겔의 표면에 성장 식물 뿌리의 가벼운 시트 형광 현미경

이 절차의 전반적인 목표는 광시트 현미경을 사용하여 식물 뿌리 시스템을 장기간 관찰하는 것입니다. 이를 위해서는 부드러운 시료 전처리 방법, 제어된 성장 조건, 광시트 현미경과 같이 식물 발달을 변경하지 않는 이미징 기술이 필수적입니다. 우선, 식물은 2mm 두께의 젤 층의 표면에서 자랍니다.

그런 다음 Aribidopsis 묘목이 있는 겔을 잘라내고 퍼서 현미경 샘플 홀더로 옮깁니다. 현미경 안에서 식물은 자연스러운 직립 자세로 자랍니다. 뿌리는 액체 매체에서 자라며 잎은 공기 중에 남아 있습니다.

조명 시스템은 나뭇잎만 비춥니다. 뿌리를 어둠 속에 유지하기 위해 물 표면을 덮습니다. 겔 내부에 뿌리를 삽입하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점 중 하나는 겔 표면에서 식물을 재배하는 데 사용된다는 것입니다.

따라서 우리는 이전과 동일한 성장 프로토콜을 고수할 수 있습니다. 둘째, 뿌리는 예를 들어 약물 치료로 교환 될 수있는 액체 매체와 직접 접촉합니다. 정사각형 페트리 접시에 1.5%의 피토겔을 함유한 갓 오토클레이브 처리된 절반 강도 MS 배지 30ml를 부어 약 2mm의 층을 만듭니다.

멸균 씨앗을 그 사이에 최소 1cm의 공간을 두고 나란히 파종합니다. 그런 다음 마이크로 포어 테이프로 플레이트를 감쌉니다. 성장 인큐베이터에서 플레이트를 최대 10일 동안 수직으로 배

이 실험에서는 6일 된 식물을 사용하여 측근의 발달을 관찰합니다. 샘플 홀더를 3D 프린팅하기 위한 모델을 제공합니다. 우리는 다양한 재료를 테스트했습니다.

투명 수지는 강성과 내수성 측면에서 가장 적합했습니다. 고체 물질에서 샘플 홀더를 가공하기 위한 치수에 대한 자세한 설명은 원고에 설명되어 있습니다. 메스를 사용하여 식물 주위의 젤을 자릅니다.

그런 다음 식물이 자라고 있는 젤 블록을 떠서 샘플 홀더에 조심스럽게 끼워 넣습니다. 섭씨 80도에서 1% 아그로를 녹이고 섭씨 33도로 식힙니다. 젤 블록을 샘플 홀더에 붙이고 젤에 식물을 조심스럽게 붙입니다.

실체 현미경을 사용하여 식물의 위치를 확인하고 관심 영역이 젤로 덮여 있지 않은지 확인하십시오. 식물이 건조되는 것을 방지하기 위해 가능하면 샘플 홀더를 1, 000 마이크로리터 피펫 팁에 밀어 넣으십시오. 홀더를 피펫 상자에 넣고 필요한 경우 더 많은 샘플을 준비합니다.

우리의 현미경은 큰 수정이 없는 고전적인 오픈 스핀입니다. 우리는 현미경 내부에 식물을 배양하기 위한 조명 시스템을 구현했습니다. 빨간색과 파란색 LED가 링으로 배열되어 있습니다.

한 쌍의 LED는 방향성 조명을 위해 개별적으로 켜고 끌 수 있습니다. 조명 시스템의 스펙트럼은 성장실의 스펙트럼과 일치합니다. LED에서 나오는 거의 모든 조명은 GFP용 방출 필터에 의해 차단됩니다.

카메라에 도달하는 미광을 감지할 수 없었습니다. 따라서 이미징하는 동안 조명을 계속 켜둘 수 있습니다. 광도는 초당 제곱미터당 30에서 250마이크로 몰까지 조정할 수 있습니다.

오픈 스핀 스테이지 암의 아래쪽에 있는 LED 링을 나사로 조이거나 붙입니다. 현미경에 다시 장착하고 전선을 연결합니다. 풍력 시스템을 조립하십시오.

튜브를 단방향 배열로 시료 챔버에 연결합니다. 속도를 분당 1밀리리터로 조정합니다. 멸균 된 검은 색 플라스틱 호일 3 밀리미터 사각형을 추가하고 물 표면에 분배하십시오.

샘플을 현미경에 삽입합니다. 샘플 홀더에 붙는 플라스틱 시트가 없는지 확인합니다. 검은색 알루미늄 호일로 만든 두 개의 뚜껑으로 챔버를 닫습니다.

조명을 켜고 조명 강도를 조정하십시오. 실내 조명을 끄고 녹음을 시작합니다. 이 방법을 사용하면 몇 시간에서 며칠에 걸쳐 뿌리 성장을 기록 할 수 있으며, 여기에는 측면 뿌리의 성장에 의해 표시됩니다.

단일 시점의 z-스택 이미지는 우수한 광학 단면 특성을 보여줍니다. 우리는 측면 뿌리 형성의 전체 과정을 3D로 캡처하여 이 과정의 역학을 연구할 수 있습니다. 이 녹음의 한 부분을 보면 루트 내부 깊숙한 곳에서도 좋은 해상도를 볼 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 광시트 현미경을 위한 식물 시료 전처리 방법을 명확하게 이해할 수 있을 것입니다. 이 프로토콜에 따라 우리는 이제 유기 발생, 식물 영양 또는 식물 적응 중 세포 내 단백질 국소화 또는 유전자 발현 패턴을 볼 수 있습니다. 이것은 식물 발달의 시공간적 조절을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.