Name: 겔의 표면에 성장 식물 뿌리의 가벼운 시트 형광 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 배우세요 겔 표면에서 성장하는 식물 뿌리의 광시트 형광 현미경 기법으로 장기간 3D 영상을 획득하는 방법을. Arabidopsis를 이용하여 뿌리 발생 동역학과 세포 내 단백질 위치를 연구할 수 있습니다.

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우리는 오디오 장비에 대한 중요한 읽기 / 볼 MATYAS Fendrych와 스테판 Stadlbauer 감사합니다. OpenSPIM에 기여하기위한 IST 오스트리아에서 MIBA 기계 공장에 감사합니다. 이러한 결과로 이어지는 연구는 REA 보조금 협정 N ° [291734]와 유럽 연구위원회 (프로젝트 ERC 2011에서 유럽 연합 (EU)의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2,007에서 2,013 사이)의 인민 계획 (마리 퀴리 작업)에서 자금을받은 -StG-20101109-PSDP).

이미징 1. 애기 배양 이전 <ol><li> 2.15 g MS-매체, 10g의 설탕, 0.97 g의 MES (2- (N의 -morpholino) 에탄 술폰산) 1 L의 DDH 2 O (더블 증류수를 추가하여 ½ MS 배지 (반 강도 무라 시게 및 스쿡 매체) 준비 ) 1 L 병에. KOH를 사용하여 5.8으로 산도를 조정합니다. </li><li> ½ MS 배지에 15g / L의의 젤란 검 추가, 121 ° C에서 20 분 정도 압력솥. </li><li> 약 2mm의 두께를 갖는 겔의 층을 만들 정사각형 페트리 접시 (245 X 245 × 25 ㎜)로 뜨거운 배지 30 ㎖를 붓는다. 요리는 매체가 응고 할 수 있도록 실내 온도까지 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 1 mL의 멸균 H 2 O가 유리 피펫 또는 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 씨앗을 들고 겔의 표면에 그들을 뿌리 포함하는 1.5 ML의 반응 관에 멸균 애기 씨앗을 넣습니다. 씨앗을 따로 따로 약 10mm를 놓습니다. 테이프로 플레이트를 밀봉합니다. </li><li> 4에서 24 시간 동안 플레이트를 인큐베이션° C (계층화). </li><li> 육일에 대한 빛의 120-140 μmol / 평방 미터 / s의 금액과 16/8 시간 일 / 밤주기에서 22 ° C에서 예 성장 인큐베이터에서 접시를 육성. 최대 10 일 이전 식물을 사용할 수있다. </li></ol> 2. 식물 시료 제조 방법 주 : 샘플 홀더 3D 인쇄되거나 손으로도 2c에 도시 된 기준을 사용하여 기계 공장에서 제조 될 수 있습니다. 3D 모델 파일은 보조 재료 (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl)에 제공된다. 재료 목록에서 3D 인쇄 주문에 대한 링크를 참조하십시오. <ol><li> 5g을 50ml의 ½ MS 배지를 함유하는 50 ㎖ 병으로 저 용융 아가, 121 ℃에서 20 분 동안 오토 클레이브를 추가한다. </li><li> 1.5 mL의 반응 튜브의 1 % 낮은 용융 아가로 오스 솔루션을 나누어지는. 4 ℃에서 저장은 (적어도 두 달 동안 사용될 수있다). </li><li> 80 ° C에서 1 %% 낮은 용융 아가로 오스의 나누어지는 용융하고 아래로 냉각 할 수33 ° C. </li><li> 초음파 장치의 샘플 홀더를 청소합니다. 70 % 에탄올로 샘플 홀더를 소독 및 멸균 물에 씻는다. </li><li> 메스를 사용하여 공장 주위에 젤을 잘라. </li><li> 평평한 주걱 블록을 들어 올리고 두 번째 주걱을 사용하여 샘플 홀더에 조심스럽게 밀어 넣습니다. </li><li> 100 μL 피펫을 사용하여 (33 ° C에서) 1 % 아가로 오스와 샘플 홀더에 젤을 접착제. </li><li> 10 μL 피펫을 사용하여 1 % 아가로 오스와 겔에 공장을 접착제. 잎이 젤이 적용되지 않습니다 있는지 확인 스테레오 현미경을 사용합니다. 관심 영역에 직접 젤을 배치하지 마십시오. </li><li> 건조에서 식물을 방지하기 위해 중단없이 작동합니다. 가능하면 1,000 μL 피펫 팁에 샘플 홀더를 삽입합니다. 캡으로 피펫 팁을 사용하여 공장이 위치한 샘플 홀더의 한쪽 끝을 통해 조심스럽게 밀어 넣습니다. </li><li> 피펫 팁 상자의 샘플 홀더를 넣고 필요하면 더 많은 식물을 준비합니다. 식물은 direc 될 수 있습니다TLY 군데 나 성장 인큐베이터에 다시 넣어. </li></ol> 3. 현미경을 설정 참고 : LED 조명 시스템은 맞춤형 램프입니다. LED가 링을 구축하는 데 필요한 기술적 인 세부 사항은 그림 3과 재료 목록에서 찾을 수 있습니다. 보드 설계를위한 보충 자료 파일 (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd)를 참조하십시오. <ol><li> 나사 또는 접착제 (예를 들면 양면 테이프)를 OpenSPIM X / Y / Z / θ 스테이지 아암의 하부 측의 LED 링. </li><li> 조정 가능한 전원 공급 장치 (0-30 V, 최대 2 A)와 LED 링을 연결합니다. </li><li> 원하는 빛의 강도에 전압을 조정합니다 (애기 장대, 120-140 μmol / m 2 / s의 그림 3D)입니다. </li><li> 70 % 에탄올로 샘플 챔버를 소독 및 멸균 물에 씻는다. </li><li> 벤젠 및 렌즈 청소 조직과 대물 렌즈를 청소합니다. 70 % 에탄올로 소독 대물 렌즈. </li><li> perfusi 연결일방향으로 배치 된 샘플 챔버 튜브. 옆에 연동 관류 펌프에 신선한 ½ MS 매체와 다른 빈 병이 포함 된 1 L 병을 넣습니다. 관류 한 튜브를 이용하여 시료 챔버의 하부 흡입구 배지 병을 연결한다. 다른 관류 튜브를 사용하여 사용되는 매체를 휴지통 빈 병 샘플 챔버의 상부 배출구를 연결합니다. </li><li> 1 mL / 분에 흐름의 속도를 설정합니다. 참고 : 샘플 챔버를 넘쳐하지 않으려면,이 유입보다 유출하는 것이 중요합니다. 어느 펌핑 속도를 증가 또는 유출에 대한보다 큰 내경을 가진 관을 사용한다. </li><li> 70 % 에탄올로 씻어 물 표면에 샘플 챔버에 배치하기 전에 그들을 건조시켜, 3mm 작은 사각형에 검은 색 플라스틱 호일을 잘라. </li><li> 샘플 홀더에서 피펫 팁을 제거하고 샘플 챔버에서 샘플 홀더를 삽입합니다. 새로 제조 된 샘플 홀더 무대 암에 맞지 않을 경우, 미세한 모래를 사용종이는 얇게 만들거나 너무 얇은 경우에 O 링 (∅ 6mm)를 사용한다. </li><li> 뚜껑을 만들려면 두 개의 50 × 25 밀리 조각으로 검은 색 알루미늄 호일을 잘라. 각 부분의 일 측면의 중간에 잘라 5mm합니다. 삼각형 들여 쓰기 (그림 1D)을 만들 접습니다. 샘플 홀더에 대향하는 삼각형 만입 시료 챔버의 상부에 뚜껑을 넣어 두 뚜껑 샘플 챔버를 닫는다. 식물의 잎은 뚜껑의 그늘에없는 것을 확인하고 조명 시스템으로부터의 광을받을 수 있습니다. </li><li> 보기의 분야에서 신흥 측면 루트를 배치하기 위해 X / Y / Z 회전 무대를 사용하여 관심 영역을 찾습니다. </li><li> 기록 전에 시스템은 적어도 15 분 동안 평형을 허용한다. </li><li> 설치 이미지를 획득. <ol><li> 3 μm의 Z-간격 (650 μm의)과 (217) 이미지의 스택을 설정하고 17 시간의 총 기간 동안 15 분 촬영 간격과 시간 경과를 설정합니다. 참고 :에 대한 자세한 설명서OpenSPIM 소프트웨어에 발견 할 수있는 방법을 운영하는 (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack). </li></ol></li><li> 기록 시작합니다. </li></ol>

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광 시트 형광 현미경 낮은 광독성 및 생리 상태에서 시료를 유지하면서, 높은 시공간 해상도의 대용량을 캡처하는 데 사용할 수있는 초고속 수집 속도를 결합하는 큰 장점을 갖는다. 밝은 장 현미경의 분해능은 공 초점 현미경 (9)의 것과 비교할 수있다. 그러나, 빛의 산란 및 흡수 개별적으로 여기 및 방출 경로를 따라 발생하여 전체 이미지 품질은 표면에 비해 불투명 조직 내부 상당히 낮을 수있다. 이러한 복잡화를 회피 한 세로축 샘플을 회전시키고 다른 방향에서 같은 부피를 관찰 할 가능성을 사용할 수있다. 그러나 이것은 예를 들어, 측면 뿌리는 더 많은 정보를 얻고없이 낮은 화질 결과 뒤에서 루트 및 이미지의 한면에 등장, 항상 유리하지 않다. 그러나, 회전은 주로 SAMP를 정확히 위치 시키는데 사용될 수있다가장 좋은 방법으로 제작. 대물 렌즈의 고전적인 수평 배열은 샘플 장착의 새로운 방법을 수 있습니다. 식물은 수직 위치에서 혜택을 누릴 수 있습니다. 장착 방법은 &quot;겔의 표면 상에&quot;, 여기서 제시하는 등의 겔 (24, 25) 내부에 루트를 내장 등의 다른 실장 방법에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. 1) 루트 시스템은 액체 매체와 직접 접촉한다. 샘플 챔버 연속적으로 새로운 배지를 제공하는 관류 시스템에 연결된다. 또한 신속하게 다른 미디어 또는 약물을 적용하는 샘플 챔버의 전체 부피를 교환 할 수있다. 그들은 실험실에서 성장하는 데 사용되므로 2) 이전에 준비 식물 성장 샘플링합니다. 식물은 형광 현미경으로 선택할 수 있으며, 단지 원하는 식물을 제조 할 필요가있다. 3) 식물이 접촉되지 않고 시료 홀더 페트리 접시에서 전송된다. 이에 따라 식물은 또한 그것이 성장에 incubato에서 성장 된 동일한 겔 개발할 수R 및 기계적 응력은 최소로 감소된다. 4) 검체의 도면 탁하고 시료와 검출 목적의 간격만으로 중간 굴절율과 서로 다른 다른 물질로 채워져 있기 때문에 광학 수차를 최소화된다. 장기간의 촬상을 수행하기 위해, 식물 조명 시스템은 식물의 광합성 활성을 보장하기 위해 필요하다. 대부분의 실험실에서 식물은 투명한 겔상에서 성장 뿌리가 빛에 노출되는, 즉. 이것은 그들의 환경에 서로 다른 반응을 일으킬 및 생화학 및 개발 (26, 27)의 변화를 유도 할 수있다. 루트 시스템에서 빛의 양을 줄이기 위해, 흑색 플라스틱 호는 물 표면과 블랙 알루미늄 박으로 이루어지는 뚜껑 샘플 챔버를 포함을 커버하는데 사용되었다. 식물에 도달 할 수 빛 뚜껑의 중앙 구멍을 통해 나뭇잎. 이 설정에서 배경 빛의 증가는 suggestin를 관찰되지 않았다적색 및 청색 LED로부터의 미광의 양이 크게 GFP 필터 및 차광 방식으로 감소 하였다 g. 그러면 카메라 배경 노이즈를 증가시키지 않고, 화상 취득 동안에 온 광을 유지시켰다. 샘플 홀더는 3D 프린팅을 위해 설계되었습니다. 시험 하였다 여러 플라스틱 샘플의 드리프트 결과 100 % 안정하지만, 소재의 선택이 매우 중요하다. 따라서, 수지를 사용하는 대신 또는 폴리에틸렌 (PEP)로드를 분쇄하여 샘플 홀더를 구축 할 것을 권장한다. 양면 조명계와 광 시트 현미경 설정을 사용하는 경우 샘플 홀더는 상기 회전 각도에 따라 광 시트 중 하나를 방해 할. 플레이트에서 공장을 떠서 동안 기계적 스트레스를 줄이기 위해 주걱의 평평한 각도를 사용합니다. 이 공장은 빠르게 건조하고 아주 처음 경험 공기 흐름 수 있습니다. 우와, 어떤 공기 초안 (빠른 동작, 에어컨 흐름을)하지 않도록하십시오가능하면 RK는 중단없이하고 1,000 μL 피펫 팁에 샘플 홀더를 밀어 넣습니다. 현미경 내부는 액체의 전체 공장을 찍어 마른 잎을 유지하지하기 위해 매우 중요합니다. 이 기술은 측면 루트 형성의 초기 단계의 촬상에 적합하다. 성숙한 뿌리 끝의 장기 이미징을 수행 할 때 하나는 애기 장대의 뿌리가 시야에서 빠른 속도로 100 ~ 300 μm의 / h로 성장할 것을 명심해야합니다. 매우 유용한 미래의 구현은 시간의 연장 기간 동안 다음과 같은 뿌리 끝의 성장을 허용하는 자동화 된 추적 알고리즘이 될 수 있습니다. 획득 프로세스 동안 이러한 빛의 영양 배지 조성 등의 환경 조건을 제어 할 수있는 능력은 식물 변화에 적응하는 방법을 조사 할 수있다. 루트 (28)는 유도 덱사메타손 또는 β-ESTR 등을 사용하여 화학적으로 유전자 발현을 활성화하는 약물을 적용 할 수있는 액체 매질과 직접 접촉유도 시스템 (29) adiol. 그러나, 약물을 씻어 샘플 챔버의 전체 볼륨을 교환하는 시간이 걸린다. 셋업 매체 교환을 촉진하기 위해 샘플 챔버의 체적을 최소화함으로써 개선 될 수있다. 그럼에도 불구하고,이 기술은 큰 잠재력을 가지고있다. 장착 순서, 표준 성장 조건 및 광 시트를 현미경을 사용하여 부드러운 이미지 획득의 결합은 생리적 수준의 고해상도 식물 개발 장기 연구를 허용한다. 이 식물 개발의 기본 메커니즘을 탐구하는 연구자 도움이 될 것입니다.

하나의 세포가 장기의 분화와 성장하는 동안 어떻게 행동하는지 이해 공장 개발의 핵심 질문 중 하나입니다. 이상적으로는, 유전자의 발현 패턴과 세포 내 단백질 위치 파악 등 셀룰러 이벤트는, 조직의 확대 상황에 비추어 볼 수있다. 이 목적은 기술 문제를 제기하고 높은 공간과 전체 장기 관찰뿐만 아니라 사진 독성 효과를 일으킬 수 있습니다 시간의 연장 기간 동안 시간 해상도를 필요로한다. 식물이 환경 변화에 빠르게 적응하기 때문에, 성장 조건은 엄격하게 제어되어야한다. 식물의 생리적 상태를 방해하지 않으면 장기간의 촬상을 수행하기 위해, 세 가지 샘플 챔버에서, 1)의 성장 조건을 확보 할 수있다, 2) 안정 장시간 장착 샘플, 3), 촬상 낮은 조명 강도와 사진의 손상 및 비 생리적 조건을 방지 할 수 있습니다. 생리 성장 컨디셔닝현미경 시료 챔버의 기능이 장기간 실험 중요하다. 3 - 공 초점 현미경 (1)에 대해 촬상의 성장 챔버를 설명 가능한 프로토콜들이있다. 그러나, 공 초점 현미경은 스트레스 반응을 일으킬 수있는 식물, 높은 광 강도를 소개하고 일반적으로 4 성장을 억제한다. 또한 대부분의 기존의 현미경은 그들 자신의 방향을 중력의 벡터으로 성장하려고하기 때문에 식물을위한 최적하지 않은 샘플의 수평 위치 할 수 있습니다. 9 - 지난 10 년 동안, 빛 시트 현미경은 몇 일 5까지의 기간에 대한 세포 해상도에서 큰 표본의 개발을 캡처 할 수있는 강력한 도구로 떠오르고있다. 빛 시트 현미경 수직 표본의 위치를 허용하고 점점 루트 개발 (10) 연구 식물 연구에 사용되는 - 최근 베르트 검토 (21),t과 Maizel 22. 언급 된 연구 중 많은 10,13 - 18,21 최적화 샘플의 특별한 방법을 채용 에른스트 HK Stelzer의 실험실에서 수행 하였다는 겔 (17)의 표면에 뿌리를 성장하는 것을 특징으로 실장. 이 연구에서, 주문 제작 현미경이있는 공장은 바닥에서 개최, 사용되었다. 반대로, 널리 사용 가능한 광 시트 현미경의 대부분은 상부로부터 샘플을 잡아. 따라서, 특정 제조 방법에 용이하게 적용 할 수 없다. 여기에 제시된 방법은 OpenSPIM (23), 적용하고 선택적 평면 조명 현미경 (SPIM)을 향상시키기위한 오픈 액세스 플랫폼에 적용 할 수있는 잘 확립에 표면 장착 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜의 전반적인 목적은 OpenSPIM 광 시트 현미경 애기 뿌리 장기 촬상을 가능하게하는 것이다. 이것은들에 똑바로 식물 성장에 의해 달성된다액체 배지에서 뿌리 겔 urface는 나뭇잎이 공중에 남아있다. 식물의 광합성 활성을 보장하기 위하여, 맞춤형 조명 시스템 잎 아닌 루트 (도 1)을 조명한다.

<table><tbody><tr><td>아가로스, 저융분</td><td>VWR</td><td>AFFY3282125GM</td><td></td></tr><tr><td>블랙 알루미늄 호일</td><td>Thorlabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>블랙 플라스틱 호일</td><td>Carl Roth</td><td>HT83.2</td><td></td></tr><tr><td>LED 블루 (453 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LD&nbsp; CN5M-1R1S-35-1</td><td></td></tr><tr><td>LED 빨간색(625nm)</td><td>OSRAM</td><td>LR T66F-ABBB-1-1</td><td></td></tr><tr><td>LED 보드 - PCB 설계 소프트웨어</td><td>Cadsoft Eagle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES 일수화물</td><td>Duchefa</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>미세공 수술 테이프</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Medium (MS-Medium)</td> <td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>샘플 홀더 3D 프린트</td><td>i.materialise</td><td><a href="https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1">https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1</a></td><td></td></tr><tr><td>Square 페트리 접시 (245 x 245 x 25 mm)</td><td>VWR</td><td>734-2179</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>84097-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

겔의 표면에 성장 식물 뿌리의 가벼운 시트 형광 현미경

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

식물 발달을 이해하는 데 있어 중요한 질문 중 하나는 단세포가 조직의 더 큰 맥락에서 어떻게 행동하는가 하는 것입니다. 따라서 장기간에 걸쳐 높은 공간 및 시간 해상도로 전체 장기를 관찰해야 하며, 이는 광독성 효과를 유발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 광시트 현미경 검사를 위한 식물 시료 전처리 방법을 보여주며, 이는 식물을 겔 표면에 수직으로 장착하는 것이 특징입니다. 식물은 잎이 공기 중에 남아있는 동안 뿌리가 액체 매체에 잠기는 방식으로 장착됩니다. 식물의 광합성 활동을 보장하기 위해 맞춤형 조명 시스템이 잎을 비춥니다. 뿌리를 어둠 속에 유지하기 위해 물 표면은 검은 색 플라스틱 호일로 덮여 있습니다. 이 방법을 사용하면 표준화된 조건에서 식물 기관 발달을 장기간 이미징할 수 있습니다.

밝은 장 현미경 (도 1)과 뿌리 조직을 관찰하면서 시료 전처리 방법은, 현미경의 샘플 챔버 내부의 식물의 재배 할 수있다. 식물은 맞춤 설계 샘플 홀더 (도 2)에 장착 된 겔 (½ 1.5 % 젤란 검을 함유하는 MS 배지)의 층의 표면 상에 성장한다. 샘플 홀더는 3D 재료로서 투명 수지를 사용하여 인쇄된다. 크기를 강조 제조 버전도 2c에 도시되어있다. 뿌리는 지속적으로 관류 시스템에 의해 새로 고쳐 액체 (½ MS 배지)에 담근다. 잎은 공기에 남아 계속 /이 식물 (그림 1A, B 그림 3A-C) 위의 링으로 배열되어 파란색과 빨간색의 LED에서 나오는 s의 130 μmol / ㎡ 크기의 광 강도 조명. LED가 링은 우리의 기계 공장에서 제조되며,우리는 그림 3과 재료 목록의 LED 링을 구축하는 방법에 대한 기술 정보를 제공합니다. 광 강도가 연속적으로 30 내지 250 μmol / ㎡ / s (도 3d)에 이르기까지 조정될 수있다. 루트 시스템은 물 표면을 덮는 블랙 플라스틱 포일의 작은 시트 (도 1)에 의해 차광된다. 검출 렌즈에 의해 수집 된 조명에서 어떤 미광은 GFP 필터 (그림 3E)에 의해 필터링된다. 이 설정으로, 성장 애기 측면 루트의 시간 경과는 20X / 0.5 렌즈 (그림 4)를 사용하여 17 시간 동안 기록되었다. 측면 루트는 기본 루트 내부 깊이있는 pericycle 세포 층에서 그 기원을 가지고있다. 연장 시간 동안 조직의 내부에도 깊은 촬상 기능을 설명하기 위해, 더 높은 배율 (40X / 0.75) 측면 RO의 형성을 캡처하는 데 사용 된OT 제 1 스테이지에서 primordium까지 38 시간 (도 5)의 시간 내에 기본 루트 중에서 출현. 데이터 세트의 예시적인 2D 슬라이스는도된다. 5B. 이 기록은 셀룰러 해상도로 3D (그림 5A)의 측면 루트 형성의 역학을 따라 우리를 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig1.jpg" /> 그림 1 : OpenSPIM 샘플 챔버 내부 조건을 성장. A) 이미징 챔버의 스케치입니다. 이 공장은 겔의 표면에 수직으로 성장하고있다 (참조 또한 그림 2) 사용자 정의 내장 샘플 홀더에 장착. 뿌리는 지속적으로 관류 시스템에 의해 교환되는 액체 배지에서 성장하고있다. 식물은 공기에서 성장하고 빨간색과 파란색의 LED (또한 그림 3 참조)에 의해 조명하는 단풍. 루트 시스템은 재치 음영 처리<html> 물 표면을 덮는 검은 색 플라스틱 호일 h의 작은 시트. 블랙 알루미늄 호일의 두 조각으로 이루어지는 덮개는 상기 수면 아래 빛의 양을 감소시키고 샘플 챔버의 습도를 유지한다. 오른쪽 확대 패널은 액체 매질에 침지 겔 블록의 표면에 성장하는 식물을 강조한다. 아가 방울 겔 상 루트 마운트. 점선 상자가 현미경으로 관찰하여 관심 영역을 나타냅니다. 뚜껑이없는 촬상 실 (의 B)의 사진). 숫자 (1) - (10) A와 B의 대표 (1) : LED 링 X / Y / Z / θ 스테이지 (2)의 샘플 홀더 (3) : 뚜껑 (4) : 애기 장대 (5) : 관류 시스템 (7) : 검출 대물 렌즈 (8) 액체 배지, (9) : 시료 챔버 (10)의 조명 대물 렌즈 검은 플라스틱 포일 (6)의 시트. C) 뚜껑 검정색 알루미늄 호일의 두 부분으로 이루어진다.<html> 대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig2.jpg" /> 그림 2 : 샘플 홀더. A) 3D 모델. 3D 모델 파일은 보조 재료에 제공된다. 투명 아크릴 수지로 (4) 및 (5) : 수지 (6)을 투명 수지 (3) - (1) 서로 다른 재료를 이용하여 3 차원 프린트 B)의 사진. C) 샘플 홀더의 기술 도면, 숫자는 mm 나타냅니다. 공장에 제조 된 샘플 홀더 D) 사진은 장착. 점선 영역은 현미경으로 관찰 할 수있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> / 55,044 / 55044fig3.jpg &quot;를 업로드 /&gt; 그림 3 : 공장 조명 설치. 램프 A) 회로도. LED가 쌍 방향 번개에 대해 개별적으로 온 / 오프 전환 할 수 있습니다. LED : 발광 다이오드, R : 저항, T : 트랜지스터, JP : 핀 머리. 인쇄 회로 기판) : B), 조명 램프의 최종 설계가 PCB와 소프트웨어 (PCB를 사용하여 그려졌다. 우리는 보충 자료의 보드 디자인 파일을 제공합니다. 이 보드는 제조 및 우리 연구소의 MIBA 기계 공장에서 조립되었다. LED가 링의 C) 사진은 스위치. 빨간색과 파란색 LED의 네 쌍의 반지에 배치되어있다. D)의 전압의 범위는 3.5 V와 14.0 V. 저항력 사이에서 조정될 수는 30 내지 250 μmol / m에 이르는 빛의 양에 도달하는 데 사용 된 2 / 초 (R1-8 : 220 옴, R9-12 : 1,220 옴 ). E) 램프, GFP 및 YFP의 발광 스펙트럼.<html> TP : //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig4.jpg" /> 그림 4 : 애기 장대의 시간 경과 기록 장대 측면 루트. 5 일 이전 종묘는 막 마커 (pUBQ10 :: YFP-PIP1를 4) 표현과 핵 기자 (pGATA23 : NLS-GUS-GFP)을 특히 측면 루트로 발전 세포 pericycle 표시. (217) 영상 (3 μm의 Z-간격)의 스택은 20 배 / 0.5 렌즈를 사용하여 17 시간 녹화 매 15 분 체포됐다. A) (69) 중 4 시점이 최대 강도 투영에 나타낸다. B) 한 시점의 Z-스택의 식스 (217) 중 하나의 조각이 표시됩니다. A와 B의 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다.로드 / 55044 / 55044fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig5.jpg" /> 그림 5 : 애기 장대의 시간 경과 기록 장대 측면 루트. 6 일 이전 종묘는 막 마커 (pUBQ10 :: YFP-PIP1를 4) 표현과 핵 기자 (pGATA23 : NLS-GUS-GFP)을 특히 측면 루트로 발전 세포 pericycle 표시. 200 이미지 (1.5 μm의 Z-간격)의 스택은 40X / 0.75 렌즈를 사용하여 38 시간 녹화 매 15 분 체포됐다. A) 네 시점의 3D 렌더링 그리드 안의 숫자는 메인 루트의 중심면으로 μm의, B) 단일 슬라이스를 나타낸다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig5large.jpg" target="_blank">부디</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. 3D 모델 파일이 제공된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 파일 링 Board.brd을 LED. 기판 설계 파일이 제공된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 광시트 현미경 검사를 위한 식물 샘플 준비 방법을 보여줍니다. 이 설정은 식물을 젤 표면에 수직으로 장착하고 통제 된 밝은 조건에서 자라도록하는 것이 특징입니다. 이를 통해 표준화된 조건에서 식물 기관 발달을 장기간 관찰할 수 있습니다.

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

이 절차의 전반적인 목표는 라이트시트 현미경(light sheet microscopy)을 사용하여 식물 뿌리 시스템의 장기 관찰 데이터를 획득하는 것입니다. 이를 위해서는 완만한 시료 준비 방법, 제어된 성장 조건, 그리고 라이트시트 현미경과 같이 식물의 발달에 영향을 주지 않는 이미징 기술이 필수적입니다. 우선, 식물을 2 mm 두께의 얇은 겔 층 표면에서 성장시킵니다.그 후 Arabidopsis 유묘가 포함된 겔을 잘라내어 떠낸 다음, 현미경 시료 홀더로 옮깁니다. 현미경 내부에서 식물은 자연스러운 직립 상태로 성장합니다. 뿌리는 액체 배지에서 자라며, 잎은 공기 중에 노출된 상태를 유지합니다.조명 시스템은 잎 부분만 비춥니다. 뿌리를 암실 상태로 유지하기 위해 수면을 덮어줍니다. 뿌리를 겔 내부에 매립하는 방식과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점 중 하나는 식물을 겔 표면에서 배양하는 방식에 익숙하다는 점입니다.따라서 이전과 동일한 배양 프로토콜을 그대로 사용할 수 있습니다. 둘째로, 뿌리가 액체 배지와 직접 접촉하고 있어, 예를 들어 약물 처리 시 배지를 교체할 수 있습니다. 1.5% phytogel이 포함된 갓 고압증기멸균한 0.5배 농도 MS 배지 30 milliliters를 사각 페트리 접시에 부어 약 2 millimeters 두께의 층을 만듭니다.멸균된 종자를 최소 1cm 간격을 두고 나란히 파종하십시오. 그 다음, 플레이트를 마이크로포어 테이프로 감쌉니다. 성장 인큐베이터 내에서 플레이트를 수직으로 세워 최대 10일 동안 배양하십시오.본 실험에서는 6일 된 식물을 사용하여 측근의 발달을 관찰합니다. 샘플 홀더의 3D 프린팅을 위한 모델을 제공하며, 다양한 재료를 테스트하였습니다.투명 수지가 강성과 내수성 측면에서 가장 적합했습니다. 고체 재료로 샘플 홀더를 가공하기 위한 상세 치수는 원고에 기술되어 있습니다. 메스를 사용하여 식물 주변의 겔을 절단하십시오.그런 다음, 식물이 자라고 있는 겔 블록을 떠서 샘플 홀더로 조심스럽게 옮깁니다. 1% agarose를 80 °C에서 녹인 후 33 °C까지 식힙니다. 겔 블록을 샘플 홀더에 접착시키고, 겔 위의 식물을 조심스럽게 고정합니다.실체 현미경을 사용하여 식물의 위치를 확인하고, 관심 영역이 겔에 의해 가려지지 않았는지 확인하십시오. 식물이 마르는 것을 방지하기 위해, 가능한 경우 샘플 홀더를 1,000 µL 피펫 팁 위에 밀어 넣으십시오. 홀더를 피펫 박스에 넣고 필요한 경우 더 많은 샘플을 준비하십시오.당사에서 사용하는 현미경은 주요 수정 사항이 없는 전형적인 open-spin 모델입니다. 현미경 내부에서 식물을 배양할 수 있도록 조명 시스템을 구축하였습니다. 적색 및 청색 LED가 링 형태로 배치되어 있습니다.방향성 조명을 위해 LED 쌍을 개별적으로 켜거나 끌 수 있습니다. 조명 시스템의 스펙트럼은 당사의 배양기 스펙트럼과 일치합니다. LED에서 나오는 거의 모든 빛은 GFP용 방출 필터에 의해 차단됩니다.카메라에 도달하는 미산란광이 검출되지 않았습니다. 따라서 이미징 중에 조명을 켠 상태로 유지할 수 있습니다. 빛의 강도는 30에서 250 micro moles per meter squared per second 범위 내에서 조절 가능합니다.LED 링을 개방형 스핀 스테이지 암의 하단에 나사로 고정하거나 접착제로 붙입니다. 이를 다시 현미경에 장착하고 전선을 연결합니다. 프로퓨전 시스템을 조립합니다.튜브를 일방향 배열로 샘플 챔버에 연결합니다. 속도를 분당 1 mL로 조정합니다. 3 mm 크기의 정사각형으로 자른 멸균 검정 플라스틱 호일을 추가하고 이를 수면에 분산시킵니다.시료를 현미경에 삽입합니다. 시료 홀더에 플라스틱 시트가 붙어 있지 않은지 확인합니다. 검은색 알루미늄 호일로 만든 두 개의 덮개로 챔버를 닫습니다.조명을 켜고 빛의 세기를 조절합니다. 실내 조명을 끄고 녹화를 시작합니다. 이 방법은 측근의 성장에서 볼 수 있듯이 수 시간에서 수 일에 걸친 뿌리의 성장을 기록할 수 있게 해줍니다.단일 시점의 z-stack 이미지는 우수한 광학 단층 촬영 특성을 보여줍니다. 우리는 측근 형성의 전체 과정을 3D로 캡처하였으며, 이를 통해 해당 과정의 역학을 연구할 수 있습니다. 이 기록의 단일 슬라이스를 살펴보면 뿌리 깊은 곳에서도 우수한 해상도를 확인할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면 라이트 시트 현미경(light sheet microscopy)을 위한 식물 시료 준비 방법을 명확히 이해하게 될 것입니다. 이 프로토콜을 통해 이제 우리는 기관 형성, 식물의 굴성 또는 식물의 적응 과정 중 세포 내 단백질 국소화나 유전자 발현 패턴을 관찰할 수 있습니다. 이는 식물 발달의 시공간적 조절을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 가까이 높은 콘트라스트와 시간적 해상도의 세포 표면 구조를 관찰하기위한 강력한 방법입니다. 우리는 TIRF은 세포 벽 - 동봉된 세균과 곰팡이 세포의 피질에서 단백질 역학을 공부 고용 수있는 방법을 보여줍니다.

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여기에는 높은 수치의 조리개 목적과 침지 매질로서의 퍼플 루오로 데칼린을 사용하여 최대 3 일 동안 뿌리 및 배축 발달의 고해상도 공 초점 저속 이미징을위한 간단한 기술이 제시됩니다.

뿌리와 배설물 개발의 장기 공 촛점 이미징을위한 단순한 챔버

광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

이 문서에서는 기본 루트 및 루트 머리카락 하나의 광학 평면을 제한 하는 2 층 미세 플랫폼에서 애기 thaliana 묘 문화 하는 방법을 보여줍니다. 이 플랫폼은 다른 방법으로 고해상도 영상 뿐만 아니라 좋은 루트 형태학의 실시간 광학 영상에 대 한 사용할 수 있습니다.

2 층 미세 플랫폼에서 애기 모종의 루트 머리 형태를 이미징

지 베 렐 린 인식 센서 1 (GPS1)는 첫 번째 포스터 공명 에너지 전송 기반 바이오 센서 측정 지 베 렐 린 phytohormones spatiotemporal 고해상도 세포 수준 이다. 이 프로토콜은 시각화 하 고 애기 hypocotyls 및 루트 팁 유전자 인코딩된 nlsGPS1 바이오 센서를 사용 하 여 셀룰러 지 베 렐 린 레벨 계량 방법에 보고 합니다.

머릿속 세포 지 베 렐 린 레벨 NlsGPS1 포스터 공명 에너지를 사용 하 여 전송 (무서 워) 바이오 센서

이 프로토콜은 대량 분광화상 이미징과 결합된 박막(DGT)의 확산 그라데이션을 사용하여 다중 음순 무기 영양소 및 오염 물질 용성 종의 하위 mm 2D 시각화를 위한 워크플로우를 제공합니다. 솔루트 샘플링 및 고해상도 화학 분석은 지상 식물의 뿌리 부피에서 솔틸테의 정량적 매핑을 위해 자세히 설명된다.

토양의 2차원 시각화 및 래빌, 무기 식물 영양소 및 오염 물질의 정량화

세포외 글루타메이트 트리거 전신 칼슘 신호는 식물의 기계적 상처 및 초식 공격에 대한 식물 방어 대응의 유도에 매우 중요합니다. 이 문서에서는 칼슘과 글루타민염에 민감한 형광 바이오 센서를 표현하는 아라비도시스 탈리아나 식물을 사용하여 이러한 두 요인의 공간 적 및 측두동을 시각화하는 방법을 설명합니다.

아라비도시스에서 지역 및 전신 상처 신호의 넓은 필드, 실시간 이미징

이 원고는 살아있는 이끼 조직의 3D 세포벽 역학을 이미지화하는 상세한 프로토콜을 제시하여 장기간에 걸쳐 발달하는 동안 ggb 돌연변이에서 세포벽의 분리와 야생형의 세포벽 패턴을 두껍게 시각화할 수 있습니다.

이끼 피스코미트리움 파텐스에서 칼코플루오르를 사용한 세포벽 역학의 3D 타임랩스 이미징

배우세요 겔 표면에서 성장하는 식물 뿌리의 광시트 형광 현미경 기법으로 장기간 3D 영상을 획득하는 방법을. Arabidopsis를 이용하여 뿌리 발생 동역학과 세포 내 단백질 위치를 연구할 수 있습니다.

겔의 표면에 성장 식물 뿌리의 가벼운 시트 형광 현미경

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