Name: 의 재배 예쁜 꼬마 선충 실험실에서 세 가지 차원에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans의 3차원 배양 시스템 구축 방법을. NGT-3D와 NGB-3D 기법을 활용하여 선충의 자연 서식지와 유사한 환경에서 발달, 생리 및 행동을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은에 의해 지원되었다 새 탐정 그랜트 [2014R1A1A1005553] JIL에 한국 연구 재단 (NRF)에서; 와 연세대 학교 미래 리더 챌린지 그랜트 [2015-22-0133] JIL에

1. NGT-3D 및 NGB-3D를위한 솔루션을 준비 <ol><li> 다음 멸균 솔루션을 준비 : 0.1454 M NaCl 용액 1 L, 1 M CaCl2를, 1 M 황산 1 L 1 L, 원성 국물 (LB), KH 2의 1 M KPO 4 버퍼 (108.3 g 1 L PO 4 및 K 2 35.6 g HPO 4, H 2 O 기입 L 1). 이러한 솔루션을 사용 NGM의 제조 이전 프로토콜 (10)에서 찾을 수있다. </li><li> 121 ° C, 15 분에서 오토 클레이브 솔루션을 제공합니다. </li><li> 멸균 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤 용액 50 ㎖를 준비합니다. 한 50㎖ 원추형 튜브에 콜레스테롤의 0.25 g 및 99.99 % 에탄올 50ml를 혼합하고 잘 혼합한다. 오토 클레이브하지 마십시오. 0.45 μm의 주사기 필터로 50 mL를 주사기를 사용하여 콜레스테롤을 살균 용액. 이것은 또한 어떤 용해되지 않은 콜레스테롤을 제거합니다. </li><li> 2&#39;- 데 옥시 -5- fluorouridine (FUdR) 주식의 150 mM의 10 ㎖를 준비합니다 (선택 사항). 15 ml의 원추형 튜브에, 0.3693 g을 혼합FUdR 증류수 10 ㎖의. 잘 흔들어. </li></ol> 2. NGT-3D 및 NGB-3D에 대한 박테리아 문화를 준비합니다 <ol><li> 박테리아 10 ml의 LB 배지에 접종. 공급 C. elegans의 사용되는 표준 박테리아는 대장균 OP50이다. </li><li> 문화 밤새 진탕 배양기에서 37 ° C에서 세균 접종. </li><li> 일련의 희석에 대비, 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 NaCl 용액의 나누어지는 9 ml의. 예를 들어, 7 개의 튜브에 분취 9 ml의 OP50 균주 E. 콜라이의 10-7 희석을한다. </li><li> NaCl 용액의 9 ml의 멸균 새로운 튜브에 멸균 1,000 μL 피펫, 피펫 세균 배양 1 ml의 희석 세균 배양를 사용하여 잘 10 ml의 혼합물을 소용돌이. 원하는 박테리아 희석에 도달 할 때까지 반복합니다. 주 : 원하는 박테리아 희석 종류 및 조건 세균뿐만 아니라 정확한 실험 조건에 의존한다.예를 들어, 10-6 - 6.5 ml의 NGT-3D 튜브 당 200 세균성 식민지 - OP50 변형 대장균의 10-8 희석는 1 생산하기에 충분했다. 웜 확실 개발 콜로니 수 × 10-6의 희석에서 발생하는 60 때 정상적으로 재생 - 10-7. NGB-3D를 들어, 10-8의 희석을 사용합니다. </li></ol> 3. 만들기 NGT-3D 및 NGB-3D (200 ㎖) <ol><li> 박테리아 배양을 제조 한 후, 0.6 g의 NaCl 1 g의 과립 한천, 및 500 mL의 플라스크에서, 0.5 g 펩톤 섞는다. 플라스크에 자기 교반 막대를 삽입합니다. </li><li> 195 ml의에게 증류수를 추가하고 알루미늄 호일로 플라스크의 입 커버. </li><li> 15 분 동안 오토 클레이브에서 121 ° C. </li><li> 저어 접시에 뜨거운 멸균 플라스크를 놓고, 적어도 2 시간 동안 적당한 속도로 교반한다. 40 ° C까지 플라스크를 냉각. 완성 된 한천의 흐리게 될 수 있습니다 여기에 고온에서 지속적으로 충분히 냉각해야합니다.그러나, 낮은 온도는 한천의 조기 경화의 원인이 될 수 있습니다. <ol><li> (선택 사항), 냉각 프로세스의 속도를 저어 접시에 배치하기 전에 40 ° C의 물 목욕 15 분에 플라스크를 배치합니다. </li></ol></li><li> 한천 매체의 온도가 40 ℃에 도달하면, 용액은 교반 계속되고, 200 ㎕의 1 M CaCl2를 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤 용액 200 ㎕를 200 ㎕의 1 M 황산 5 mL의 1 M KPO 4 버퍼를 추가 1 mM의 염화칼슘 2, 5 μg의 / ㎖ 콜레스테롤, 1 mM의 황산, 1 mM의 KPO 4의 최종 농도. <ol><li> NGT-3D 수명 분석을 위해 (선택 사항) 120 μM (12)의 최종 농도 150 mM의 FUdR의 80 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 직접 플라스크에 단계 2.4에서 박테리아 문화를 희석하여 10 ml의 6 ML을 추가합니다. <ol><li> , NGT-3D (선택 사항) 단계 3.6 전에 한천 미디어의 6 mL로 분리하여 따로 따뜻한 유지. 이 매체는 사용할 수없는 것이다 세균최상층. </li></ol></li><li> 무균 절차를 이용하여, 무균 배양 챔버에 미디어 분배. 확인 챔버의 커버가 단단히 종료합니다. <ol><li> (선택 사항), 한천의 표면에 형성되는 세균성 식민지를 방지 3.7 완전히 경화 단계에서 용지 전에 상단에 단계 3.6.1에서 박테리아가없는 한천 미디어의 층을 확인하십시오. 이 NGT-3D의 상단에 박테리아가없는 영역을 생성합니다. </li><li> NGT-3D를 들어, 박테리아 한천 층을 조심스럽게 얇은 세균 -을 만들기 위해 반경 화 3D 미디어의 상단에있는 박테리아가없는 미디어 200 μl를 분배하는 8 ml의 투명한 플라스틱 시험관에 6.5 ml의 미디어를 부어 상단에 자유 층. </li><li> NGB-3D를 들어, 25cm 2 투명한 플라스틱 세포 배양 병에 미디어 65 ml에 붓는다. 이 금액은 25cm 2 세포 배양 병의 본문을 작성해야합니다. </li></ol></li><li> 박테리아 콜로니가 성장하도록 일주일 수직 상온 챔버 남기기적어도 1mm 직경의 상당한 크기. <ol><li> NGT-3D의 수명 분석을 위해 (선택 사항), 알루미늄 호일 커버 챔버 FUdR의 빛 저하를 방지 할 수있다. </li></ol></li></ol> NGT-3D (상대 브루드 크기 분석)에 대한 웜 인구의 4 측정 휘트니스 <ol><li> 선택과 세균이없는 NGM 접시에 전송 백금 와이어를 사용하여 L4 무대 웜을 선택합니다. 웜은 자유롭게 몸에 부착 된 세균을 제거하는 몇 분 동안 이동할 수 있습니다. </li><li> 단계 4.1를 반복하고 웜이 박테리아에서 무료로 있는지 확인하십시오. 일반적으로, 4.1이 반복 충분하다. </li><li> 조심 백금선 픽업과 3D 매체의 표면에 깨끗한 웜 놓는다. 이 웜은 결국 3D 한천 행렬에 한천을 입력해야합니다. </li><li> 커버 느슨하게 일부 공기가 튜브로 얻을 수 있지만, 한천 매체 건조 방지습니다. </li><li> 20 ° C에서 96 시간 동안 품어. </li><li> 사일 후 단단히 뚜껑을 닫고 두는88 ° C의 물을 욕조에 NGT-3D 문화 챔버는 한천을 녹여합니다. 열은 벌레를 죽이는 그러나 그들의 몸은 그대로 유지됩니다. 참고 : NGT-3D에 8 ㎖의 튜브 사용은 20 - 30 분 배양은 일반적으로 충분합니다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 9cm 플라스틱 페트리 접시에 용융 미디어 옮긴다. 벌레가 자주에 충실 수있는 플라스틱 피펫은 권장되지 않습니다. </li><li> 송신 스테레오 해부 현미경을 사용하여, L3, L4에 웜 및 성체 단계의 개수를 카운트. F1을하고 F2 세대가 여기에 혼동 될 수 있으므로, L2 단계 이하이다 벌레를 계산하지 마십시오. 따라서, 이러한 분석은 상대 브루 크기 분석보다는 전체 브루 크기 분석이다. </li></ol> 5. 이미지 및 기록 웜 동작 NGB-3D에 <ol><li> 백금 와이어를 사용하여 L4 무대 웜 선택 선택하고 박테리아가없는 NGM 판에 전송하고 자유롭게 몇 분 동안 이동할 수 있도록하여 표면에 붙어있는 박테리아를 제거합니다. </li><li> 단계를 반복 5.1 하시다 확인하십시오RM은 박테리아에서 무료입니다. </li><li> 조심스럽게 백금 와이어 픽와 병의 목 근처 NGB-3D의 한천 표면의 중심에 클린 웜을 배치합니다. 이 웜은 결국 3D 한천 행렬에 한천을 입력해야합니다. </li><li> 한천 미디어의 건조를 방지하면서 덮개가 느슨하게, 약간의 공기가 튜브에 들어갈 수 있도록 닫습니다. </li><li> 이미지 또는 전송 스테레오 해부 현미경 벌레를 기록합니다. 웜은 3D 매트릭스를 통해 이동으로 초점을 조절합니다. </li></ol>

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고전 선충류 성장 미디어 판을 사용하여 선충의 실험 재배가 제공 한 C. elegans의에서 연구 중요한 발견의 수백에 매우 중요했다. 여기, 우리는 더 정확하게 자연 입체 서식지를 반영하는 환경에서 C. 엘레을 육성하기 위해 새로운 방법을 제시한다. 다른 방법 3D 13 C. 엘레을 관찰하기 위해 사용되었지만, 이는 고체 차원 매트릭스 웜의 재배를 허용하는 제 1 프로토콜이다. 여기에 표시된 두 가지 방법, NGT-3D 및 NGB-3D는 과학자 이미지도 3D 재배 피트니스, 발전과 성장의 문제 등을 요청하고 3D로 벌레를 기록 할 수 있습니다. NGT-3D 및 NGB-3D 표준 2D NGM 플레이트에 약간의 차이가 있지만, 그들은이 원래의 방법과 유사한 만 z 축에 웜 재배를 추가하도록 조정한다. 따라서, 우리는 개발, 불임 및 수명이 우리의 조건에서 정상적으로 진행 것을 찾을 수 있습니다. 그만큼목표는 실험실 연구를 위해 사용 할 수있는 프...

실험실에서의 선충 Caenorhabditis elegans에 대한 연구는 지난 50년 동안 생물학 분야에서 중요한 발견으로 이어졌습니다1. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 1998년에 게놈 염기서열 분석을 한 최초의 다세포 유기체였으며, 전체 유기체의 발달, 생리학 및 행동에 대한 개별 유전자의 기여를 이해하는 데 매우 중요했습니다. 과학자들은 이제 이러한 유전자가 자연 환경에서 유기체의 생존과 생식 적합성에 어떻게 기여할 수 있는지 더 깊이 이해하기 위해 유전자 수준3-5에서 생태학과 진화에 대해 질문하고 있습니다. 
C. elegans는 다시 한 번 이러한 질문에 답할 수 있는 훌륭한 시스템을 제공할 수 있습니다. 그러나 자연 선충 서식지에서 예쁜꼬마선충의 생물학에 대해서는 알려진 바가 거의 없으며, 현재 실험실에서 예쁜꼬마선충의 통제된 자연 조건을 시뮬레이션할 수 있는 방법은 없습니다. 실험실에서 C. elegans는 E. coli 박테리아6이 뿌려진 한천 판의 표면에서 배양됩니다. 그러나 자연에서는 예쁜꼬마선충(C. elegans) 및 관련 선충(comatodes)이 전 세계의 토양에 드물게 서식하는 것을 볼 수 있지만, 특히 썩어가는 과일과 식물 물질에서 번성하는 것으로 발견된다7,8. 이러한 3차원(3D)의 복잡한 환경은 실험실에서 벌레가 노출되는 단순한 2D 환경과는 상당히 다릅니다. 
보다 자연스러운 3D 환경에서 선충의 생물학에 대한 질문에 답하기 위해 우리는 선충 성장 튜브 3D또는 줄여서 NGT-3D 9라고 부르는 선충의 실험실 배양을 위한 3D 서식지를 설계했습니다. 목표는 표준 2D 선충 성장 배지(NGM) 플레이트10과 유사한 성장, 발달 및 비옥도를 허용하는 3D 성장 시스템을 설계하는 것이었습니다. 이 시스템은 전체 수명 주기에 걸쳐 박테리아와 선충의 성장을 3D로 지원하고, 벌레가 3차원에서 자유롭게 움직이고 행동할 수 있도록 하며, 제조 및 사용이 쉽고 저렴합니다. 
본 연구에서는 NGT-3D를 제조하고 기생충의 발달 및 생식력을 평가하는 단계별 방법을 제공합니다. 3D로 지렁이의 적합성을 평가하는 것 외에도 3D 배양에서 지렁이의 행동과 생리학을 이미지화, 비디오 및 평가하고자 했습니다. 따라서 NGT-3D 외에도 3D 배양 중 예쁜꼬마선충의 현미경 이미징을 위해 Nematode Growth Bottle 3D 또는 NGB-3D라는 대체 방법을 제시합니다. 이는 2D에서 확인된 알려진 행동에 대한 연구와 3D 재배 고유의 새로운 행동을 식별하는 데 특히 중요합니다.

<table><tbody><tr><td>LB 국물, Miller (Luria-Bertani)</td> <td>Difco</td><td>224620</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>DAEJUNG</td><td>7548-4400</td><td>58.44 MW</td></tr><tr><td>한천, 과립</td><td>Difco</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘, 이수화물</td><td>바이오 베이직</td><td>CD0050</td><td>2 * H 2 O; 147.02 MW</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>바이오 베이직</td><td>CD0122</td><td>386.67 MW</td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>B & J</td><td>RP090-1</td><td>99.99%; 46.07 MW</td></tr><tr><td>마그네슘 설페이트, 무수</td><td>바이오 베이직</td><td>MN1988</td><td>120.37 MW</td></tr><tr><td>인산칼륨, 모노베이직, 무수</td><td>바이오 베이직</td><td>PB0445</td><td>136.09 MW</td></tr><tr><td>2'-Deoxy-5-fluorouridine</td><td>도쿄 화학 산업</td><td>D2235</td><td>246.19 MW</td></tr><tr><td>인산칼륨, 이염기성, 무수</td><td>바이오 베이직</td><td>PB0447</td><td>174.18 MW</td></tr><tr><td>다목적 시험관</td><td>Stockwell Scientific</td><td>ST.8570</td><td>8 ml</td></tr><tr><td>시험관 마개</td><td>Stockwell Scientific</td><td>ST.8575</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크</td><td>SPL Lifescience</td><td>70125</td><td>25 cm2</td></tr><tr><td>Research 스테레오 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>고화질 컬러 카메라 헤드</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi2</td><td></td></tr><tr><td>PC 기반 제어 장치</td><td>Nikon</td><td>DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>NIS 요소 기본 연구, 현미경 이미징 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>MQS32000</td><td></td></tr></tbody></table>

의 재배<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 실험실에서 세 가지 차원에서

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Caenorhabditis elegans와 같은 유전자 모델 유기체의 사용은 지난 50년 동안 생물학에서 중요한 발견으로 이어졌습니다. 예쁜꼬마선충에 대해 우리가 알고 있는 대부분의 정보는 선충의 실험실 배양에 국한되어 있으며, 이는 선충이 자연에서 일반적으로 서식하는 환경을 반드시 반영하지 않을 수도 있습니다. 벌레가 썩은 과일과 자연의 식물 퇴비에서 만나는 3D 매트릭스와 더 유사한 3D 서식지에서 예쁜꼬마선충을 재배하면 2D에서 관찰되지 않는 새로운 표현형과 행동을 밝힐 수 있습니다. 또한 3D 실험은 2D에서 관찰되는 표현형이 자연의 벌레와 어떤 관련이 있는지 설명할 수 있습니다. 여기에서는 예쁜꼬마선충(C. elegans)이 3차원으로 정상적으로 성장하고 번식하는 새로운 방법을 제시합니다. Nematode Growth Tube-3D(NGT-3D)에서 예쁜꼬마선충을 배양하면 3D 환경에서 예쁜꼬마선충 균주 또는 다양한 조건의 생식 적합성을 측정할 수 있습니다. 또한 현미경 분석을 위해 예쁜꼬마선충을 3D로 배양하기 위해 Nematode Growth Bottle-3D(NGB-3D)라는 새로운 방법을 제시합니다. 이러한 방법을 통해 과학자들은 자연에서 만나는 환경을 더 잘 반영하는 조건에서 예쁜꼬마선충의 생물학을 연구할 수 있습니다. 이것들은 우리가 실험실에서 관찰하는 예쁜꼬마선충의 생리학과 행동의 근본적인 진화적 관련성을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

NGT도 3d의 구조는 한천 (도 1a)에 걸쳐 이격 된 작은 박테리아 콜로니 한천 채워진 시험관 결과 단순하고 간단한 프로토콜이다. 웜 자유롭게 세균성 식민지를 발견하고 소비, 한천 매트릭스를 통해 이동할 수 있습니다. C. elegans의 재현과 NGT-3D 정상적으로 성장할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 우리는 다산과 표준 2D NGM 플레이트와 3D의 애벌레 개발을 비교 하였다. 상대 무리 크기 분석에서, 성인 C. 세균 식민지가 적어도 60 식민지 (그림 1B)와 풍부한 경우 NGT-3D로 자웅 동체 표준 2D NGM 판에있는 자웅 동체로 단지뿐만 아니라 재생 엘레 간스. 또한, NGT-3D의 애벌레 개발도 96시간 (그림 1C) 후 성인 상태에서 웜의 대부분과 세균성 식민지의 많음이있을 때 일반적으로 진행된다. 그러나...

우리는 NGT-3D 및 NGB-3D라는 3D 선충 재배 시스템을 구축하는 간단한 방법을 제시한다. 이러한 표준 2D 실험실 C. elegans의 배양 플레이트보다 자연 예쁜 꼬마 선충 서식지에 더 유사 서식지에서 선충의 체력과 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

이 절차의 전반적인 목표는 자연 조건을 더 잘 시뮬레이션할 수 있는 선충을 위한 3차원 배양 시스템을 제조하는 것입니다. 이 방법은 예쁜꼬마선충의 발달, 생리학 및 행동 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 3D 환경인 썩어가는 과일에서 자연적인 선충 행동을 연구할 때 처음 떠올랐습니다.이 기술은 선충이 자연의 3D 서식지에 서식하기 때문에 표준 2차원 재배 기술에 비해 이점이 있습니다. 이 방법은 예쁜꼬마선충 재배용으로 개발되었지만 다른 선충에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 이동영(Tong Young Lee)입니다.이 절차를 시작하기 위해 Otto Clave는 준비된 용액을 섭씨 121도에서 15분 동안 사용합니다. 다음으로, 멸균 콜레스테롤 용액 50ml를 밀리리터당 5밀리그램으로 준비합니다. 50ml 원뿔형 튜브에 콜레스테롤 0.25g과 99.99% 에탄올 50ml를 넣고 잘 섞습니다.그런 다음 50 벤트 주사기 필터가 있는 0.45ml 주사기를 사용하여 콜레스테롤 용액을 살균하고 미발달 콜레스테롤을 제거합니다. 그런 다음 10ml의 용원 육수에 박테리아를 접종합니다. 박테리아 접종을 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.연속 희석을 준비하기 위해 9ml의 염화나트륨 용액을 7개의 멸균 15ml 원추형 튜브에 할당합니다. Opi 50 Strain E Coli의 7 배 희석의 텐트를 만들기 위해. 그 후, 1 밀리리터의 박테리아 배양액 또는 희석 된 박테리아 배양액을 9 밀리리터의 염화나트륨 용액이 담긴 새 튜브에 튀어 나옵니다.그리고 혼합물을 잘 와류로 만듭니다. 박테리아 배양을 준비한 후 500ml 플라스크에 염화나트륨 0.6g, 과립 오거 1g, 펩톤 0.5g을 추가합니다. 마그네틱 교반 막대를 플라스크에 넣습니다.그런 다음 증류수 195ml를 넣고 플라스크를 알루미늄 호일로 덮습니다. 다음으로, Otto Clave는 섭씨 121도에서 15분 동안 샘플을 클레이브합니다. 그런 다음 뜨거운 Otto Claved 플라스크를 교반 플레이트에 넣고 섭씨 40도에 도달할 때까지 최소 2시간 동안 적당한 속도로 저어줍니다.또는 플라스크를 교반 플레이트에 옮기기 전에 섭씨 40도의 수조에 15분 동안 넣어 섭씨 40도까지 냉각할 수 있습니다. 여기에서 계속하므로 충분히 식히십시오. 고온은 완성된 오거를 흐리게 할 수 있지만 온도가 너무 낮으면 오거가 조기에 경화될 수 있습니다.오거 매체의 온도가 섭씨 40도에 도달하면 염화칼슘, 콜레스테롤 용액, 황산마그네슘 및 인산칼륨 완충액을 넣고 용액을 계속 저어줍니다. NGT-3D 수명 분석의 경우 80마이크로리터의 150mm FUDR을 배지에 첨가하여 최종 농도가 120마이크로몰이 됩니다. 그런 다음 6ml의 오거 매체를 멸균 원뿔형 튜브에 넣고 인큐베이터에서 따뜻하게 유지합니다.이 매체는 박테리아가 없는 최상층에 사용됩니다. 다음으로, 6ml의 희석된 박테리아 배양액을 멸균된 벤치에서 플라스크에 직접 추가합니다. NGT-3D의 경우 8ml의 투명 플라스틱 시험관에 6.5ml의 매체를 부어 박테리아 오거 층을 형성합니다.그리고 반 경질 3D 미디어 위에 200 마이크로 리터의 박테리아가 없는 미디어를 조심스럽게 분배하여 위에 얇은 박테리아 없는 층을 만듭니다. 그런 다음 챔버의 덮개를 단단히 닫으십시오. NGB-3D의 경우 25cm 제곱미터의 투명 플라스틱 세포 배양 병에 65ml의 배지를 붓습니다.그런 다음 챔버를 일주일 동안 실온에서 수직으로 배치하여 박테리아 콜로니가 최소 1mm 직경의 상당한 크기로 자랄 수 있도록 합니다. 이 절차에서는 L 4단계 웜을 선택하여 박테리아가 없는 NGM 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 지렁이가 몸에서 박테리아를 제거하기 위해 몇 분 동안 자유롭게 움직이도록 합니다.그리고 절차를 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 깨끗한 웜을 3D 미디어 표면에 조심스럽게 놓습니다. 웜은 실제로 오거를 3D 오거 매트릭스에 입력했어야 합니다.그런 다음 덮개를 느슨하게 닫아 섭씨 20도에서 96시간 동안 배양합니다. 4일 후 뚜껑을 단단히 닫고 NGT-3D 배양실을 섭씨 88도의 수조에 넣어 오거를 녹입니다. 유리 피펫을 사용하여 용융된 매체를 9cm 플라스틱 페트리 접시에 옮깁니다.그 후, 투과 입체 해부 현미경을 사용하여 L3, L4 및 성체 단계에서 벌레의 수를 계산합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 NGT-3D의 구조는 오거 전체에 작은 박테리아 군집이 있는 오거로 채워진 시험관을 생성하는 간단하고 간단한 프로토콜입니다. 예쁜꼬마선충이 NGT-3D에서 정상적으로 감소하고 성장할 수 있는지 확인하기 위해 생식력과 유충 발달을 표준 2D NGM 플레이트와 3D로 비교합니다.상대적 무리 크기 분석에서 NGT-3D의 성체 예쁜꼬마선충 자웅동체는 박테리아 군체가 60개 이상의 군체로 풍부할 때 표준 2D MGM 플레이트에서 자웅동체와 마찬가지로 번식했습니다. 또한, NGT-3D의 유충 발달은 박테리아 군집이 많고 대부분의 기생충이 96시간 후에 성체 상태가 될 때 정상적으로 진행됩니다. 그러나 3D 매트릭스에 박테리아 군집이 희박하면 상대적인 무리 크기와 유충 발달 모두에 부정적인 영향을 미칩니다.다음은 NGT-3D 또는 NGM 플레이트에서 야생형 C형 예쁜꼬마선동물의 생존 곡선입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 수명 분석 및 행동 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 노화 및 행동에 대한 질문에 3D로 답할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 유전학 분야의 연구자들이 예쁜꼬마선충의 생태학과 진화에 대한 질문을 탐구할 수 있는 길을 열 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 3D 실험실 환경에서 선충을 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

cultivation-caenorhabditis-elegans-three-dimensions

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Petersen, C. 외, 모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물군 분리 및 특성화. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 Caenorhabditis elegans와 관련된 박테리아 종의 분리와 배양 과정을 보여줍니다. 구슬 기반 C. elegans 용해와 선택적 배양을 통해 다양한 미생물 균주를 분리하여 추가 분석을 할 수 있습니다.

카에노르합디티스 엘레간스 관련 박테리아의 분리 및 배양

우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

C. elegans의는 일반적으로 고체 한천 플레이트에 성장 또는 액체 문화에서 E. 씨앗을 품고있다 대장균. 독성 및 영양 연구를 혼동에서 세균의 부산물을 방지하기 위해, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램의 범위에 대한 웜의 수가 증가하고 동기화, 무균 액체 배지, CeHR을 이용했다.

배양 예쁜 꼬마 선충 미세 폭격에 의한 무균 액체 미디어 및 형질 전환 웜의 생성에

여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

이 프로토콜에서는 고체 미디어 꼬마 선 충 의 대규모 재배 하는 방법을 설명합니다. 액체 문화 하는 대신,이 프로토콜 플레이트 기반 재배 아래 다른 비늘의 매개 변수를 얻기 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 결과의 comparability를 늘어납니다.

꼬마 선 충의 대규모 재배 플레이트 기반: 당뇨병에서 대사 변경의 연구에 대 한 샘플 준비

이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

Caenorhabditis elegans 는 생물학의 주요 모델 종 중 하나이지만 거의 모든 연구는 자연적으로 관련된 미생물이없는 상태에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 방법은 미래의 기능적 C. elegans 연구의 기초로서 관련 미생물의 다양성에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

퇴비 소우주는 자연에서 발견되는 미생물 다양성을 실험실로 가져와 Caenorhabditis elegans의 미생물 군집 연구를 용이하게합니다. 여기에는 소우주 실험을 설정하기위한 프로토콜이 제공되며, 실험은 환경 미생물 다양성과 벌레 장내 미생물 구성 간의 관계를 탐구하기 위해 환경 미생물 다양성을 조절하는 능력을 보여줍니다.

Caenorhabditis elegans의 마이크로바이옴 연구를 위한 미생물적으로 다양하고 자연과 유사한 환경으로서의 소우주를 퇴비화

여기에 제시된 것은 미세 가공된 멀티웰 장치의 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 이 접근 방식을 통해 활동, 신체 크기 및 모양, 움직임 기하학 및 생존을 포함하여 노화 및 건강과 관련된 다양한 표현형에 대해 개별 동물을 평생 동안 모니터링할 수 있습니다.

Multi-well 장치의 고체 배지에서 분리된 Caenorhabditis elegans의 장기 배양 및 모니터링Long-term culture and monitoring of isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-well devices

여기에서 우리는 평생 생리학적 매개변수 추적 및 형광 정량화를 위해 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양 시스템에는 동물이 도망가는 것을 방지하기 위해 단일 벌레 우물 주위에 팔미트산 장벽이 포함되어 있어 병원성 박테리아 및 화학적 스트레스 요인을 포함한 혐오적인 개입을 사용할 수 있습니다.

Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양

배우세요 Caenorhabditis elegans의 3차원 배양 시스템 구축 방법을. NGT-3D와 NGB-3D 기법을 활용하여 선충의 자연 서식지와 유사한 환경에서 발달, 생리 및 행동을 연구할 수 있습니다.

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