터의 차가운 PBS 용액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 와류를 일으키는 동안 200 마이크로 리터의 차가운 에탄올에서 드롭 와이즈 적용으로 세포를 고정합니다. 세포를 섭씨 4도에서 최소 한 시간 동안 보관하십시오. 그런 다음 새 PBS 용액으로 씻으십시오.

두 번째 원심분리 후, 이산화탄소 없이 섭씨 37도에서 30분 동안 RNase가 보충된 250마이크로리터의 구연산나트륨 완충액으로 펠릿을 처리합니다. 배양이 끝나면 20분 동안 프로피듐 요오드화물이 함유된 250마이크로리터의 구연산나트륨 완충액으로 세포에 라벨을 부착합니다. 그런 다음 유세포 분석으로 각 샘플의 세포 주기 단계를 평가합니다.

정량적 역전사효소 PCR 분석의 경우, RNA 추출 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 마우스 배아 줄기 세포 컨디셔닝 배지 처리된 인간 피부 섬유아세포에서 전체 RNA를 분리합니다. 분광 광도계를 사용하여 추출된 총 RNA를 정량화합니다. 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 올리고 데옥시티미딘 프라이머와 M-MLV 역전사효소를 포함하는 반응 혼합물을 공식화합니다.

그런 다음 총 RNA 1마이크로그램을 반응 혼합물이 포함된 PCR 튜브에 추가합니다. 마지막으로, green PCR 마스터 믹스와 적절한 유전자 프라이머를 사용하여 real time PCR 기계로 cDNA의 증폭을 측정합니다. MEF 공급세포층에서 정상적인 마우스 배아 줄기세포 배양 조건에서 성장한 마우스 배아 줄기세포는 타원형과 광택 모양을 나타냅니다.

혈청 및 무급유 배양 조건에서 성장한 마우스 배아 줄기세포는 편평하고 불규칙한 형태를 보여줍니다. 노화 인간 피부 섬유아세포를 마우스 배아 줄기 세포 조건화 배지로 처리하면 노화 관련 베타갈락토시다아제 양성 세포의 수가 감소합니다. 또한, 이러한 세포의 세포주기 분석은 마우스 배아 줄기 세포 조건화 배지 처리가 G0/G1 단계의 세포 수를 감소시키는 동시에 S 및 G2/M 단계의 세포 수를 극적으로 증가시키는 것으로 나타났습니다.

또한, 마우스 배아 줄기 세포 조건화 배지 처리는 노화 관련 유전자 및 노화 표현형과 관련된 비서 사이토카인의 발현을 감소시킵니다. 이 절차를 시도하는 동안, 긴 배양은 세포 자가분해 또는 기아에 의한 세포사멸의 가능성을 증가시키기 때문에 24시간 후에 혈청과 피더 프리 배지를 수집하는 것을 기억하는 것이 매우 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 무세포 접근법을 위해 혈청 및 공급이 없는 마우스 배아 줄기세포 조절 배지를 수집하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

파라포름알데히드와 같은 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 이 시약을 흄 후드에서 취급하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.