의 재배 예쁜 꼬마 선충 실험실에서 세 가지 차원에서

이 절차의 전반적인 목표는 자연 조건을 더 잘 시뮬레이션할 수 있는 선충을 위한 3차원 배양 시스템을 제조하는 것입니다. 이 방법은 예쁜꼬마선충의 발달, 생리학 및 행동 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 3D 환경인 썩어가는 과일에서 자연적인 선충 행동을 연구할 때 처음 떠올랐습니다.

이 기술은 선충이 자연의 3D 서식지에 서식하기 때문에 표준 2차원 재배 기술에 비해 이점이 있습니다. 이 방법은 예쁜꼬마선충 재배용으로 개발되었지만 다른 선충에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 이동영(Tong Young Lee

이 절차를 시작하기 위해 Otto Clave는 준비된 용액을 섭씨 121도에서 15분 동안 사용합니다. 다음으로, 멸균 콜레스테롤 용액 50ml를 밀리리터당 5밀리그램으로 준비합니다. 50ml 원뿔형 튜브에 콜레스테롤 0.25g과 99.99% 에탄올 50ml를 넣고 잘 섞습니다.

그런 다음 50 벤트 주사기 필터가 있는 0.45ml 주사기를 사용하여 콜레스테롤 용액을 살균하고 미발달 콜레스테롤을 제거합니다. 그런 다음 10ml의 용원 육수에 박테리아를 접종합니다. 박테리아 접종을 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.

연속 희석을 준비하기 위해 9ml의 염화나트륨 용액을 7개의 멸균 15ml 원추형 튜브에 할당합니다. Opi 50 Strain E Coli의 7 배 희석의 텐트를 만들기 위해. 그 후, 1 밀리리터의 박테리아 배양액 또는 희석 된 박테리아 배양액을 9 밀리리터의 염화나트륨 용액이 담긴 새 튜브에 튀어 나옵니다.

그리고 혼합물을 잘 와류로 만듭니다. 박테리아 배양을 준비한 후 500ml 플라스크에 염화나트륨 0.6g, 과립 오거 1g, 펩톤 0.5g을 추가합니다. 마그네틱 교반 막대를 플라스크에 넣습니다.

그런 다음 증류수 195ml를 넣고 플라스크를 알루미늄 호일로 덮습니다. 다음으로, Otto Clave는 섭씨 121도에서 15분 동안 샘플을 클레이브합니다. 그런 다음 뜨거운 Otto Claved 플라스크를 교반 플레이트에 넣고 섭씨 40도에 도달할 때까지 최소 2시간 동안 적당한 속도로 저어줍니다.

또는 플라스크를 교반 플레이트에 옮기기 전에 섭씨 40도의 수조에 15분 동안 넣어 섭씨 40도까지 냉각할 수 있습니다. 여기에서 계속하므로 충분히 식히십시오. 고온은 완성된 오거를 흐리게 할 수 있지만 온도가 너무 낮으면 오거가 조기에 경화될 수 있습니다.

오거 매체의 온도가 섭씨 40도에 도달하면 염화칼슘, 콜레스테롤 용액, 황산마그네슘 및 인산칼륨 완충액을 넣고 용액을 계속 저어줍니다. NGT-3D 수명 분석의 경우 80마이크로리터의 150mm FUDR을 배지에 첨가하여 최종 농도가 120마이크로몰이 됩니다. 그런 다음 6ml의 오거 매체를 멸균 원뿔형 튜브에 넣고 인큐베이터에서 따뜻하게 유지합니다.

이 매체는 박테리아가 없는 최상층에 사용됩니다. 다음으로, 6ml의 희석된 박테리아 배양액을 멸균된 벤치에서 플라스크에 직접 추가합니다. NGT-3D의 경우 8ml의 투명 플라스틱 시험관에 6.5ml의 매체를 부어 박테리아 오거 층을 형성합니다.

그리고 반 경질 3D 미디어 위에 200 마이크로 리터의 박테리아가 없는 미디어를 조심스럽게 분배하여 위에 얇은 박테리아 없는 층을 만듭니다. 그런 다음 챔버의 덮개를 단단히 닫으십시오. NGB-3D의 경우 25cm 제곱미터의 투명 플라스틱 세포 배양 병에 65ml의 배지를 붓습니다.

그런 다음 챔버를 일주일 동안 실온에서 수직으로 배치하여 박테리아 콜로니가 최소 1mm 직경의 상당한 크기로 자랄 수 있도록 합니다. 이 절차에서는 L 4단계 웜을 선택하여 박테리아가 없는 NGM 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 지렁이가 몸에서 박테리아를 제거하기 위해 몇 분 동안 자유롭게 움직이도록 합니다.

그리고 절차를 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 깨끗한 웜을 3D 미디어 표면에 조심스럽게 놓습니다. 웜은 실제로 오거를 3D 오거 매트릭스에 입력했어야 합니다.

그런 다음 덮개를 느슨하게 닫아 섭씨 20도에서 96시간 동안 배양합니다. 4일 후 뚜껑을 단단히 닫고 NGT-3D 배양실을 섭씨 88도의 수조에 넣어 오거를 녹입니다. 유리 피펫을 사용하여 용융된 매체를 9cm 플라스틱 페트리 접시에 옮깁니다.

그 후, 투과 입체 해부 현미경을 사용하여 L3, L4 및 성체 단계에서 벌레의 수를 계산합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 NGT-3D의 구조는 오거 전체에 작은 박테리아 군집이 있는 오거로 채워진 시험관을 생성하는 간단하고 간단한 프로토콜입니다. 예쁜꼬마선충이 NGT-3D에서 정상적으로 감소하고 성장할 수 있는지 확인하기 위해 생식력과 유충 발달을 표준 2D NGM 플레이트와 3D로 비교합니다.

상대적 무리 크기 분석에서 NGT-3D의 성체 예쁜꼬마선충 자웅동체는 박테리아 군체가 60개 이상의 군체로 풍부할 때 표준 2D MGM 플레이트에서 자웅동체와 마찬가지로 번식했습니다. 또한, NGT-3D의 유충 발달은 박테리아 군집이 많고 대부분의 기생충이 96시간 후에 성체 상태가 될 때 정상적으로 진행됩니다. 그러나 3D 매트릭스에 박테리아 군집이 희박하면 상대적인 무리 크기와 유충 발달 모두에 부정적인 영향을 미칩니다.

다음은 NGT-3D 또는 NGM 플레이트에서 야생형 C형 예쁜꼬마선동물의 생존 곡선입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 수명 분석 및 행동 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 노화 및 행동에 대한 질문에 3D로 답할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 유전학 분야의 연구자들이 예쁜꼬마선충의 생태학과 진화에 대한 질문을 탐구할 수 있는 길을 열 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 3D 실험실 환경에서 선충을 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.