Name: 사후 인간의 두뇌 기증자로부터 Leptomeninges 이식편 문화의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: 배우세요 사후 인간 두뇌의 leptomeninges에서 explant 배양법을 이용해 fibronectin 양성 meninges 섬유아세포를 유도하는 방법을. 파킨슨병 환자의 세포주를 연구하여 질병 병리 메커니즘을 이해하는 데 활용할 수 있습니다.

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이 프로토콜의 개발은 파킨슨병 연구소 뇌 기증 프로그램에 대한 개인 기부금으로 자금을 지원받았습니다.

뇌 기증 등록을 기부하는 그들의 의도 등록자에 의한 설명서가 포함되어 있습니다. 법이 허용 조직 검색에 대한 부검 권한은 친척의 다음에 의해 제공됩니다. 수집 부검 표본을 사용하여 연구 연구는 건강 보험 양도 및 책임에 관한 법률 (HIPAA) 규정을 준수하기 위해 제도적 검토위원회 (IRB)에 의해 검토된다. 참고 : Leptomeninges 샘플은 뇌 해부 동안 뇌 해부학자 또는 신경 병리학에 의해 수집되고, 25 ~ 30 ML의 수막 성장 미디어를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브에 저장됩니다. 샘플은 샘플 준비 될 때까지 4 ℃에서 저장된다. 세포의 생존 시간의 사후 감소로 처리가 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 1 세트 업 Leptomeninges 해부를 시작하기 전에 참고 : - 1.3 바이오 안전성 캐비닛 내부에서 수행 할 수 있습니다 1.1 단계를 반복합니다. <ol><li> 375 mL의 둘 베코 변형 이글 매체를 조합하여 수막 성장 배지를 준비 태아 소 혈청 100 ㎖, 5 ㎖의 10 mM 비 필수 아미노산, 5 ㎖의 200 mM의 L- 알라 닐 -L- 글루타민, 5 ㎖의 100 mM의 피루브산 나트륨 5 ㎖ 10,000 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 250 μg의 5 ㎖ / ㎖의 암포 테리 신 B, 500㎖ 필터 유닛이다. 필터와 혼합한다. 최대 4 주 동안 용지를 사용하십시오. </li><li> 해부를 시작하기 전에 바이오 안전성 캐비닛에있는 모든 재료를 넣 배 배양 접시, 배 6 웰 플레이트, 배 메스, 15 ~ 20 멸균 15 mm 커버 전표, 피펫을 흡입 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), 혈청 학적 피펫. </li><li> 6 웰 플레이트의 각 웰에 멸균 멸균 0.1 % 젤라틴 용액 1 ㎖를 추가한다. 30 ~ 60 분 동안 따로 접시를 설정합니다. 배 6 웰 플레이트를 준비합니다. </li></ol> Leptomeninges 샘플 2. 준비 참고 : - 2.3 바이오 안전성 캐비닛 내부에서 수행 할 수 있습니다 2.1 단계를 반복합니다. <ol><li> 에 PBS의 약 10 mL를 넣고멸균 10 cm 조직 배양 접시는 접시에 수막 샘플을 배치합니다. 포셉 사용하여 부드럽게 혈액을 제거하기 위해 PBS와 leptomeninges을 씻는다. </li><li> 신선한 PBS의 10 ㎖를 포함하는 새로운 10 cm 조직 배양 접시에 수막을 전송하고 세척을 계속합니다. 가능한 한 많은 혈액을 제거 할 필요 반복합니다. </li><li> 약 6cm X 6cm 큰 조각으로 조직 leptomeninges 절단이 메스를 사용. </li><li> 수평 층류 후드의 해부 현미경으로 배양 접시 및 전송에 놓고 덮개. </li></ol> Leptomeninges 조직 3. 해부 주 - 3.3 해부 현미경을 사용하여 수평 층류 후드 내부에서 수행되어야 3.1 단계. <ol><li> 적어도 20 ~ 25 3mm X 3mm 조각을 생성 할 수있을만큼 leptomeninges 조각 (단계 2.3)에 영역에서 혈관을 제거합니다. 한 메스과 장소에 leptomeninges을 잡고 다른과, 부드러운 얕은 긁어 모 사용기는 혈관을 분리합니다. </li><li> 준비된 지역에서 조직의 작은 사각형을 잘라. 첫 번째 큰 조각을 한 다음 작은 섹션으로 사람들을 슬라이스하여 단계적 과정에서 잘라. </li><li> 요동과 조직을 절단하는 대신에 조직과 다른 메스를 개최 한 메스를 사용합니다. 조직의 일관성으로 인해, 서로에 대해 메스 슬라이드하는 것이 곤란하다. 이것은 따로 조직을 찢어 및 비정형 가장자리에 발생합니다. </li><li> 20 ~ 25 3mm X 3mm 조각이 될 때까지 반 조각을 절단 계속합니다. </li></ol> 조직 배양 플레이트 상에 해부 수막 조각 4. 전송 주의 : 단계 4는 바이오 캐비닛 내부에 수행되어야한다. <ol><li> 6 웰 플레이트에서 (단계 1.3에서) 대기음 젤라틴. 각 웰에 수막 성장 미디어의 1 ML을 추가합니다. 멸균 집게를 사용하여 각 웰에 3-4 생검 조각을 배치합니다. </li></ol> M을 통해 커버 전표 5. 배치eninges 조각 주 - 5.2 해부 현미경을 사용하여 수평 층류 후드 내부에서 수행되어야 5.1 단계. <ol><li> 물론 당 1-2 멸균 15 mm 원형 된 커버와 조각을 커버. </li><li> 조각이 판의 하단을 터치되도록 집게로 단단히 누르십시오. 이 웰의 바닥에 조직 조각을 부착 할 수있다. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2 배양기로 6 웰 플레이트를 놓습니다. </li></ol> 6. 세포 배양 유지 보수 참고 : - 6.3 바이오 안전성 캐비닛 내부에서 수행 할 수 있습니다 6.1 단계를 반복합니다. 커버 슬립이 이동하고 수막 조각을 제거하지 말아야으로 치료와 배양 접시를 처리합니다. <ol><li> 문화 2 일 후, 각 웰에 신선한 수막 성장 미디어의 추가 1 mL를 넣어. </li><li> 7 일에, 신중하게 미디어를 대기음하고 각 웰에 신선한 미디어의 2 mL를 넣고. </li><li> 9 일 후, 성장 배지를 매일 계속 변화문화까지 다른 일 합류하게된다. </li></ol> (7)과 Passaging 참고 : 모든 단계는 바이오 안전성 캐비닛 내부에서 수행 할 수 있습니다. 수막 아세포는 수막 조직편에서 마이그레이션 큰 배양 접시에 수막 섬유 아세포를 배양 용기의 가장자리를 향해 성장 확장 시작되면. <ol><li> 15 ~ 30 분 동안 1 % 젤라틴과 계대 코트 배양 접시를 시작하기 전에. </li><li> 대기음 6 잘 접시에서 미디어 및 2 mL의 PBS로 세척 세포. </li><li> 각 웰에 트립신 / EDTA의 1 mL를 넣고 5 ~ 10 분 동안 37 ° C에서 품어. 또한, 커버 슬립 또는이 단계의 수막 조직을 제거 할 필요가 없다. </li><li> 셀은 원형이며, 분리 배지 2 mL를 첨가하기 시작하면. </li><li> 피펫 세포까지 완전히 모든 대단히 짧은 시간을 방해 큰 배양 접시에 세포 솔루션을 전송하려면 아래로. </li><li> 1 내지 3 : 1의 비율을 사용하여 4 세 6 웰 접시에서 세포를 결합 할한 T75의 배양 접시에. </li><li> 수막 섬유 아세포 세포를 T75 배양 플라스크에서 컨 플루 언트되면, 세포를 Trypsinize, 1 × 106 세포 / mL의 바이알에서 동결 배지에서 cryopreserve. 합류 수막 섬유 아세포와 함께 한 T75 문화 플라스크에 대한 5-7000000 세포가 포함되어 있습니다. </li></ol> 면역 염색에 의한 수막 섬유 아세포의 8 특성 주 : 절차를 시작하기 전에, PBS (블로킹 완충액)에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액을, 5 % 정상 염소 혈청을 제조 0.3 % 트리톤 X-100의 PBS (permeabilization 버퍼), 일차 및 이차 항체 용액, 및 1 μg의 중 / ㎖의 훽스트 33342 10 ㎎ / ㎖의 재고에서 PBS에 희석. <ol><li> 8 잘 챔버 슬라이드 씨 15,000 30,000 수막 섬유 아세포는 0.1 % 젤라틴으로 코팅. </li><li> 세포가 부착 된 경우 24 시간 후, 실온에서 10 분 동안 웰 당 100 μL 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정한다. 1X PBS로 우물 3 회 반복한다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 0.3 % 트리톤 X-100 150 μL와 세포 Permeabilize 하시려면. 1X PBS로 우물 3 회 반복한다. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 차단 용액 200 μL (PBS + 5 % 정상 염소 혈청)을 추가한다. </li><li> 차단 솔루션을 기음과 솔루션을 차단에 희석 원하는 차 항체의 150 μL를 추가합니다. 이중 염색의 경우, 다음과 같이 얼음에 별도의 원심 분리기 튜브의 일차 항체의 작업 희석을 준비 : <ol><li> 안티 피브로넥틴 + 1 (300) 희석 : 솔루션을 차단하는 안티 네 스틴의 200 희석 (1)을 준비합니다. 안티 SERPINH1 + 1 (250) 희석 : 솔루션을 차단하는 안티 TUJ1 1000 희석 1을 준비합니다. (1) 준비 : 안티 - SERPINH1 250 희석 + 1 : 솔루션을 차단하는 안티 SOX2 100 희석 </li></ol></li><li> 밤새 4 ° C에서 품어. </li><li> 1X PBS로 우물 3 회 반복한다. </li><li> 작업 한 준비 : 이차 항체는 항 - 토끼를 염소 라벨 형광 400 희석 (녹색, 예 / 엠 2 </s최대&gt; 519분의 495 ㎚)과 염소 항 - 마우스 (빨강, 예 / 엠 2 617분의 590 ㎚) 차단 솔루션과 각 웰에 100 μL를 추가합니다. 실온에서 어두운 곳에서 1 시간 동안 배양. 그런 다음 1X PBS로 한번 우물을 씻는다. </li><li> 각 솔루션은 물론 3 분 동안 어둠 속에서 부화 / mL의 훽스트 1 μg의 100 μL를 33342 (예 / 엠 2 461분의 358 nm의 청색)를 추가합니다. 웰의 최종 1X PBS 세척에두고 1X PBS로 웰을 3 회 세척하고, 알루미늄 호일로 슬라이드 커버. </li><li> 형광 현미경으로 세포를 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

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이 프로토콜은 뇌 기증과 관련하여 수집 된 인간 사후의 leptomeninges에서 수막 섬유 아세포 문화를 유도하는 간단하고 강력한 프로토콜을 설명합니다. 사후 인간의 물질로 세포 배양을 유도하는 프로토콜의 거의 설명이 있습니다. 두 연구는 피부 유래 섬유 아세포를 배양 7, 8, 9, 한 연구는 경질 샘플 (10)을 설명 설명하고 다른 비 냉동 보관 냉동 경질 샘플 (11)을 설명합니다. 우리는 냉동 보존 전에 충분한 부산물 및 확장을 보장하기 위해 각 웰에 2-3 조직 조각 (약 3mm × 3 ㎜) 두 개의 6 웰 플레이트를 준비합니다. 수막 조각 부드러운이 장소에 보유 할 수있는 조직 조각 위에 멸균 유리 커버 슬립을 ...

뇌경막, 지주막과 피아 이잖아요 : 수막은 뇌를 보호하는 세 개의 막으로 구성되어 있습니다. 최근에, 또한 수막 뇌 발달 한 뇌 항상성에 중요한 역할을한다는 것을 인식하고있다. 수막은 중간 엽 및 신경 능선 유래 세포로부터 유래하고 흥미로운 시험 관내 및 생체 내 2, 3, 4에서의 이식 후 뉴런을 야기 할 수있는 수막에 존재하는 전구 세포를 보였다. 들은 도파민 뉴런 (5)에 배아 줄기 세포의 분화를 위해 간질 세포 유래 유도부 활성을 갖는 수막으로 배양 성공적, 급전 층으로서 사용되어왔다. 또한 leptomeninges 직접 허혈성 조건 하에서 6 뉴런, 아스트로 사이트, 올리고 덴드로 사이트와로 분화 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 이 프로토콜의 경우, 인간의 사후 수막 샘플을 총칭하여 지주막과 피아 이잖아요에서 수집 leptomeninges라고, 연구 목적으로 인간의 두뇌 기부의 일환으로 조달된다. 뇌의 해부 죽음의 24 시간 내에서 수행되며,이 프로토콜 여기에 도시 된 바와 같이 leptomeninges 샘플은 다음 6-8 시간 내에서 추가 처리를 위해 저온 성장 배지에 배치된다. 이 프로토콜은 환자의 기본 leptomeninges 세포 배양의 개발에 대한 해부와 인간의 수막 샘플의 준비에 대해 설명합니다. 조직은 약 3mm X 3mm 사각형의 25 ~ 30 조각으로 절단됩니다. 세 가지 각 6 웰에 배치됩니다 젤라틴 코팅 잘 라운드 커버 글라스로 누르고. 뇌막 해부은 약 25 ~ 35 분 소요됩니다. 이 문화의 주요 과제는 뇌 조달, 운송 및 박리 등의 불임은 일반적으로 무균 조건 하에서 수행하지 않는 것입니다. 티herefore, 페니실린, 스트렙토 마이신 및 암포 테리 신 B의 칵테일 배양 배지를 보충하고 별도로 배양 조직 조각을 멀티 웰 접시를 사용하는 것이 중요하다. 수막 섬유 아세포의 부산물은 일반적으로 첫 주 내에서 발생합니다. 세포가 합류 할 때까지 미디어 매 2 ~ 3 일 변화 및 세포 효소 적으로 계대된다. 수막 섬유 아 세포는 냉동 보존 매체에 ㎖ / 바이알 당 100 만 세포의 냉동 보관한다. 이 프로토콜로, 20-30000000 수막 섬유 아 세포는 냉동 보존에 대한 6-8주에서 유도 될 수있다. 이러한 수막 섬유 아세포의 다운 스트림 응용 프로그램은 질병 연구, 직접 신경 세포 분화 또는 질병 메커니즘의 이해 및 약물 개발을위한 leptomeninges에서 유도 만능 줄기 세포의 유도를위한 차 문화입니다.

<table><tbody><tr><td>코닝 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 6웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>15mm 커버 슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-83 15CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>메스, 멸균 블레이드, No. 15</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 정밀 팁 집게</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-122</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피</td>펫 <td>Fisher Scientific</td><td>22-230490</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염</td>수 <td>Fisher Scientific</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL 필터 유닛</td><td>Fisher Scientific</td><td>430770</td><td>매체 성분 및 결합 필터.</td></tr><tr><td>Nunc 세포 배양 처리 플라스크, 필터 캡, T175 cm2&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>178883</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Growth Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30081.02</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액(100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제(100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨(100mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B (황색 용액/250 &마이크로; g/mL)Fisher</td> <td>Scientific</td><td>BP264520</td><td></td></tr><tr><td>Bambanker Freeze 120 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9582225</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Fibronectin Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 웰 챔버 슬라이드&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1256518</td><td></td></tr><tr><td>20% 파라포름알데히드&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>100% 글리세롤&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>9455</td><td></td></tr><tr><td>100% 일반 염소 혈청&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>101098-382</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fibronectin 항체 [F1]</td><td>Abcam</td><td>ab32419</td><td>1:300 차단 용액</td></tr><tr><td>희석 Anti-SERPINH1</td><td>Sigma</td><td>S5950-200ul</td><td>1:250 차단 용액 희석</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Millipore</td><td>MAB4343</td><td>1:100 차단 용액</td></tr><tr><td>Anti-Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>1:200 희석 차단 용액</td></tr><tr><td>Anti-TUJ1</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1:1,000 차단 용액</td></tr><tr><td>희석 Alexa Fluor 488 anti-rabbit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11029</td><td>1:400 차단 용액 희석; (녹색 채널; Ex/Em2 495/519 nm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 안티 마우스</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21424</td><td>1:400 차단 용액 희석액; (빨간색 채널; Ex/Em2 590/617 nm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 stain</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td>은 <td>1.0 &mu의 최종 농도로 희석합니다. g/mL; (블루 채널; Ex/Em2 358/461 nm)</td></tr><tr><td colspan="4">공급업체는 제안이며 대체 공급업체의 유사한 제품도 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

사후 인간의 두뇌 기증자로부터 leptomeninges 이식편 문화의 유도

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

큰 진전 파킨슨 병의 임상 적 특성에 만들어졌다하더라도, 몇몇 연구는 파킨슨 병의 병리학 적 진단이 임상 진단 파킨슨 병의 최대 25 %에서 확인되지 않은 것을보고한다. 따라서, 티슈는 오진의 높은 속도를 가질 수 특발성 파킨슨 병 환자의 임상 진단에서 수집; 전임상 모델이 쓸데 될 수 따라서 같은 조직에서 시험관 연구에서 파킨슨 병을 연구한다. 파킨슨 병의 확인 신경 병리학 적 진단 사후 인간의 leptomeninges를 수집하고 흑질 선조체 세포 손실과 루이 기관이라는 세포 내 단백질 흠을 특징으로 한 임상 관찰 파킨슨 다른 기저 질환 과정 (예를 들어 종양, 동맥 경화)에 의해 발생한 것이 아닌지 확신 할 수 있습니다. 이 프로토콜 presen해부 및 수막 섬유 아세포 문화의 유도에 대한 사후 인간의 leptomeninges의 준비 TS. 이 절차는 견고하고 높은 성공률을 갖는다. 뇌 조달은 일반적으로 무균 조건 하에서 수행되지 않는 문화의 문제는 불임이다. 따라서, 페니실린, 스트렙토 마이신 및 암포 테리 신 B의 칵테일 배양 배지를 보충하는 것이 중요 파킨슨 병 부검 확인 된 경우에서 수막 섬유 아 세포의 유도는 파킨슨 병의 체외 모델링을위한 기반을 제공합니다. 수막 섬유 아세포는 3~9일 샘플 준비 후 나타나는 약 20-30000000 세포 6-8 주 만에 동결 보존 할 수 있습니다. 수막 섬유 아세포 배양 균질하고 세포 피브로넥틴, 수막을 식별하기 위해 일반적으로 사용되는 마커를 표현한다.

leptomeninges 처리 프로토콜이 성공하면이 뇌에 대한 사후 간격의 길이에 따라 달라질 수 있지만, 수막 섬유 아 세포의 생장는 3 구 일 절제술 후 관찰 처음이다. 그림 1은 네 개의 다른 기증자의 수막 섬유 아세포 문화를 보여줍니다. 도 1a는 10 시간 20 분 사후 간격으로 88 세 기증자에서 처리 후 조직 사일 주위에 유리 커버 슬립 (어두운 대각선)와 섬유 아세포 가지에 의해 아래로 개최 leptomeninges 조각을 보여줍니다. 도 1b는 70 세의 기증자 11 시간 45 분 사후 변화에서 스파 스 섬유 아세포 가지 일곱 일 후 처리를 보여줍니다. 그림 1C는 섬유 아세포 가지에게 88 세의 기증자와 24 시간 사후 간격에서 절개 후 십삼일을 보여줍니다. 그림 1D는 T75의 VESS에 계대 하였다...

인간의 사후 뇌에서 leptomeninges 이식편 문화 프로토콜 6-8 주 이내에 피브로넥틴 양성 수막 섬유 아세포를 유도 약 20-30000000 세포를 cryopreserve하기 위해 기술적으로 강력하고 간단한 방법입니다.

사후 인간의 두뇌 기증자로부터 Leptomeninges 이식편 문화의 유도

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

저는 파킨슨병 연구소 및 임상 센터(Parkinson's Institute and Clinical Center)의 뇌 기증 프로그램 책임자인 비르깃 슐레(Birgitt Schule)입니다. 이 비디오에서는 파킨슨병 환자의 사후 인간 뇌의 연봉제에서 추출한 외식 세포 배양 및 원발성 섬유아세포의 지속 기간에 대해 설명합니다. 이러한 섬유아세포는 세포 기반 분석을 포함한 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다.이것은 중요한데, 왜냐하면 우리는 루이소체 병리학을 동반한 산발적인 파킨슨병의 부검으로 입증된 사례에서 세포주를 연구할 수 있기 때문입니다. 먼저 필요한 모든 재료를 조직 배양 후드에 넣습니다. 후드에 들어가는 모든 물체는 70% 에탄올을 분사하고 닦아내야 합니다.첫 번째 단계는 튜브에서 절단 접시로 수막을 옮기는 것입니다. 약 10ml의 인산염 완충 식염수를 멸균 10cm 절단 접시에 붓는 것으로 시작합니다. 여기에서 수막을 볼 수 있습니다.멸균 집게를 사용하여 수막을 절단 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 찢어짐을 방지하기 위해 이 단계를 천천히 수행하십시오. 다음 단계는 PBS로 수막을 세척하여 가능한 한 많은 혈액을 제거하는 것입니다.샘플이 너무 피가 많으면 다른 절단 접시로 옮기는 것을 고려할 수 있습니다. 10cm 크기의 신선한 접시에 PBS 10ml를 더 넣으십시오. 이 세척을 반복하여 수막에서 혈액을 계속 제거합니다.마지막으로 수막을 PBS가 들어 있는 신선한 10cm 접시에 옮깁니다. 완료되면 접시를 덮고 층류 후드의 해부 현미경으로 옮깁니다. 다음 단계는 수막을 더 작은 조각으로 계속 절단하는 것입니다.두 개의 멸균 메스를 사용하여 얕게 긁어내는 동작으로 수막에서 혈관을 부드럽게 분리합니다. 이 이미지와 같이 3mm x 3mm 조각 약 18개를 자를 수 있을 만큼 큰 영역을 준비합니다. 그런 다음 메스를 잡고 흔들리는 동작을 사용하여 준비된 부위를 3mm x 3mm 조각으로 자릅니다.먼저 수막을 더 큰 조각으로 자른 다음 그 조각을 더 작은 부분으로 자르는 단계적 과정에서 이 작업을 수행하는 것이 더 쉽습니다. 절단 접시를 덮고 조직 배양 후드로 다시 옮깁니다. 다음으로, 30-60분 동안 1ml의 0.1% 젤라틴으로 예쁘게 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트에 수막을 옮길 준비를 합니다.각 웰에 1ml의 수막 배지를 추가합니다. 그런 다음 멸균 집게로 3-4 개의 수막 조각을 각 우물의 중앙으로 옮깁니다. 이 플레이트에서 자란 세포는 통로 0이 됩니다.다음 단계는 커버슬립을 사용하여 수막 조각이 고정되어 있고 배양 접시와 접촉 상태를 유지하도록 합니다. 수막 조각 위에 멸균 15mm 원형 커버슬립을 놓습니다. 필요한 경우 커버 슬립으로 수막 조각을 재배치합니다.그런 다음 집게를 사용하여 덮개 슬립을 단단히 눌러 조각이 플레이트에 닿도록 합니다. 이 이미지는 커버 슬립으로 제자리에 고정된 수막 조각을 보여줍니다. 6웰 플레이트 위에 덮개를 놓고 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정된 인큐베이터로 조심스럽게 옮깁니다.배양에서 이틀 후, 각 웰에 1ml의 신선한 수막 배지를 추가로 첨가합니다. 7일째에는 미디어를 흡인합니다. 그런 다음 각 웰에 2ml의 새 배지를 다시 채웁니다.7일째 이후에는 격일로 2ml의 신선한 배지를 웰에 계속 보충합니다. 이 이미지는 도립 현미경으로 수막 조각과 배양의 첫날을 보여줍니다. 약 6일에서 9일 후, 첫 번째 성장물에서 세포 부착이 관찰될 수 있습니다.15일에서 19일 사이에 세포 수가 증가하고 성장이 더 조밀해집니다. 수막 섬유아세포는 피브로넥틴의 발현이 특징입니다. 이 이미지는 염색되어 피브로넥틴에 양성인 배양된 수막 세포를 보여줍니다.이 동영상을 시청한 후에는 사후 인간 뇌 기증자로부터 렙토메닝(leptomeninges) 외피 배양을 유도하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 3주에서 6주 이내에 수막 섬유아세포를 추출할 수 있는 간단하고 강력한 방법을 제공하며, 낮은 계대 수에서 1,500만-2,000만 개의 세포를 저장할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서는 성숙 oligodendrocytes (OLs)를 생산하는 차별화 기본 문화에 murine oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)의 풍부한 인구를 유도하는 방법을 설명합니다. 또한,이 보고서는 생산 기술에 대해 설명합니다 murine 마우스 등의 루트 신경절의 뉴런 (DRGNs)의 neurite 침대에 마우스 OPCs을 심는 공동 문화 myelinating.

포스트 - 나탈 Murine 조직의 공동 문화를 Myelinating 풍부한 Oligodendrocyte 문화와 Oligodendrocyte / 신경 세포의 유도

이 프로토콜은 태아의 척추 코드에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유래를 설명하고 이식이나 oligodendrocytic 혈통의 연구 중 체외 유지.

E13 생쥐에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유도

이 비디오는 성인 인간의 뇌에서 자유 부유 슬라이스 배양을 준비하는 기술을 보여줍니다. 얇은 조각은 비브라톰을 사용하여 뇌 섹션에서 생성됩니다. 그런 다음 이러한 절편은 조직 생존력을 유지하기 위해 성장 인자로 보충된 배양 배지에 현탁됩니다.

성인 인간 뇌에서 자유 부유 슬라이스 배양 준비

이 비디오는 신경교세포의 3차원 배양을 확립하는 기술을 보여줍니다. 쥐 뇌 유래 신경교세포는 세포외 기질 성분을 포함하는 광가교결합 가능한 고분자 기질 내에 캡슐화되어 있습니다. 성장 배지에서 배양하면 신경교세포가 지지 매트릭스 내에서 증식하여 3차원 배양을 생성합니다.

쥐의 뇌 유래 신경교세포(Rat Brain-derived glial cell)의 3차원 배양 확립

심실 뇌척수 (CSF)는 배아의 초기 뇌 발달 동안 neuroepithelial과 대뇌 피질 전구 세포를 bathes. 여기에는 생물학적 기능을 조사하기 위해 다양한 연령대의 쥐 배아에서 심실 CSF를 분리하기 위해 개발 된 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 우리의 대뇌 피질 explant의 해부와 문화 매체 또는 CSF의 최소한의 볼륨으로 explant 성장을 허용 문화 기술을 보여줍니다.

해부하는 뇌 두피 Explants와 함께 사용하기위한 쥐 태아의 뇌척수의 절연

이 프로토콜은 뇌 기증 프로그램과 뇌의 적절한 특성을 통해 개별 뇌 노화 궤적을 추적하는 방법을 설명합니다. 두뇌 기증자는 연쇄 다차원 평가를 포함하여 장기 종방향 연구 결과에 관여합니다. 이 프로토콜에는 뇌 처리에 대한 자세한 설명과 정확한 진단 방법론이 포함되어 있습니다.

노화 뇌 수집, 처리 및 특성화를 위한 Abbiategrasso 브레인 뱅크 프로토콜

우리는 두개골에 안정될 수 있는 끝에 바늘을 구부린, 따라서 근본적인 자렌치에 손상의 리스크를 제거하는 intracisternal 주입을 기술합니다. 이 접근법은 렙토메닝 세포의 유전적 운명 매핑 및 조작및 뇌척수액 이동 추적에 사용될 수 있습니다.

내분비주주입을 통한 렙토메닝 세포 변형 유도

이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

최근에 확인된 두개내 세포 유형인 연수막 림프 내피 세포(LEC)는 기능이 잘 이해되지 않습니다. 이 연구는 마우스에서 LLEC를 수확하고 시험관 내 1차 배양을 확립하기 위한 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 연구자들이 LLEC의 세포 기능과 잠재적인 임상적 영향을 탐구할 수 있도록 설계되었습니다.

연수막 림프 내피 세포의 수확 및 1차 배양

이 논문에서는 M-LMD를 연구하기 위한 전임상 모델을 개발하기 위해 흑색종 관련 연수막 질환(M-LMD) 환자로부터 수집한 뇌척수액순환종양세포(CSF-CTC)의 증식을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

Ex 생체 내 흑색종 관련 연수막 질환을 연구하기 위한 흑색종 환자의 대뇌 척수액 내 순환 종양 세포 배양

배우세요 사후 인간 두뇌의 leptomeninges에서 explant 배양법을 이용해 fibronectin 양성 meninges 섬유아세포를 유도하는 방법을. 파킨슨병 환자의 세포주를 연구하여 질병 병리 메커니즘을 이해하는 데 활용할 수 있습니다.

사후 인간의 두뇌 기증자로부터 Leptomeninges 이식편 문화의 유도

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