Name: 인간의 자궁 경부 감마 델타 T 세포의 분리 및 유세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 학습하세요 인간 자궁 경부 감마 델타 T 세포 분리 및 유세포 분석 방법을. 사이토브러시 채취와 자성 비드 또는 세포 분류 기술을 활용하여 면역학 및 감염병 연구에 활용할 수 있는 효율적인 프로토콜을 제공합니다.

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우리는이 작업에 참여할 의지의 마이애미 WIHS 연구 참가자 감사합니다. 이 논문의 데이터는 마이애미 여성 부처 HIV 연구 (WIHS)에 의해 수집 하였다. 이 책의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 국립 보건원 (NIH)의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 이 작품은 전진에 대한 알레르기 및 전염병 국립 연구소와 여자의 부처 간 HIV 감염 연구 (WIHS) 허가 번호 U01의 AI103397, 알레르기 국립 연구소 감염증, 건강 [허가 번호 P30AI073961]의 국립 연구소, 국립 센터 지원 건강의 병진 과학 및 소수 민족 보건 및 건강 불균형에 국립 연구소, 건강 [허가 번호 UL1TR000460 및 1KL2TR000461] 국립 연구소 및 아동 건강 및 인간 발달의 국립 연구소 국립 연구소 [허가 번호 K23HD074489].

연구 활동은 마이애미 여성의 HIV 부처 연구 (WIHS) 및 AIDS 연구를위한 마이애미 센터 (CFAR) .Institutional 검토위원회 (의과 대학 마이애미 밀러 학교) 승인 전에 얻었다와 공동으로 마이애미 HIV 연구 단위의 대학에서 일어났다 채용 및 평가 또는 연구 관련 절차. 1. 자궁 경부 브러쉬 샘플 컬렉션 참고 : 참가자는 훈련 MD 또는 산부인과 의사와 cytobrush를 삽입하여 검경 시험에서 수행되었다 상피내 림프구의 컬렉션에 의해 수행되는 질 검사를 시행 하였다. <ol><li> 참가자 특성 <ol><li> 성적, 활성 임신하지 아니라 피임 약물이나 자궁 내 장치와 나이, 18 ~ 45 년 세되는 여성 참가자를 모집. </li><li> 질 검사하기 전에,이 참가자는 녹색에서 10 mL의 혈액 무승부를 받다말초 혈 단핵 세포 (PBMC) 분리 용 상부 헤파린 vacutainers. 자궁 경부 상피내 분석 (9)에 대한 제어 역할을합니다. </li></ol></li><li> 자궁 경부 샘플 컬렉션 <ol><li> 윤활없이 질에 적절한 크기의 살균 검경를 삽입합니다. 검기와 점액을 청소하는 멸균 거즈의 삽입을 용이하게하기 위해 따뜻한 물을 사용합니다. 검기의 위치는 운영 체제 및 ectocervix의 완벽한 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 손에 가장 가까운 단지 강모가 표시 될 때까지 자궁 경관에 자궁 경부 브러쉬를 삽입합니다. 360 °의 브러시를 시계 방향으로 돌립니다. IMDM 배지 5 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 브러쉬를 옮긴다. </li><li> 즉시 수집 한 후, 얼음에 cytobrush를 포함하는 튜브를 배치합니다. 수집 된 상피내 세포의 높은 생존 능력을 얻으려면 1 시간 내에 실험실 및 프로세스에 cytobrush을 제공합니다. </li></ol></li></ol><ol><li> 4 단 (10 초) 스트로크를 적용 경부 cytobrush을 포함 소용돌이 관. </li><li> X 250 g에서 10 분 동안, cytobrush을 포함하는 튜브를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 튜브에서 cytobrush을 제거 (튜브 하단의 펠렛을 방해하지 않음) 및 IMDM 미디어의 1 mL를 넣고 얼음에 튜브를 배치합니다. </li><li> 50 ML 튜브의 상단에 100mm의 셀 스트레이너에 cytobrush를 놓습니다. </li><li> 20 ㎖의 IMDM으로 cytobrush을 씻으십시오. </li><li> 250 × g에서 10 분 동안 원심 분리기 튜브. </li><li> 뜨는을 가만히 따르다 및 펠렛 세포를 1 mL의 IMDM에 재현 탁 2.3에 설명 된 이미 다시 중단 펠렛과 결합. </li><li> 자동 세포 계수기 (10)를 사용하여 세포를 트립 판 블루 수나 염료 10 μL로 세포 현탁액 10 μL를 조합하여 혈구를 이용하여 세포 수를 계산. 부드럽게 피펫 및 열 배 아래로 세포를 혼합 염색. 로드 10 μL두 혈구 챔버들 중 하나의 개구 내로의 혼합물. 다섯 개의 격자 영역의 모든 세포를 카운트. 생존과 비 생존 세포의 별도의 수를 유지합니다. 다음 식을 사용하여 세포 생존도를 결정 생존 세포 % = 비 생존 세포 × 100 / 총 세포 수의 세포를 포함한다. 다음 계산을 사용 mL의 후속 세포 농도 (세포의 총 수)를 결정한다. ml의 당 전체 세포는 = 총 세포 계수 × (희석 배수 / 계산 사각형의 수) 10,000 세포 / ml를 X. </li><li> 10 % DMSO 90 % FBS를 포함하는 동결 매체를 사용하여 격리 된 자궁 경부 세포를 고정. </li></ol> 3. 유동 세포 계측법 <ol><li> PBS를 1 % 소 혈청 알부민을 함유하는 100 μL FACS 완충액에 1-3 × 105 자궁 경부 세포 (다시 일시 </li><li> 1 μL / 10 추가 6 LIVE / DEAD 고칠 옐로우 사균 얼룩 키트 및 표 1에 기재된 농도로 표면 마커에 대한 항체. </li><li> 빛으로부터 보호 4 ° C에서 30 분 동안 세포를 품어. </li><li> 350 XG에서 5 분 동안 1 ㎖의 FACS 완충액 및 세포를 원심 분리 관에 추가 </li><li> 300 μL 1 % 파라 포름 알데히드의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> FACS 완충액 100 μL 비드 한 방울 샘플 염색에 사용 된 항체의 동일한 농도를 첨가하여 염색에 사용되는 비드 및 항체를 사용하여 보정 제어를 준비한다. </li><li> 사이토, 405 nm의, 488 nm의 및 635 nm의 레이저가 장착 된 흐름에 스테인드 구슬과 샘플을 획득. </li></ol> 4. 자궁 경부 감마 델타 T 세포 분리 <ol><li> 자기 비드 분리 <ol><li> 다시 중단 재료 및 시약의 표 참조 TCR 감마 델타 마이크로 비드 키트에 포함 된 버퍼의 40 μL에서 2.6에 설명 된 자궁 경부 세포 펠렛 (≤10 7 총 셀). </li><li> 두 단계 염색 프로토콜에 대한 키트의 지시 사항을 따르십시오 : 첫째, 재치항 합텐 마이크로 비드-FITC와 시간 반 TCR 감마 델타 합텐 - 항체 및 초, </li><li> 4-8 ℃에서 15 분간 배양 한 후, 10 분 동안 300 XG에 버퍼 원심 1 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 튜브를 반전시켜 상등액을 경사 분리하고, 종이의 도움으로 건조 탭. </li><li> 제공된 버퍼 500 μL의 세포 펠렛을 다시 중단하고 공급 업체의 프로토콜에 따라 적절한 자기 분리기에 배치하여 자기 열을 준비합니다. </li><li> 칼럼에 세포 현탁액을 적용하고 통과 레이블이없는 세포를 수집하고 버퍼의 적절한 금액 (500 μL)과 열 배 씻는다. 버퍼 세 번, 열 저수지가 비어 번 할 때마다 추가하여 세척 단계를 수행합니다. 총 폐수를 수집합니다. 이 레이블이없는, 음의 세포 분획이다 </li><li> 열이 컬럼에 버퍼 1 ㎖를 자기 분리기 및 피펫을 형성하고 즉시 자기 라벨 부분을 세척 제거단단히 열와 함께 제공된 플런저를 적용하여 세포를 에드. 주의 : 자성 표지 항 합텐 마이크로 비드는 형광 염료 FITC가 결합되어 있기 때문에 절연 감마 델타 T 세포는 이미 형광 유세포 분석을 위해 염색 하였다. </li></ol></li><li> 셀 정렬 <ol><li> 생존 다이 항체 패널 셀 정렬, 라벨 자궁 경부 세포의 경우 3 절에 설명 된대로. </li><li> 라이브, CD45 + CD3 + 감마 델타 양성 세포에 전자 게이트를 설정하고 셀 정렬을 수행합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kaul, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genital+tract+immune+milieu%3A+an+important+determinant+of+HIV+susceptibility+and+secondary+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission.</a> J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).</li>
<li>Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+early+infection+to+prevent+HIV-1+mucosal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission.</a> Nature. 464, 217-223 (2010).</li>
<li>Hayday, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma%5D%5Bdelta%5D+cells%3A+a+right+time+and+a+right+place+for+a+conserved+third+way+of+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection.</a> Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).</li>
<li>Nakasone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+gamma%2Fdelta+T+cells+in+the+lungs+and+their+roles+in+neutrophil-mediated+host+defense+against+pneumococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection+%2F+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).</li>
<li>Autran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+gamma%2Fdelta%2B+lymphocyte+subsets+during+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection.</a> Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).</li>
<li>Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+Cells+in+HIV+Disease%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future.</a> Front Immunol. 5, 687(2014).</li>
<li>Hayday, A. C., Spencer, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19446471">Barrier immunity.</a> Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).</li>
<li>Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+and+dark+sides+of+intestinal+intraepithelial+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes.</a> Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).</li>
<li>Strbo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Intra-Epithelial+Endocervical+Gamma+Delta+%28GD%29+1+T+Cells+in+HIV-Infected+Women%5BTitle%5D)+AND+%22AJRI%22%5BJournal%5D)">Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women.</a> AJRI. 75, 134-145 (2016).</li>
<li>Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+automated+instrument+for+viability+and+concentration+measurements+of+cryopreserved+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Hematol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells.</a> Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).</li>
<li>Alcaide, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Vaginosis+Is+Associated+with+Loss+of+Gamma+Delta+T+Cells+in+the+Female+Reproductive+Tract+in+Women+in+the+Miami+Women+Interagency+HIV+Study+%28WIHS%29%3A+A+Cross+Sectional+Study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study.</a> PloS one. 11, e0153045(2016).</li>
<li>Masson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+genital+tract+cytokine+signatures+of+sexually+transmitted+infections+and+bacterial+vaginosis+in+women+at+high+risk+of+HIV+infection%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Transm+Dis%22%5BJournal%5D)">Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study.</a> Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).</li>
<li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+%28IL%29-1%2C+IL-6%2C+and+IL-8+predict+mucosal+toxicity+of+vaginal+microbicidal+contraceptives%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives.</a> Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).</li>
<li>Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+isolation%2C+and+flow+cytometric+analysis+of+human+endocervical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples.</a> JoVE. , (2014).</li>
<li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+viable+leukocyte+sampling+from+the+female+genital+tract+for+clinical+trials%3A+an+international+multi-site+study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study.</a> PloS one. 9, e85675(2014).</li>
<li>Dominguez, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+quantitation+of+gene+expression+on+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells.</a> J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).</li>
</ol>

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여성 하부 생식기의 점막 취약점 평가는 HIV 수집 및 전송의 위험을 다루는 임상 연구의 필수적인 구성 요소입니다. 일반적으로 HIV 감염에 FGT 취약점은 생식기 분비물 (사이토 카인, 케모카인 및 항균 펩타이드) 12, 13에 용해 면역 조절제를 측정하여 평가한다. 그러나 이러한 바이오 마커는, 질 염증의 지표이다 생리 학적 및 병리학 적 사건에 의해 영향을받는, 항상 직접 점막 손상을 대변하지 않습니다. 점막 요인 취득 및 HIV를 전송할 위험성을 증가시키는 방법에 대한 이해를 향상시키기 위하여, 점막 세포 손상의 지표가 개발되어야한다. GD 상피내 T 세포 넣다 상피 세포 사이 FGT에 존재하고, 환경 문제에 대한 방어의 제 라인뿐만 아니라 항상성에 기여하는 것으로 생각된다. GD T 세포는 poten을<html> FGT 점막 취약점 평가 추가적인 바이오 마커를 구성 자유형. <p class="jove_con...

우리는 GD 상피내 T 세포를 평가하기 위해 브러시 경부 샘플을 사용하는 방법을 개발 하였다. 자궁 경관은 원주 상피의 단일 층으로 늘어서있다. 상피내 림프구는 병원성 미생물 7, 8 발생에 면역 반응을 빠르게을 시작할 수 있습니다 상피 층 내부에있는 전선 림프구를 나타냅니다. 자궁 경부 상피내 구획의 면역 학적 사건을 이해하는 것은 HIV를 포함하여 감염을 방지하는 효과적인 전략의 설계에 중요합니다. 우리의 방법은 HIV 감염 또는 HIV 감염 위험이있는 여성 GD 상피내 T 세포의 역할을 조사하기 위해 신선하게 수집 된 인간 경부 샘플뿐만 아니라 냉동 경부 세포에 적용 할 수있다. 이 프로토콜의 주요 목표는 자궁 경부 상피내 구획에 새로운 면역 학적 이벤트를 발견하고 evaluat하는 것입니다HIV 감염 여성의 점막 취약점 마커로 전자 GD T 세포 반응. FGT 내성 주변 지식에 상당한 격차가 성공적으로 수집하고 점막 샘플의 처리에 어려움에 부분적으로 기인한다. 또한, 복잡한 점막 면역 세포 이질성, 서로와의 상호 연결성은 면역 시스템의 상태 및 성능을 반영 임상 적 측정을 식별하는 주요 과제이다. 우리는 추가 될 FRT 면역 기전을 확인하기위한 없어서는 안될 매우 다중화 된 단일 셀 기술을 사용하여 분석 할 수 고순도 GD 상피내 T 세포를 수득하는 방법을 개발 하였다.

<table><tbody><tr><td>사이토브러시 플러스 GT&nbsp;</td><td>(CareFusion, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM, Iscove의 수정 된 Dulbecco의 매체&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter 자동 세포 계수기 (Vi-CELL 시리즈 세포 생존도 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>496178</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Dimethyl sulfoxide&nbsp;</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 소의 태아 혈청</td><td>Invitrogen, Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen, Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 고정성 노란색 데드 셀 염색 키트&nbsp;</td><td>Life</td> <td>Technologies,L349S9</td><td></td></tr><tr><td>1% 파라포름알데히드</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>D6148</td><td></td></tr><tr><td>Fortessa 유세포 분석기&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>ArC 아민 반응 보상 비드 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)</td><td>Life Technologies</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit&nbsp;</td><td>밀테니 Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-050-701</td><td></td></tr><tr><td>MS 칼럼</td><td></td><td>103-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS 분리기</td><td></td><td>4124</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 자궁 경부 감마 델타 t 세포의 분리 및 유세포 분석

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

여성의 생식 기관 (FRT) 점막 면역 시스템은 첫 번째 방어선 역할을합니다. 성기 점막의 더 나은 지식은 HIV를 포함하여 다른 병원균의 병원성을 이해하는 것이 필수적이다. 감마 델타 (GD) T 세포는 &#39;비 전통적인&#39;T 세포의 원형이며, 감마 및 델타 사슬로 구성된 이종이 T 세포 수용체 (TCR도)들의 식으로 정의 T 세포의 상대적으로 작은 부분 집합을 나타낸다. 이 알파 - 베타 TCR도에 의해 정의 된 고전 훨씬 더 잘 알려 CD4 + 헬퍼 T 세포와 CD8 + 세포 독성 T 세포에서 차별화. GD T 세포는 종종 조직 별 현지화를 보여 상피 세포에 농축되어있다. GD T 세포는 염증, 종양 감시, 감염성 질환, 및자가 면역 반응에 대한 면역 반응을 조율. 여기서는 재현성 분리 및 인간 자궁 경부 상피내 GD T 림프구를 분석하는 방법을 제시한다. 우리는 하여자의 부처 간 HIV 감염 연구 (WIHS)에 참여하는 여성에서 사용 경부 cytobrush 샘플을했습니다. 질 점막 모독가 인 조건에서 GD T 세포의 상호 작용에 대한 지식은 질 microbicides.In 추가의 개발을 포함한 점막 취약점을 해결하는 임상 연구에 적용 할 수 점막 GD T 세포 반응에 대한 지식을 가지고 감염성 질환의 치료에서 GD T 세포 기반 면역 요법의 적용 가능성.

최근에는 경부 상피내 GD T 세포를 분석하고, 우리는 HIV 감염 여성 9, 11의 경부 감마 델타 T 세포의 감소에 관하여보고 처음이었다. 여기서는 분리하고 경부 감마 델타 T 세포의 서브 세트를 분석하는 프로토콜을 기술한다. 도 1에 도시 된 바와 같이, T 세포 GD 용이 인간 자궁 경부 세포 샘플에서 검출 될 수있다. 자궁 경부 감마 델타 V1 (GD1) T 세포의 고유 한 인구는 multiparametar이 세포 계측법 기반 면역 표현형 (그림 1) 흐름을 사용하여 설명 하였다. HIV 감염되지 않은 자궁 경부 샘플의 대표적인 게이팅 전략은도 1에 도시되어...

여기에서는 상피내 감마 델타 T 세포의 분석을 위해 인간 상경부 내 림프구를 얻기 위한 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 자성 비드 또는 세포 분류에 의해 자궁경부 감마 델타 T 세포의 정제를 위해 확장될 수 있습니다.

인간의 자궁 경부 감마 델타 T 세포의 분리 및 유세포 분석

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

본 절차의 전체적인 목표는 인간 자궁경부 내막 브러시 샘플로부터 비전형적인 상피 내 세포인 감마 델타 T 세포 집단을 분리하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 자궁경부 내막 상피 내 구획에서 일어나는 면역 반응을 이해하는 데 핵심적인 질문들에 답함으로써, 감염 예방을 위한 효과적인 전략을 설계하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자궁경부 내막 상피 내 감마 델타 T 림프구를 in vitro에서 연구하기 위한 강력하고 효율적인 도구를 제공한다는 점입니다.시연은 저희 실험실의 선임 연구원인 Laura Romero가 진행하겠습니다. 수집 직후, 사이토브러시가 들어 있는 튜브를 얼음에 보관하십시오. 수집 후 1시간 이내에, 사이토브러시가 들어 있는 튜브를 10초씩 4회 펄스로 볼텍싱하십시오.그 다음, 튜브를 원심 분리하고 팔레트가 흐트러지지 않게 주의하며 브러시를 조심스럽게 제거합니다. 이어서, 세포에 IMDM 배지 1 mL를 첨가하고 튜브를 얼음에 둡니다. 50 mL 원추형 튜브에 들어있는 100 mm 세포 스트레이너 위에 사이토브러시(cytobrush)를 올리고, 20 mL의 신선한 IMDM으로 브러시를 세척합니다.세척액을 원심분리합니다. 펠릿을 1 mL의 신선한 IMDM에 다시 부유시킨 후, 원래의 사이토브러시(cytobrush) 수집 튜브에 있는 세포와 세척액을 합칩니다. 유세포 분석법으로 자궁경관 세포를 분석하려면, 5 mL 튜브당 100 µL의 FACS 버퍼에 1~3 × 10⁵개의 세포를 분주하고, 4 °C의 암소에서 30분 동안 원하는 항체 및 생존능 염색약으로 세포를 표지합니다.배양 종료 후, 키트 버퍼 1 mL로 세포를 세척합니다. 세포를 원심 분리한 후, 상층액을 완전히 제거합니다. 비드와 적절한 IgG 대조 항체를 사용하여 보정 대조군(compensation controls)을 설정합니다.그런 다음, 첫 번째 튜브를 로딩하고 전방 산란광(forward scatter)과 측방 산란광(side scatter) 산점도에서 전체 자궁경관 내 세포 집단에 게이트를 설정한 후, 세포 더블릿(doublet)을 제외합니다. 생존능 염색약(viability dye) 발현에 따라 사멸 세포를 제외하고, 생존한 CD45 양성 및 CD3 양성 세포에 게이트를 설정합니다. 감마 델타 1(gamma delta one) 및 감마 델타 2(gamma delta two) 양성 세포는 gamma delta TCR을 발현하는 CD3 양성 세포의 하위 집단으로 정의합니다.자기 비드 분리법으로 감마 델타 T 세포를 분리하려면, 갓 수확한 자궁경부 세포 최대 1×10⁷개를 40 µL의 TCR gamma delta MicroBead 키트 완충액에 재현탁합니다. 2단계 염색 프로토콜에 대한 제조사의 지침에 따라, anti-TCR gamma delta hapten 항체로 세포를 라벨링한 후, anti-hapten FITC 접합 MicroBeads를 처리하여 4~8 °C에서 15분 동안 반응시킵니다. 배양이 끝나면 1 mL의 키트 완충액으로 세포를 세척하고 상층액을 완전히 따라냅니다.세포를 500 µL의 키트 버퍼에 재현탁하고, 적절한 분리 자석에 설치된 마그네틱 비드 컬럼에 세포 현탁액을 직접 도포한 뒤, 통과액을 새 튜브에 수집합니다. 모든 세포가 컬럼을 통과하면, 500 µL의 신선한 버퍼로 컬럼을 3회 세척하고, 세척액을 수집된 세포와 합칩니다. 감마 델타 T 세포를 수집하려면, 컬럼을 원심 분리 튜브로 옮긴 후 컬럼 플런저를 사용하여 1 mL의 신선한 버퍼로 컬럼 내의 T 세포를 밀어내어 수집합니다.형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting)으로 감마 델타 T 세포를 분리하려면, 방금 시연한 항체 패널과 같이 세포를 생존 염색약으로 표지하십시오. 그 다음, 생존 염색약과 CD45, CD3 및 감마 델타 양성 여부에 따라 세포를 분류합니다. 인간 자궁경부 세포 샘플에서 감마 델타 V1을 발현하는 고유한 T 세포 집단을 쉽게 검출할 수 있습니다.게이팅된 CD3 양성 gamma delta one 양성 세포의 세부 표현형 분석 결과, 이들 세포의 대부분이 CD4 및 CD8 음성임이 밝혀졌습니다. 방금 시연한 바와 같이, 자궁경부 내 세포를 자성 비드로 분리하면 TCR gamma delta 세포를 거의 98% 순도로 정제할 수 있습니다. 이러한 수준의 순도는 형광 활성 세포 분류법(FACS)을 통해서도 달성할 수 있으며, 이는 자궁경부 gamma delta T 세포 분리를 위해 두 가지 기술 중 어느 것을 사용해도 유효함을 입증합니다.흥미롭게도, HIV 감염 여성 환자와 건강한 대조군 공여자로부터 수집한 자궁경관 내 상피세포의 gamma delta T 세포를 분석한 결과, HIV 감염자에게서 이 중요한 세포들의 수와 생존율이 약간 감소하는 것으로 나타났습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 양호한 세포 생존율을 유지하기 위해 샘플을 빠르게 처리하고, 전체 과정 동안 세포를 얼음 위에 보관하는 것이 중요합니다.이 절차에 이어, 단일 세포 분리 및 고감도 고처리량 멀티플렉스 PCR과 같은 다른 방법들을 수행하여 자궁경부 내 상피 구획 내의 염증 및 신호 전달 경로에 관한 추가적인 의문점들을 해결할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 HIV 및 감염성 질환 분야의 연구자들이 점막 취약성의 새로운 세포 마커를 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 인간 자궁경부 내 브러시 샘플로부터 상피 내 림프구를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

isolation-flow-cytometric-analysis-human-endocervical-gamma-delta-t

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)에서 γδ T 세포를 확장하는 방법을 설명합니다. PBMC - 파생 γδ T 세포는 자극과 zoledronate과 인터루킨 - 2 (IL - 2)를 사용 확장됩니다. γδ ​​T 세포의 대규모 확장이 암의 autologous 세포 immunotherapy에 적용할 수 있습니다.

Zoledronate를 사용하는 사람 말초혈의 확장 γδ T 세포

이 비디오는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+Vδ1+γδ T 세포의 저농도 집단을 자기 라벨링 기반으로 분리하는 프로토콜을 보여줍니다. FITC-conjugated anti-Vδ1 antibodys, magnetic anti-FITC microbeads 및 anti-CD4 antibody-coated superparamagnetic beads의 조합을 사용하여 CD4+Vδ1+ T cell은 PBMC 집단에서 성공적으로 정제될 수 있습니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포에서 CD4+ Vδ1+ γδ T 세포의 선택적 분리

자궁경부에서 림프구와 단핵구를 채취하기 위해 사이토브러시 샘플링을 사용하는 것은 여성 생식기 면역 분석을 위한 샘플을 제공하는 최소 침습 기술입니다. 이 프로토콜에서는 유세포 분석 분석을 위한 cytobrush 샘플 수집 및 면역 세포 분리에 대해 설명합니다.

컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

여기에서는 말초 Vδ1+CD4+ T 세포의 희소한 T 세포 개체, 즉 최근에 보여준 바와 같이 흉선 외 αβ T 세포 전구 세포의 분리 및 복제를 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 이 기술을 사용하면 체외 배양에서 이러한 세포를 정량적으로 분리, 복제 및 효율적으로 확장할 수 있습니다.

분리 및<em&gt; 전의 VIVO</emVδ1의&gt; 문화<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T 세포, Extrathymic αβT 세포 선조

초기 뇌 종양 미세 환경에 진입 면역 세포의 수와 활성 상태에서 시간에 따른 양적 데이터를 산출 교종 함침 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 유세포 분석을위한 간단한 방법이 여기에서 제시 하였다.

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

여기 분리 하 고 그들의 phenotypical 및 기능 특성의 평가 대 한 인간의 여성 재생산 지역에 다른 해 부 격실에서 수지상 세포를 정화 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다른 면역 세포 또는 다른 점 막 조직에서 수지상 세포를 분리 적용할 수 있습니다.

Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

여기, 분리와 CD4의 특성에 대 한 프로토콜+ T-세포 인간 주변 혈액에서 하위 집합 설명. CD4 정화+ T-세포 cytometry T follicular 도우미 셀 하위 집합의 비율을 결정 하 여 분석 된다.

CD4의 격리+ T-세포 및 분석의 순환 T-follicular 도우미 (cTfh) 6 컬러 Flow Cytometry 주변 혈액을 사용 하 여에서 셀 하위 집합

클로날 팽창은 항원 특이적 T 세포 반응의 주요 특징이다. 그러나, 항원 반응 T 세포의 세포 주기는 기술적인 한계 때문에 부분적으로, 제대로 조사되었습니다. 우리는 예방 접종 마우스의 비장 및 림프절에서 복제 확장 항원 특정 CD8 T 세포를 분석하는 유동 세포 측정 방법을 설명합니다.

예방 접종 된 마우스에서 항원 특정 CD8 T 세포의 세포 주기 분석을위한 DNA / Ki67 기반 유동 세포 분석

이것은 임신과 비 임신 마우스 둘 다에서 자궁 림프세포를 격리하는 방법입니다. 이 방법은 FACS phenotyping, 세포 선별, 기능 적 작용, RNA-seq 및 프로테오믹스와 같은 여러 다운스트림 응용 제품에 사용할 수 있습니다. 여기서 프로토콜은 혈류 세포측정에 의한 표현형 그룹 1 자궁선천성 림프구 세포를 전파한다.

유동 세포측정에 의한 분석을 위한 자궁 내 선천 림프구 세포의 격리

T 세포 신호 전달의 척도인 칼슘 유입은 T 세포 수용체 자극에 대한 반응을 분석하는 효과적인 방법입니다. Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화하기 위한 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용합니다.

Full Spectrum Flow Cytometry에 의한 Primary Murine T-cell의 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 분석

본 프로토콜은 전처리된 종양 세포를 사용한 동종 공동 배양 시스템에서 인간 T 세포 자극의 생체 외 분석을 가능하게 하는 실험 워크플로우를 설명합니다.

전처리된 종양 세포의 동종 공동 배양 환경에서의 인간 T 세포 활성 분석

학습하세요 인간 자궁 경부 감마 델타 T 세포 분리 및 유세포 분석 방법을. 사이토브러시 채취와 자성 비드 또는 세포 분류 기술을 활용하여 면역학 및 감염병 연구에 활용할 수 있는 효율적인 프로토콜을 제공합니다.

인간의 자궁 경부 감마 델타 T 세포의 분리 및 유세포 분석

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