유도 결합 플라즈마 - - 레이저 박리에 의한 뇌 조직의 이미징 금속 질량 분석 (LA-ICP-MS)

본 방법의 전반적인 목표는 레이저 어블레이션 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry)을 사용하여 조직 절편 내 금속의 공간적 분포를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 기초 생물학 및 질병 연구, 특히 금속 생화학이 질병 병리와 연관된 상태에 관한 핵심적인 질문들에 답을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존의 일반적인 금속 분석 기술에서는 손실되었던 금속의 공간적 정보를 유지한다는 점입니다.

이 기술의 영향은 신경퇴행성 질환의 치료 및 진단으로 확장되는데, 이는 세포 사멸이 나타나는 뇌 영역에서 금속이 어떻게 변화하는지 모니터링할 수 있게 해주기 때문입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 길고 복잡한 실험 과정을 설정하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 각 단계가 특정 순서대로 실행되어야 하므로, 실험 설계와 데이터 분석이 까다로울 수 있어 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

먼저, 뇌 조직 샘플과 모든 매트릭스 매칭 조직 표준물을 레이저 어블레이션 챔버에 넣습니다. 샘플이 LACCD 카메라의 피사체 심도 내에 있는지 확인하십시오. 챔버 문을 닫고 나사를 손으로 조여 고정합니다.

그런 다음, ICPMS 소프트웨어에서 운반 가스 밸브를 열고 유량을 1.2 liters per minute로 설정하십시오. LA 소프트웨어에서 운반 가스를 사용하여 어블레이션 셀을 30분 동안 퍼지하십시오. 2배 부피의 어블레이션 셀의 경우, 셀 내의 잔류 공기량을 줄이기 위해 10분마다 샘플 스테이지를 챔버의 각 모서리로 이동시키십시오.

ICPMS를 켜고 기기가 2시간 동안 예열되도록 합니다. 기기가 예열되는 동안, 레이저 절제 소프트웨어에서 첫 번째 조직 표준물질의 표면에 걸쳐 약 3mm 길이의 절제선을 그립니다. 절제선을 클릭하고 기본 빔 직경, 스캔 속도 및 복사 플루언스를 설정합니다.

선을 6번 복제하고, 각 선 사이의 간격을 빔 직경만큼 띄웁니다. 각 표준 시료에 대해 이 과정을 반복합니다. 그런 다음, 표준 시료와 동일한 파라미터를 사용하여 선 도구를 이용해 샘플의 왼쪽 상단 모서리부터 샘플의 가장 넓은 지점을 가로지르는 어블레이션 영역을 그립니다.

표준물질에 사용한 것과 동일한 간격을 유지하며 샘플 전체를 커버할 수 있도록 필요에 따라 라인을 복제하십시오. 그 다음, 샘플 스캐닝 후 20시간 이내 또는 각 샘플 사이에 표준물질의 간헐적 스캐닝을 위한 라인 세트를 그리십시오. 실험 마지막에 표준물질 스캔을 추가하십시오.

선 길이와 스캔 속도를 바탕으로 시료 및 표준선에 대한 분석 시간을 결정하십시오. 그런 다음 ICPMS 소프트웨어에서 새로운 배치를 생성하고 시간 분해 분석을 선택하십시오. 관심 있는 질량 대 전하비 값을 선택하고, 한 사이클의 총 적분 시간이 0.25초가 되도록 각 비율에 대한 적분 시간을 설정하십시오.

배치를 저장하십시오. 표준 배치의 경우, 레이저 예열 및 세척 시간을 고려하여 각 라인의 분석 시간에 15초의 버퍼 시간을 추가하여 입력하십시오. 각 표준 라인에 대한 획득 설정이 포함된 샘플 런 리스트를 설정하십시오.

시료 배치의 경우, 표준 배치 설정을 복제한 후 시료 어블레이션 패턴에 맞춰 시간과 획득 횟수를 적절히 조정하십시오. ICPMS의 예열이 완료되면 첫 번째 배치를 큐에 추가하고, 소프트웨어가 LA 장비의 트리거를 기다리는 상태인지 확인하십시오. 그런 다음 LA 소프트웨어에서 레이저 전원 공급 장치를 켜고, 레이저 예열 및 워시아웃 시간을 설정하십시오.

레이저 시퀀스를 시작하고, 어블레이션(ablation) 후 ICPMS가 데이터 수집을 올바르게 시작하는지 확인하십시오. 데이터 수집이 완료되면, CSV 파일에서 표준물질에 대한 데이터를 추출하십시오. 트랙션(traction)의 베이스라인을 수행하고, 배경 신호를 제외하십시오.

조직 표준 시료의 구멍으로 인해 발생하는 신호 감소 지점을 식별하십시오. 이러한 저신호 영역을 마스킹한 다음, 데이터를 스프레드시트로 내보내십시오. 식별된 각 원소에 대해 CPS에서 PPM으로의 변환 계수를 계산하십시오.

각 표준 시료에 대해 이 과정을 반복하십시오. 다음으로, 정량 이미지 구축 소프트웨어를 열고 CSV 파일에서 샘플 데이터를 가져옵니다. 배경 보정을 적용하기 위해 배경의 여러 영역을 선택하십시오.

그래프 편집 도구를 선택하고 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음, 이미지 모양 수정(modify image appearance)을 선택하십시오. Z의 첫 번째 색상을 큰 음수 값으로 변경하고 완료(done)를 클릭하여 배경 신호를 강화하십시오. 그런 다음 표준물질(standards) 탭에서 각 표준물질에 대한 CPS PPM 보정 계수를 입력하고 시작(go)을 클릭하십시오.

데이터 탭에서 데이터 브라우저를 열고, 보정된 이미지 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 후 'new image'를 클릭합니다. 이미지 외형 수정 창을 열어 컬러 테이블과 스케일을 설정합니다. 주석 추가 유틸리티를 사용하여 이미지에 컬러 스케일을 표시합니다.

컬러 스케일 창에서 컬러 스케일을 조정합니다. 이미지의 색상 지정과 주석 달기가 완료되면, 이미지를 복사하여 다른 프로그램에 붙여넣거나 이미지 제작 소프트웨어에서 이미지를 내보냅니다. ROI 도구를 활성화하려면 분석 패키지에서 이미지 프로세싱을 선택하고 이미지를 지정하십시오.

이미지 탭에서 ROI를 클릭하고 ROI 그리기를 시작하십시오. 관심 영역을 선택한 다음 ROI 완료를 클릭하십시오. 이미지 탭에서 통계를 클릭하여 ROI 데이터를 얻으십시오.

각 ROI가 추가될 때마다 저장하면서 데이터를 스프레드시트에 복사하여 붙여넣으십시오. 필요에 따라 이 과정을 반복하십시오. 이 기술을 사용하여 야생형 생쥐 뇌의 금속 함량과 분포를 조사하였습니다.

여기에서는 탄소, 마그네슘 및 인의 분포를 초당 카운트(counts per second)로 나타내었습니다. 망간, 구리, 철 및 아연에 대해서는 정량 영상이 제시되었습니다. 탄소 분포는 내부 표준물질로 사용되었습니다.

철은 중뇌와 치상회에서 가장 풍부하게 나타났습니다. 아연은 피질 영역에서 가장 풍부했습니다. 이러한 이미지로부터 얻은 정보는 이후 금속 결합 단백질의 발현과 기능을 추적하는 데 사용될 수 있습니다. 숙달되면, 며칠에 걸쳐 진행되는 실험이라도 적절히 수행할 경우 한 시간 내에 준비할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 어블레이션 라인과 ICPMS 데이터 파일을 동기화하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후, 특정 단백질과 금속의 공국소화(colocalization)와 같은 추가 정보를 제공하기 위해 인접 절편에 대한 조직학적 염색과 같은 추가 방법을 수행할 수 있습니다. 저희는 처음에 파킨슨병 실험 모델에서 금속 수치가 어떻게 변화하는지 조사하고자 했을 때 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.

이 방법은 신경퇴행에 대한 통찰을 얻는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 조직 및 다양한 생물학적 매질을 포함한 서로 다른 조직 유형과 질환 상태에도 적용할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 신경과학 분야의 연구자들은 인간 샘플과 질환 동물 모델 모두에서 금속 수치가 어떻게 변화하는지 조사할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 레이저 절제 ICPMS 실험을 어떻게 설정하는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

생물학적 물질을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 적절한 개인 보호 장구를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.