머리와 목 편평 ​​세포 암에서 신경초 침략을위한 모델

이 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 두경부 편평암에서 신경주위 침습에 영향을 미치는 여러 치료 조건을 매우 높은 분석 성공률과 재현성으로 신속하게 평가하는 것입니다. 이 방법은 두경부암 세포 신경주위 침습에 영향을 미치는 요인이 무엇인지와 같은 두경부 종양학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 짧은 시간 내에 하나의 마우스에서 많은 수의 분석을 빠르고 재현성 있게 수행할 수 있다는 것입니다.

등뿌리 신경절 또는 DRG 절제 절차를 시작하기 전에, V-bottom 96-well plate의 최소 40 wells에 새로운 실온 매체를 추가합니다. 그런 다음 가는 가위를 사용하여 꼬리 뿌리에서 쥐 머리까지 척추를 따라 세로로 절개합니다. 그리고 천골 척추 아래의 조직을 가로로 나누어 척추의 양쪽을 두개골 기저부까지 절개합니다.

현미경으로 표본을 옮기고 저전력으로 척추의 경추 끝을 관찰합니다. 흰색 척수는 다양한 양의 척추 주위 근육과 연조직으로 둘러싸인 뼈 고리의 중간에 분명합니다. 미세한 스프링 가위를 사용하여 처음 2-3개의 척추체의 등쪽 또는 위쪽 측면을 분할합니다.

그런 다음 가위의 스프링 동작을 사용하여 이 초기 뼈 절단을 열어 척추체 절개가 정중선에서 발생하도록 합니다. 천골 척추를 향해 조금씩 계속 진행하며, 척추체의 복부 또는 아래쪽 측면에 동일한 절단으로 척추를 이등분합니다. 한쪽 반쪽을 옆으로 치우고 척추의 다른 절반을 척수가 제자리에 있는 멸균 플레이트에 앞면이 아래로 향하게 하여 옮깁니다.

그리고 두 개의 18 게이지 바늘을 사용하여 반가시의 양쪽 끝을 폴리스티렌 해부 플랫폼에 고정합니다. 다음으로, 더 좁은 경추 끝에서 시작하여 약 4개의 척추 높이에서 척수를 부드럽게 벗겨냅니다. 감각 신경이 DRG에 삽입되는 부위에서 미세한 집게로 주변 근막을 부드럽게 잡고 미세한 스프링 가위를 사용하여 이 근막과 다른 신경 조직을 다듬어 DRG를 해제합니다.

배율을 높이면 스프링 가위를 사용하여 말초 신경을 DRG에 최대한 가깝게 잘라 조직을 분리하고 근위 가지를 다듬습니다. 그런 다음 DRG에서 흩어진 신경 섬유 또는 근막 부착물을 잘라내고 분리된 조직을 96웰 V-바닥 플레이트의 한 웰에 넣습니다. 반고체 매트릭스 방울을 준비하려면 얼음에서 유리 웰 바닥판 하나를 작동 현미경 아래의 얼음 블록으로 옮깁니다.

10마이크로리터 이하의 피펫 끝을 45도 각도로 유리에 직접 놓고 1.5마이크로리터 매트릭스 방울을 유리에 조심스럽게 분배합니다. 매트릭스가 플레이트와 맞물릴 때 피펫 팁을 유리에서 천천히 멀리 이동합니다. 플레이트의 네 모서리 각각에 매트릭스 한 방울을 놓고 약 1분 동안 플레이트를 실온 표면으로 옮깁니다.

매트릭스가 약간 뻣뻣해지면 플레이트를 얼음 블록으로 되돌리고 닫힌 현미경 집게를 사용하여 왼손으로 DRG를 부드럽게 퍼냅니다. 오른손을 사용하여 신경 조직을 21게이지 바늘 끝으로 조심스럽게 옮기고 바늘을 사용하여 DRG를 매트릭스 방울의 중간에 부드럽게 삽입합니다. DRG는 바늘로 중앙 위치를 잡기 위해 매트릭스로 쉽게 분리되어야 합니다.

4개의 물방울 각각에 DRG 조각을 삽입한 후 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 3분 동안 넣습니다. 모든 DRG가 삽입되면 플레이트를 한 번에 하나씩 약간의 각도로 잡고 10% FBS가 보충된 4밀리리터의 DMEM을 플레이트에 천천히 추가하여 매체가 매트릭스 DRG 단위와 점차적으로만 접촉하도록 합니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 48-72시간 동안 더 넣습니다.

신경돌기가 매트릭스 가장자리까지 75% 이상에 도달하면 매트릭스 DRG 단위를 제거하지 않고 웰에서 배지를 흡인합니다. 그런 다음 200마이크로리터 피펫을 사용하여 부드러운 트리거와 함께 각 매트릭스 DRG 분석에 배지 1밀리리터당 5번째 세포에 3배 10을 2방울 떨어뜨립니다. 그리고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.

1시간 후, 유리 바닥 플레이트의 측벽을 따라 10% FBS가 포함된 DMEM 4ml를 부드럽게 첨가하고 다음 현미경 평가가 있을 때까지 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 매트릭스 액적 내에서 해부 및 배치된 후 분석의 모양은 여기에 표시된 매트릭스 내장 DRG와 유사해야 합니다. DRG는 완벽하게 둥글지는 않지만 매트릭스 액적 내 중앙에 있어 신경돌기가 360도로 자랄 수 있습니다.

도금 직후, 두경부의 편평 암세포는 기질 주위에 둘레 고리를 형성하고 다음 2-3일 동안 신경돌기를 따라 확장됩니다. 매트릭스만을 포함하는 빈 대조군 방울에 도금된 세포는 매트릭스 주위에서 활발하게 분열하지만 상단으로 들어가거나 확장되지 않습니다. 암세포의 신경주위 침입을 정량화하기 위해 분석 이미지는 1개의 수직선과 1개의 수평선을 통해 4개의 사분면으로 나뉩니다.

그런 다음 각 사분면에서 관찰된 각 신경주위 침입 확장에 대해 일련의 점수를 매겨 서로 다른 암 세포주 사이의 신경돌기를 따라 암세포 성장을 비교할 수 있습니다. 일단 숙달되면, 등뿌리 신경절 격리 기법은 제대로 수행된다면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안에는 압착 손상이 분석 실패의 가장 흔한 원인이므로 등쪽 신경절의 과도한 취급을 최소화하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 신경주위 침습의 메커니즘을 연구할 수 있으며, 잠재적으로 이러한 유형의 연조직 침범에 대한 표적 치료법의 개발로 이어질 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스에서 등쪽 뿌리 신경절을 해부하고 신경주위 침습을 검사하기 위한 분석을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.