인간의 자궁 경부 감마 델타 T 세포의 분리 및 유세포 분석

이 절차의 전반적인 목표는 인간 자궁경부 브러시 샘플에서 비전통적인 상피내 세포, 감마 델타 T 세포 집단을 분리하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 자궁경부 내 상피내 구획 내의 면역 사건을 이해하는 데 있어 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 감염을 예방하기 위한 효과적인 전략을 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 체외에서 자궁경부 내 상피내 감마 델타 T 림프구를 연구하기 위한 강력하고 효율적인 도구를 제공한다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 선임 연구원인 로라 로메로(Laura Romero)입니다. 채취 직후, 사이토브러시가 들어있는 튜브를 얼음 위에 올려 놓습니다. 채취 후 1시간 이내에 사이토브러시가 들어 있는 튜브를 10초 동안 4회 펄스로 소용돌이칩니다.

그런 다음 튜브를 원심 분리하고 팔레트를 방해하지 않고 브러시를 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 1ml의 IMDM 배지를 세포에 첨가하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 50ml 원뿔형 튜브의 100mm 세포 여과기 위에 사이토브러시를 놓고 20ml의 새 IMDM으로 브러시를 세척합니다.

세척을 원심 분리하십시오. 1ml의 신선한 IMDM에 팔레트를 다시 현탁시키고 원래의 cytobrush 수집 튜브에 있는 세포로 세척하여 풀을 만듭니다. 유세포 분석으로 자궁경부 내 세포를 분석하려면 5밀리리터 튜브당 100마이크로리터의 팩스 버퍼에 있는 1-3배 1-5번째 세포를 분취하고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 30분 동안 관심 항체 및 생존도 염료로 세포에 라벨을 붙입니다.

배양이 끝나면 1ml의 키트 완충액으로 세포를 세척합니다. 세포를 회전시킨 후 상층액을 완전히 기울입니다. 비드와 적절한 IgG 대조군 항체를 사용하여 보상 대조군을 설정합니다.

그런 다음 첫 번째 튜브를 로드하고 전체 경추 내 세포 집단에 대한 게이트를 전방 측면 산점도표로 설정한 다음 세포 이중항을 제외합니다. 생존 염료 발현에 따라 죽은 세포를 제외하고, 살아있는 CD45 양성 및 CD3 양성 세포에 게이팅을 합니다. gamma delta one 및 gamma delta two positive cell은 gamma delta TCR을 발현하는 CD3 positive cell의 subpopulation으로 정의됩니다.

마그네틱 비드 분리를 통해 감마 델타 T 세포를 분리하려면 40마이크로리터의 TCR 감마 델타 MicroBead 키트 버퍼에서 갓 수확한 7번째 자궁경부 세포를 최대 1배까지 재현탁합니다. 2단계 염색 프로토콜에 대한 제조업체의 지침에 따라 세포에 anti-TCR gamma delta hapten antibody를 라벨링한 다음 anti-hapten FITC conjugated MicroBeads를 섭씨 4도에서 8도까지 15분 동안 표시합니다. 배양이 끝나면 1ml의 키트 완충액으로 세포를 세척하고 상등액을 완전히 디캔팅합니다.

500마이크로리터의 키트 버퍼에 셀을 재현탁하고 세포 현탁액을 적절한 분리기 자석에 설정된 마그네틱 비드 컬럼에 직접 적용하여 새 튜브에서 플로우스루를 수집합니다. 모든 세포가 컬럼을 통과하면 500마이크로리터의 새 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하고 수집된 세포와 함께 세척물을 풀링합니다. 감마 델타 T 세포를 수집하려면 컬럼을 원뿔형 튜브로 옮기고 컬럼 플런저를 사용하여 1ml의 새 버퍼로 컬럼에서 T 세포를 플러시합니다.

형광 활성화 세포 분류를 통해 감마 델타 T 세포를 분리하려면 방금 시연한 것처럼 항체 패널에서 세포를 생존 염료로 표시합니다. 그런 다음 생존 가능한 염료와 CD45, CD3 및 감마 델타 양성에 따라 세포를 분류합니다. T 세포를 발현하는 감마 델타 V1의 고유한 집단은 인간 자궁경부 세포 샘플에서 쉽게 검출할 수 있습니다.

게이트 CD3 양성 감마 델타 원 양성 세포의 상세한 표현형 분석은 이러한 세포의 대다수가 CD4 및 CD8 음성임을 보여줍니다. 방금 시연된 바와 같이 자궁경부 내 세포의 자기 비드 분리는 이러한 TCR 감마 델타 세포의 거의 98% 순수한 집단을 정제하는 결과를 가져옵니다. 이러한 수준의 순도는 형광 활성화 세포 분류를 통해서도 달성할 수 있으며, 이를 통해 자궁경부 감마 델타 T 세포의 분리를 위해 두 기술 중 하나를 사용하는 것을 검증할 수 있습니다.

흥미롭게도, 여성 HIV 감염 환자와 건강한 기증자 대조군에서 채취한 자궁경부 내 상피내 세포, 감마 델타 T 세포를 분석한 결과, HIV 감염 개체에서 이러한 중요한 세포의 수와 생존력이 약간 감소한 것으로 나타났습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2-3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플을 신속하게 처리하고 전체 절차 동안 세포를 얼음 위에 유지하여 우수한 세포 생존력을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 고감도 처리량 멀티플렉스 PCR과 결합된 단일 세포 분류와 같은 다른 방법을 수행하여 자궁경부 내 상피 내 구획 내의 염증 및 신호 경로에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 HIV 및 전염병 분야의 연구자들이 점막 취약성의 새로운 세포 마커를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간 자궁경부 브러시 샘플에서 상피내 림프구를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.