Name: 유도 결합 플라즈마 - - 레이저 박리에 의한 뇌 조직의 이미징 금속 질량 분석 (LA-ICP-MS) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 학습하세요 생쥐 뇌 조직에서 금속 분포를 정량적으로 매핑하는 LA-ICP-MS 기법을 통해 신경퇴행성 질환 연구에 필수적인 공간적 금속 정보를 획득하는 방법을.

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DJH 및 PAD는 독일의 우수 이니셔티브 [DFG GSC 3분의 98]에 의해 투자 루르 대학 연구 학교 PLUS에 의해 지원 애질런트 테크놀로지스와 ESI (주) BK의 기여와 호주 연구위원회 링크 프로젝트 (LP120200081)에 의해 지원됩니다. DJH 부분적으로 Ramaciotti 재단에 의해 지원되었다. KK는 그리트 Juselius 재단이 지원됩니다.

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<li>Matusch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+bioimaging+of+Cu%2C+Fe%2C+Zn%2C+and+Mn+in+the+MPTP+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease+using+laser+ablation+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry+%28LA-ICP-MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+MAss+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Cerebral bioimaging of Cu, Fe, Zn, and Mn in the MPTP mouse model of Parkinson's disease using laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS).</a> J Am Soc MAss Spectrom. 21 (1), 161-171 (2010).</li>
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<li>Portbury, S. D., Hare, D. J., Sgambelloni, C., Finkelstein, D. I., Adlard, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-course+analysis+of+changes+in+cerebral+metal+levels+following+a+controlled+cortical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">A time-course analysis of changes in cerebral metal levels following a controlled cortical impact.</a> Metallomics. 8 (2), 193-200 (2016).</li>
<li>Theiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LA-ICP-MS+imaging+in+multicellular+tumor+spheroids+-+a+novel+tool+in+the+preclinical+development+of+metal-based+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">LA-ICP-MS imaging in multicellular tumor spheroids - a novel tool in the preclinical development of metal-based anticancer drugs.</a> Metallomics. 8, 398-402 (2016).</li>
<li>Niedzwiecki, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimodal+imaging+workflow+to+visualize+metal+mixtures+in+the+human+placenta+and+explore+colocalization+with+biological+response+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">A multimodal imaging workflow to visualize metal mixtures in the human placenta and explore colocalization with biological response markers.</a> Metallomics. 8, 444-452 (2016).</li>
<li>Austin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+distributions+in+teeth+reveal+early-life+dietary+transitions+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Barium distributions in teeth reveal early-life dietary transitions in primates.</a> Nature. 498 (7453), 216-219 (2013).</li>
<li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/ja/c3ja50281c">The effect of paraformaldehyde fixation and sucrose cryoprotection on metal concentration in murine neurological tissue.</a> J Anal At Spectrom. 29, 565-570 (2014).</li>
<li>Dodt, H. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Meth. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation-inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry+imaging+of+white+and+gray+matter+iron+distribution+in+Alzheimer%27s+disease+frontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging of white and gray matter iron distribution in Alzheimer's disease frontal cortex.</a> NeuroImage. 137, 124-131 (2016).</li>
<li>Günther, D., Heinrich, C. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/1999/JA/a901648a">Enhanced sensitivity in laser ablation-ICP mass spectrometry using helium-argon mixtures as aerosol carrier.</a> J Anal At Spectrom. 14 (9), 1363-1368 (1999).</li>
<li>Austin, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/ja/c0ja00267d">Factors affecting internal standard selection for quantitative elemental bio-imaging of soft tissues by LA-ICP-MS.</a> J Anal At Spectrom. 26 (7), 1494-1501 (2011).</li>
<li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+elemental+bio-imaging+of+Fe%2C+Zn%2C+Cu%2C+Mn+and+P+in+a+6-hydroxydopamine+lesioned+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional elemental bio-imaging of Fe, Zn, Cu, Mn and P in a 6-hydroxydopamine lesioned mouse brain.</a> Metallomics. 2 (11), 745-753 (2010).</li>
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<li>Paton, C., Hellstrom, J., Paul, B., Woodhead, J., Hergt, J. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2011/JA/c1ja10172b">Iolite: Freeware for the visualisation and processing of mass spectrometric data.</a> J Anal At Spectrom. 26 (12), 2508(2011).</li>
<li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li>
<li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+atlas+of+iron%2C+copper%2C+and+zinc+in+the+mouse+cerebrum+and+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional atlas of iron, copper, and zinc in the mouse cerebrum and brainstem.</a> Anal Chem. 84 (9), 3990-3997 (2012).</li>
<li>Hjornevik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+atlas+system+for+mouse+and+rat+brain+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional atlas system for mouse and rat brain imaging data.</a> Frontiers Neuroinform. 1, 4(2007).</li>
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<li>Balcaen, L., Bolea-Fernandez, E., Resano, M., Vanhaecke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductively+coupled+plasma+-+tandem+mass+spectrometry+%28ICP-MS%2FMS%29%3A+a+powerful+and+universal+tool+for+the+interference-free+determination+of+%28ultra%29trace+elements+-+a+tutorial+review%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Inductively coupled plasma - tandem mass spectrometry (ICP-MS/MS): a powerful and universal tool for the interference-free determination of (ultra)trace elements - a tutorial review.</a> Analytica Chimica Acta. 894, 7-19 (2015).</li>
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</ol>

RWH와 COC는 ESI Ltd.의 유급 직원입니다. FF와 TPH는 Agilent Technologies Australia의 유급 직원입니다.

신경 조직 이미징 금속이 프로토콜은 생물학적 매트릭스에서 금속의 분포와 양에 대한 유용한 정보를 제공 할 수있는 방법의 한 예입니다. 기준 표준 물질의 제조가 곤란한 일 수 있지만, 한 번 수행되고 나중에 사용을 위해 보관 될 수있는 실험이다. LA-ICP-MS 주로 접근성 및 감도면에서 싱크로트론 계 X 선 형광 현미경과 같은 다른 방법도, 일정 이상의 효과가있다. 그러나, LA-ICP-MS를 사용하여 실험을 제조 할 때 고려해야 할 일부 단점이 존재하고, 같은 종종 다른 금속 분석 기법뿐만 아니라 비교 조직 화학 (5)를 포함하는 화학 촬상 유용한 상보적인 기술이다. 마우스 뇌의 알려진 해부학 적 특징과 정렬 가능한 기능 relati에 대한 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다금속 레벨 및 공간적 분포 사이 onship. 이전에, 우리는 알렌 뇌 아틀라스 온라인 자원, 모두 금속에 의존하는 효소의 발현 (14)과 신경 해부학 (27)의 공간적 상관 관계를 조사하기 위해 C57BL / 6 마우스의 뇌에 모두 해부학 적 유전자 발현 데이터의 오픈 액세스 저장소입니다 (29)를 사용하고, 30. 같은 설치류 뇌 워크 벤치 (31)와 같은 다른 자원은 종종 작은 해부학 적 영역에 금속 분포의 정확한 식별을 지원하기 위해 등록 및 금속 이미지의 정렬을 지원하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 응용 프로그램은 정상적인 생활 이벤트 모두에 걸쳐 마이크로에서 어떻게 금속 수준 및 분포 변화를 평가하는데 유용하다 (예를 들면, 노화) 및 질병 상태에; 뿐만 아니라, 디자인 모두 금속 함유 화합물 및 약물의 효과를 공부하는 것은 저를 대상으로탈 대사. 금속 공간적 분포를 평가하기위한 촬상 기술로서 LA-ICP-MS의 현재의 주요 제한은 스루풋 민감도이다. 긴 분석 시간을 필요로하는 고해상도 이미지 분석 속도 및 공간 해상도 (5), (12) 사이의 트레이드 오프가있다. 망간, 코발트 및 셀레늄 등의 요소가 기존의 ICP-MS에 의해 그들의 검출 정상 조직 및 / 또는 제한의 낮은 풍요 로움으로 인해 제한되어 있지만이 기술은 높은 농도에서 생물학적 요소에 적합하다. 이러한 삼중 사중 극자 질량 분석기의 도입으로 ICP-MS 기술의 새로운 발전, 높은 감도 33에서 셀레늄 (32) 어려운 분석의 대상으로 검출 할 수 있습니다. 기술 중심의 과정으로, 증가, 기술은 계속 발전이 영상을 볼 수 레이저 및 질량 분석 디자인 모두에서 진행분석 및 감도 (34)의 속도입니다.

금속의 고유 레 독스 화학 신호 전달, 에너지 생산 및 신경 전달 물질의 합성을 포함하여 신경 기능의 범위를 용이하게한다. 주요 신경 퇴행성 질환의 수, 이들 금속의 dyshomeostasis 모두가 질병 병인에 관여하고 치료 학적 개입 한 잠재적 인 신규 한 타겟으로서 확인되었다. 좋은 금속이 알츠하이머 및 파킨슨 병 (AD 및 PD는 각각)와 같은 조건에 관련되는 방식을 이해하기 위해, 금속 분포와 레벨 악영향 질병 과정에 의해 영향을받는 영역 내에서 어떻게 변하는지를 측정 할 수있는 것이 필수적이다. 이러한 변화는 종종 밀접하게 같은 PD 2 철과 도파민 신경 독성의 우리의 최근 제안 된 메커니즘으로, 세포 사멸을 시작 프로세스에 연결 될 수있는 생화학 적 반응에 미묘한 변화를 나타내는입니다. 전통적으로, 메타한정된 해부학 적 영역 내에서 L 레벨 분석 기술 (3)의 범위를 사용하여 조심 절단, 분해 및 분석을 통해 달성되었다. 그러나, 이러한 방법은 질병 상태를 조사 작고 잘 정의 된 영역 또는 특정 세포 유형을 포함되는 경우에 중요 할 수있는 공간 정보를 잃는다. 분석 방법의 수는 방출 분광법, 형광 프로브 및 질량 분석 (4)를 사용하여, 그대로 샘플에서 조직 섹션에, 둘, 셋 차원에서 생물학적 시스템에서 금속을 시각화 할 수 있습니다. 각 기술은 민감성 화학 종을 선택하고 얻을 수있는 공간 해상도 대한 장점과 단점을 갖는다. 가능 기술의 범위의 포괄적 인 개요, 토끼 등의 알에 의한 검토를 참조하십시오. 5. 질량 분석 (MS)의 방법은이 기술의 가장 민감한 기반, 그 나라의 농도 6에서 가장 생물학적으로 관련 금속을 측정 할 수. 레이저 어블 - 유도 결합 플라즈마 - 질량 분석 (LA-ICP-MS)을 이미징 (사각형 빔 형상이 사용되거나 폭)&gt; 직경 100 μm의 1 크기로까지 집속 자외선 레이저 빔을 사용하는 언더 샘플은 7 전달됩니다. 정량적 인 정보는 다른 방식 (8), 기술 난이도 및 분석 실용성 다양한 정도의 각각의 다양한 사용하여 제조 될 수있는 표준 기준 물질의 대표 절제를 통해 달성 될 수있다. 가장 일반적인 방법은, 시료에 필적 주된 화학적 조성을 갖는 표준은 독립 분석 수단 (9)에 의해 균일 절대 금속 농도를 평가 정확하게 표적 피검로 급상승하여 제조되고, 매트릭스 매칭을 사용 </suP&gt; 10. 제조 기준의 제거 후, 얻어진 샘플 이미지로부터의 농도 데이터는 픽셀 당 추출 될 수 있도록 외부 교정 목적을 위해 사용될 수있다. 이미지 해상도, 빔 사이즈 및 샘플이 스캐닝되는 속도 모두에 의해 결정된다. (전세계 설치된 ICP-MS 시스템 (11)의 90 %를 차지) 표준 중극 설계 ICP-MS가 선택한 모든 전하 대 질량비를 통해 그 질량 검출기 사이클에서 순차적 질량 분석기 (m / z )이 아니라 동시에 데이터를 수집보다. 따라서, 대중의 각 사이클에 대한 획득 시간은 원하는 해상도의 화소를 나타내는 12 취득되도록 상기 레이저 빔 중 하나의 폭을 통과하는 시료에 걸리는 시간을 동일시한다. 레이저 빔 사이즈 선택 감도 총 분석 시간 모두에서 유의 한 효과가 중요한 파라미터이다. 레이저 어블 레이션 풍모로서캘리 아르곤 캐리어 가스에 의한 ICP-MS로 스위핑 물질을 물리적 질량 분석기로 검출 할 수있는 물질의 양이 역 제곱 법칙을 따른다 제거한다. 4 배에 의해 절제된 물질의 감소가 25 μm의 결과 - 예를 들어, (50)로부터의 레이저 빔 직경을 감소시킨다. 또한, 주사 ​​방법으로서, 작은 빔 직경은 선택된 영역 브레이션 필요한 총 시간을 증가시킨다. 따라서, 실험 설계 민감도 요구 및 시간 제약 필요한 공간 해상도 균형을 필수적이다. LA-ICP-MS에 의해 이미징 신경 장애 13, 14, 외상성 뇌 손상 (15), 태반의 금속 함유 항암제 16 독성 노출 분포의 동물 모델을 포함하여, 샘플 매트릭스 및 질환 상태의 범위에 적용된 (17)과 금속 DISTR초기 생활식이 전환의 바이오 마커로 치아 ibution. 이 쉽게 샘플 타입과 실험 결과의 범위로 구성 될 수 있지만,이 프로토콜 (18)은 우리의 요구에 기초하여, 30 ㎛의 해상도로 WT 마우스 뇌의 철, 구리 및 아연을 이미징하는 일반적인 방법을 설명 분석자.

<table><tbody><tr><td>소다 유리 현미경 슬라이드</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>일반적인 슬라이드는 모든 실험에 적합합니다:</td></tr><tr><td>PTFE 코팅 마이크로톰 블레이드</td><td>C.L. Stuckey</td><td>DT315R50</td><td>블레이드 크기는 저온 유지 장치 블레이드 홀더에 따라 다릅니다. 주문하기 전에 확인하십시오.</td></tr><tr><td>파라포말데히드 (PFA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>16005</td><td>적합한 모든 공급업체 적합한</td></tr><tr><td>자당</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>상업용 등급 백설탕이 적합합니다</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5368</td><td>사전 혼합 봉지 등재, 일반 실험실 프로토콜에 따라 준비 가능</td></tr><tr><td>크실렌 시</td><td>그마-알드리치</td><td>247624</td><td>적합한 모든 공급업체</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>모든 공급 업체 적합한</td></tr><tr><td>양고기 뇌</td><td>n / a</td> n <td>/ a</td><td>대부분의 지역 정육점에서 구할 수</td></tr><tr><td>있음 금속염</td><td>n / a</td><td></td><td>n / a 원하는 분석 물질을 함유 한 수용성 금속염 사용</td></tr><tr><td>Omni TH Tissue Homogeniser</td><td>Omni Inc</td><td>THP115</td><td>대체 균질화기는</td></tr><tr><td>적합한 폴리 카보네이트 균질화 프로브입니다.</td><td>Omni Inc</td><td>TH115-PCRH</td><td></td></tr><tr><td>마이크로파 소화 장치</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>선택 사항. 섹션 2</td></tr><tr><td>1.5mL 마이크로분리관</td><td>TechnoPlas</td><td>P4010</td><td>비금속 폴리프로필렌 튜브를 참조하십시오. 산성 세척 튜브도 적합합니다</td></tr><tr><td>: 65 % 질산</td><td>Merk Millipore</td><td>100441</td><td>미량 분석 등급</td></tr><tr><td>30 % 과산화수소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95321</td><td>미량 분석 등급</td></tr><tr><td>10 x 10 mm 일회용 cryomoulds</td><td>Ted Pella</td><td>27181</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76871</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>n / a</td><td>n / a</td><td>사용 현지 공급 업체</td></tr><tr><td>NWR213 Laser Ablation system</td><td>ESI Ltd</td><td>해당 사항 없음</td><td>이 실험에 사용됩니다. 다른 제조업체에 적합한 경우</td></tr><tr><td>프로토콜 Agilent 8800 Series ICP-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>n/a</td> 에 대한 수정이 필요할 수 <td>있습니다. 다른 제조업체가 적합하면 프로토콜</td></tr><tr><td>Iolite</td><td>Iolite Software</td><td>n/a</td><td>http://iolite-software.com/ 에서 사용할 수 있습니다. 다른 방법을 사용할 수 있습니다 :</td></tr><tr><td>프로토콜 Excel</td><td>Microsoft</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>IGOR Pro</td><td>Wave Metrics</td><td>n / a</td><td>Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm</td></tr></tbody></table>

유도 결합 플라즈마 - - 레이저 박리에 의한 뇌 조직의 이미징 금속 질량 분석 (la-icp-ms)

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

금속은 특정 해부학 적 영역 내에서 모두 화학적 반응성과 풍요에 의해 결정 생물학적 역할, 유기체 전체에 보편적으로 발견된다. 뇌 내 금속은 중추 신경계 내에서 재생 일차 함수에 따라 고 실형 분포를 갖는다. 금속의 공간 분포를 영상화하는 것은 신경 해부학 지역 및 금속에 의존하는 프로세스에 관한 자신의 알려진 기능 사이의 직접적인 상관 관계를 허용, 뇌의 생화학 적 구조에 고유 한 통찰력을 제공하고 있습니다. 또한, 여러 연령과 관련된 신경 학적 장애는 종종 다른 분석하기 어려운 뇌의 작은 영역에 국한되는 금속 항상성을 파괴 있습니다. 여기에서는 레이저 어블 레이션을 이용하여 정량적으로 마우스 뇌에서 금속을 묘화하기위한 광범위한 방법을 서술 - 유도 결합 플라즈마 - 질량 분석기 (LA-ICP-MS) 및 특수 설계된 화상 처리소프트웨어. 뇌 내에서 가장 많은 질병 관련 금속의 세 가지이다 철, 구리, 아연, 중심으로, 우리는 낮은 마이크로 미터 내에 금속 분포의 맵을 생성하기 위해 샘플 제조, 분석, 정량적 측정 및 화상 처리에서 중요한 단계를 설명 해상도 범위. 모든 잘라 조직 절편에 적용 가능한이 기술은, 기관 또는 시스템 내의 금속의 높은 변수 분포를 입증 할 수 있고, 미세 해부 구조 내의 금속 항상성 변화 및 절대 레벨을 식별하는 데 사용될 수있다.

이 LA-ICP-MS 이미징 방식의 기능을 설명하기 위해, 관상면에서 뇌량에 양분과 구분 WT C57BL / 6 마우스 뇌의 한 부분을 사용하여 간단한 실험을 제시한다. 분석 부 (도 2)에서의 금속 분포의 대표 화상을 제공 할뿐만 아니라, 단면 (6 및 7)에 기재된 Biolite (도 1)를 사용하여 데이터의 분석을위한 작업 과정도 설명한다. 알 수있는 바와 같이, 마우스의 뇌에서의 금속 분포의 해부학 적 부위에 따라 가변적이다. 이것은 가변 역할 금속에 기인 할 수 있으며,보다 구체적으로 단백질 이들이 결합되는 데, 각 뇌 영역 (27)에서 재생. 예를 들어, 철, 아연은 코르티에서 가장 풍부한 반면, 중뇌에서와 치아 이랑을 따라 높은 농도를 갖는 경향이있다칼 영역. 일반적으로 사용되는 내부 표준 8 탄소는 균일하게 분포한다. 금속의 colocalization을에 대한 정보는 특정 금속 - 결합 단백질의 발현은 뇌에서 금속의 함수에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 기존의 해부학 적 및 기능적 기준 도해 (29)와 함께 사용될 때 원소지도 (도 2)가 특히 유용 할 수있다 지역 또는 확인 된 질환 관련 생체 분자에 맞춰 금속 수준의 변화. 분석의 넓은 범위에 대해 최적화된다 기재된 방법을 사용하여, 망간 낮은 풍부 요소의 감도를 배제하지 및 방법은 다른 측정 된 질량의 비용 체류 시간을 증가시킴으로써이 피검 주로 수행하도록 구성 될 수있다. LA-ICP-MS에 의한 이미지를 사용하여의 주요 장점은 금속 CONCENTR 상대적 차이를 관찰한다ATION과 실험군 사이에 분포. 우리는 이전에 증가 PD (2), (10)을 흉내 낸 신경독의 모욕 다음 철, 인간의 알츠하이머 병 조직 (21)에서 대뇌 피질의 철 수준의 변화를 보여주기 위해 이러한 기술을 사용하고 있습니다. 여기에 기술 된 바와 같은 프로토콜을 용이하게 나열 방법 최소한 개정과 다른 조직 유형에도 적용 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55042/55042fig1.jpg" /> 그림 1 : 이미지 처리를위한 워크 플로우. 마우스 뇌의 금속 분포의 정량적 인 이미지로 ICP-MS에서 원시 시간이 해결 데이터의 변환을 묘사 섹션 6, 7, 보완 워크 플로우. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55042/55042fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </p&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55042/55042fig2.jpg" /> 그림 2 : 마우스 뇌에서 Biometals의 전형적인 원소 분포. LA-ICP-MS로 분석 한 번의 마우스 뇌 반구의 30 μm의 두께 코로나 섹션의 대표적인 요소지도. (맨 윗줄), 탄소 13 (C13), 마그네슘-24 (MG24)와 인-31 (P31)에 대한 이미지는 골드 컬러 저울 (CPS 초당 카운트)에 표시. 망간-55 (Mn55), 구리-63 (Cu63), 철-56 (Fe56) 및 아연 (66) (Zn66)에 대한 정량적 이미지 (아래 행)에 대응 BlueHot 색상 저울 (μg의 g-1)로 표시됩니다. 뇌 부 총 분석 시간은 약 5 시간이었다. 스케일 바 = 2 mm이다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55042/55042fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <strong&gt; 부가 코드 데이터 출력의 ICP-MS 제조업체의 방법에 따라 적절한 파이썬 편집기를 사용하여 수정할 수 있습니다 6.1에 설명 1. 오픈 소스 파이썬 코드를 파일. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55042/CopyFilesFromSubDirs_3.txt" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

정량적으로 레이저 어블 레이션에 의해 조직에 금속을 매핑 - 유도 결합 플라즈마 - 질량 분석 (LA-ICP-MS)는 금속이 정상적인 기능과 질병 과정에 참여하는 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수있는 민감한 분석 기술이다. 여기, 우리는 정량적 마우스 신경 조직의 얇은 섹션에서 금속 이미징을위한 프로토콜을 설명합니다.

유도 결합 플라즈마 - - 레이저 박리에 의한 뇌 조직의 이미징 금속 질량 분석 (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

본 방법의 전반적인 목표는 레이저 어블레이션 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry)을 사용하여 조직 절편 내 금속의 공간적 분포를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 기초 생물학 및 질병 연구, 특히 금속 생화학이 질병 병리와 연관된 상태에 관한 핵심적인 질문들에 답을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존의 일반적인 금속 분석 기술에서는 손실되었던 금속의 공간적 정보를 유지한다는 점입니다.이 기술의 영향은 신경퇴행성 질환의 치료 및 진단으로 확장되는데, 이는 세포 사멸이 나타나는 뇌 영역에서 금속이 어떻게 변화하는지 모니터링할 수 있게 해주기 때문입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 길고 복잡한 실험 과정을 설정하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 각 단계가 특정 순서대로 실행되어야 하므로, 실험 설계와 데이터 분석이 까다로울 수 있어 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.먼저, 뇌 조직 샘플과 모든 매트릭스 매칭 조직 표준물을 레이저 어블레이션 챔버에 넣습니다. 샘플이 LACCD 카메라의 피사체 심도 내에 있는지 확인하십시오. 챔버 문을 닫고 나사를 손으로 조여 고정합니다.그런 다음, ICPMS 소프트웨어에서 운반 가스 밸브를 열고 유량을 1.2 liters per minute로 설정하십시오. LA 소프트웨어에서 운반 가스를 사용하여 어블레이션 셀을 30분 동안 퍼지하십시오. 2배 부피의 어블레이션 셀의 경우, 셀 내의 잔류 공기량을 줄이기 위해 10분마다 샘플 스테이지를 챔버의 각 모서리로 이동시키십시오.ICPMS를 켜고 기기가 2시간 동안 예열되도록 합니다. 기기가 예열되는 동안, 레이저 절제 소프트웨어에서 첫 번째 조직 표준물질의 표면에 걸쳐 약 3mm 길이의 절제선을 그립니다. 절제선을 클릭하고 기본 빔 직경, 스캔 속도 및 복사 플루언스를 설정합니다.선을 6번 복제하고, 각 선 사이의 간격을 빔 직경만큼 띄웁니다. 각 표준 시료에 대해 이 과정을 반복합니다. 그런 다음, 표준 시료와 동일한 파라미터를 사용하여 선 도구를 이용해 샘플의 왼쪽 상단 모서리부터 샘플의 가장 넓은 지점을 가로지르는 어블레이션 영역을 그립니다.표준물질에 사용한 것과 동일한 간격을 유지하며 샘플 전체를 커버할 수 있도록 필요에 따라 라인을 복제하십시오. 그 다음, 샘플 스캐닝 후 20시간 이내 또는 각 샘플 사이에 표준물질의 간헐적 스캐닝을 위한 라인 세트를 그리십시오. 실험 마지막에 표준물질 스캔을 추가하십시오.선 길이와 스캔 속도를 바탕으로 시료 및 표준선에 대한 분석 시간을 결정하십시오. 그런 다음 ICPMS 소프트웨어에서 새로운 배치를 생성하고 시간 분해 분석을 선택하십시오. 관심 있는 질량 대 전하비 값을 선택하고, 한 사이클의 총 적분 시간이 0.25초가 되도록 각 비율에 대한 적분 시간을 설정하십시오.배치를 저장하십시오. 표준 배치의 경우, 레이저 예열 및 세척 시간을 고려하여 각 라인의 분석 시간에 15초의 버퍼 시간을 추가하여 입력하십시오. 각 표준 라인에 대한 획득 설정이 포함된 샘플 런 리스트를 설정하십시오.시료 배치의 경우, 표준 배치 설정을 복제한 후 시료 어블레이션 패턴에 맞춰 시간과 획득 횟수를 적절히 조정하십시오. ICPMS의 예열이 완료되면 첫 번째 배치를 큐에 추가하고, 소프트웨어가 LA 장비의 트리거를 기다리는 상태인지 확인하십시오. 그런 다음 LA 소프트웨어에서 레이저 전원 공급 장치를 켜고, 레이저 예열 및 워시아웃 시간을 설정하십시오.레이저 시퀀스를 시작하고, 어블레이션(ablation) 후 ICPMS가 데이터 수집을 올바르게 시작하는지 확인하십시오. 데이터 수집이 완료되면, CSV 파일에서 표준물질에 대한 데이터를 추출하십시오. 트랙션(traction)의 베이스라인을 수행하고, 배경 신호를 제외하십시오.조직 표준 시료의 구멍으로 인해 발생하는 신호 감소 지점을 식별하십시오. 이러한 저신호 영역을 마스킹한 다음, 데이터를 스프레드시트로 내보내십시오. 식별된 각 원소에 대해 CPS에서 PPM으로의 변환 계수를 계산하십시오.각 표준 시료에 대해 이 과정을 반복하십시오. 다음으로, 정량 이미지 구축 소프트웨어를 열고 CSV 파일에서 샘플 데이터를 가져옵니다. 배경 보정을 적용하기 위해 배경의 여러 영역을 선택하십시오.그래프 편집 도구를 선택하고 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음, 이미지 모양 수정(modify image appearance)을 선택하십시오. Z의 첫 번째 색상을 큰 음수 값으로 변경하고 완료(done)를 클릭하여 배경 신호를 강화하십시오. 그런 다음 표준물질(standards) 탭에서 각 표준물질에 대한 CPS PPM 보정 계수를 입력하고 시작(go)을 클릭하십시오.데이터 탭에서 데이터 브라우저를 열고, 보정된 이미지 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 후 'new image'를 클릭합니다. 이미지 외형 수정 창을 열어 컬러 테이블과 스케일을 설정합니다. 주석 추가 유틸리티를 사용하여 이미지에 컬러 스케일을 표시합니다.컬러 스케일 창에서 컬러 스케일을 조정합니다. 이미지의 색상 지정과 주석 달기가 완료되면, 이미지를 복사하여 다른 프로그램에 붙여넣거나 이미지 제작 소프트웨어에서 이미지를 내보냅니다. ROI 도구를 활성화하려면 분석 패키지에서 이미지 프로세싱을 선택하고 이미지를 지정하십시오.이미지 탭에서 ROI를 클릭하고 ROI 그리기를 시작하십시오. 관심 영역을 선택한 다음 ROI 완료를 클릭하십시오. 이미지 탭에서 통계를 클릭하여 ROI 데이터를 얻으십시오.각 ROI가 추가될 때마다 저장하면서 데이터를 스프레드시트에 복사하여 붙여넣으십시오. 필요에 따라 이 과정을 반복하십시오. 이 기술을 사용하여 야생형 생쥐 뇌의 금속 함량과 분포를 조사하였습니다.여기에서는 탄소, 마그네슘 및 인의 분포를 초당 카운트(counts per second)로 나타내었습니다. 망간, 구리, 철 및 아연에 대해서는 정량 영상이 제시되었습니다. 탄소 분포는 내부 표준물질로 사용되었습니다.철은 중뇌와 치상회에서 가장 풍부하게 나타났습니다. 아연은 피질 영역에서 가장 풍부했습니다. 이러한 이미지로부터 얻은 정보는 이후 금속 결합 단백질의 발현과 기능을 추적하는 데 사용될 수 있습니다. 숙달되면, 며칠에 걸쳐 진행되는 실험이라도 적절히 수행할 경우 한 시간 내에 준비할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 어블레이션 라인과 ICPMS 데이터 파일을 동기화하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후, 특정 단백질과 금속의 공국소화(colocalization)와 같은 추가 정보를 제공하기 위해 인접 절편에 대한 조직학적 염색과 같은 추가 방법을 수행할 수 있습니다. 저희는 처음에 파킨슨병 실험 모델에서 금속 수치가 어떻게 변화하는지 조사하고자 했을 때 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.이 방법은 신경퇴행에 대한 통찰을 얻는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 조직 및 다양한 생물학적 매질을 포함한 서로 다른 조직 유형과 질환 상태에도 적용할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 신경과학 분야의 연구자들은 인간 샘플과 질환 동물 모델 모두에서 금속 수치가 어떻게 변화하는지 조사할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 레이저 절제 ICPMS 실험을 어떻게 설정하는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.생물학적 물질을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 적절한 개인 보호 장구를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

레이저 박리 전기 분무 이온화 (LAESI)는 질량 분광법에 대한 대기 압력 이온 소스입니다. 이미징 모드에서 중간 적외선 레이저 프로브 조직 섹션 또는 biofilm에 걸쳐 분자의 배포판. 이 기술은 원래 실험 조건 하에서 수행 다양한 bioanalytical 연구에 대한 새로운 접근법을 제공합니다.

LAESI 질량 분석법에 의해 생물 학적 조직 및 Biofilms의 대기 압력 분자 이미징

출처: Hare, D. J., et.al.  레이저 절제에 의한 뇌 조직의 금속 이미징 - 유도 결합 플라즈마 - 질량 분석법(LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 레이저 절제 유도 결합 플라즈마-질량 분석법(LA-ICP-MS)을 사용하여 마우스 뇌 조직의 금속 분포를 시각화하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜에는 샘플 입자의 에어로졸을 생성하기 위한 레이저 절제, 고온 플라즈마에서 입자의 이온화, 질량 대 전하 비율로 이온을 분리하는 질량 분석법이 포함됩니다. 그런 다음 특수 소프트웨어를 사용하여 정량적 이미지를 생성하여 조직 내 금속의 공간 분포를 드러냅니다.

Laser Ablation-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry를 통해 마우스 뇌 조직의 금속을 시각화

디 트라 놀 (DT; 1,8 - 디 히드 록시 -9,10 - 온라인 dihydroanthracen -9 - 일) 이전에 작은 분자의 티슈 이미징 MALDI 매트릭스로서보고되었다;에서 내인성 지질의 MALDI 이미징 DT의 사용을위한 프로토콜 초고 해상도 극 - FTICR 악기에 긍정적 인 이온 MALDI-MS에 의한 조직 섹션의 표면은 여기에 제공됩니다.

푸리에에 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 이미징 매트릭스 디 트라 놀은 이온 사이클로트론 공명 질량 분석기를 변환

얇은 기관 및 종양 조직에서 수행 레이저 유도 분석 분광법을 성공적으로 하나님 기반의 나노 입자에서 발행 자연 요소와 인위적으로 주입 가돌리늄 (하나님을) 발견되었습니다. 화학 원소의 이미지는 100 μm의 양적 서브 밀리미터 감도의 해상도에 도달했습니다. 표준 광학 현미경과 설치의 적합성은 같은 생체 조직의 여러 이미지를 제공하기 위해 잠재력을 강조한다.

레이저 유도 내역 분광학 : 장기 조직에 나노 입자의 매핑 및 정량을위한 새로운 접근

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