소변 샘플에서 셀 무료 DNA 무결성 분석

이 방법의 전반적인 목표는 특정 종양유전자 염기서열에서 소변 cell-free DNA의 무결성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 방광암 및 전립선암의 조기 비침습적 진단과 같은 비뇨기과 암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 수행 및 분석이 쉽다는 것입니다.

이 기술의 의미는 비뇨기과 악성 종양의 진단으로 확장되는데, 이는 일반적으로 소변에서 세포와 유리 핵산을 방출하기 때문입니다. 이 방법은 소변 샘플에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 혈청이나 혈장과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 소변 cell-free DNA의 농도가 낮은 경우가 많기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 방법에 대한 아이디어는 방광암의 비침습적 조기 발견을 위한 간단한 방법을 찾으려고 했을 때 처음 떠올랐습니다. 절차를 시작하려면 섭씨 4도에서 3시간 이상 보관되지 않은 50ml의 첫 번째 아침 소변 샘플을 얻습니다. 샘플을 두 번 뒤집은 다음 샘플을 두 개의 50ml 원추형 원심분리 튜브로 분할합니다.

섭씨 4도에서 10분 동안 850배 G로 시료를 원심분리합니다. 그런 다음 각 튜브에 대해 상등액 상부 10 밀리리터를 2 개의 5 밀리리터 튜브로 옮기고 펠릿 위에 최소 2 밀리리터의 상등액을 남겨 둡니다. 펠릿을 버리고 상등액을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

필요에 따라 추가 소변 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다. DNA 정제를 시작하려면 각 샘플에 대해 소변 상층액의 분취액을 해동합니다. 해동된 샘플을 소용돌이치고 튜브를 두 번 뒤집습니다.

샘플 1ml를 5ml 튜브에 넣고 나머지는 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 제조업체의 지침에 따라 소변 샘플에 적합한 DNA 정제 키트를 준비합니다. 100마이크로리터의 proteinase K와 1ml의 용해 완충액을 샘플에 추가하고 피펫으로 잘 섞습니다.

샘플을 섭씨 56도에서 15분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 스핀 컬럼에서 세척 버퍼를 준비합니다. 배양 후 샘플을 실온으로 식힌 다음 1ml의 앱솔루트 에탄올을 첨가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.

650마이크로리터의 샘플을 컬럼으로 옮깁니다. 6000회 G에서 1분 동안 원심분리기. 채취 튜브를 교체하고 모든 샘플이 컬럼에 로드될 때까지 이 과정을 반복합니다.

그런 다음 500마이크로리터의 첫 번째 세척 버퍼를 추가하고 1분 동안 6000배 G로 컬럼을 원심분리합니다. 수집 튜브를 교체하고 두 번째 세척 버퍼를 500마이크로리터씩 추가한 다음 3분 동안 최대 속도로 컬럼을 원심분리합니다. 컬럼을 깨끗한 채취 튜브에 넣고 최대 속도로 3분 더 원심분리하여 잔여 세척 버퍼를 제거합니다.

컬럼을 깨끗한 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 50마이크로리터의 용리 완충액을 컬럼에 로드하고 버퍼가 7분 동안 컬럼에 스며들도록 합니다. 그런 다음 6000배 G로 컬럼을 1분 동안 원심분리합니다.

용리액을 다시 피펫으로 주입하고 1분 동안 최대 속도로 컬럼을 원심분리하여 소변 cell-free DNA를 얻습니다. 표준물질 준비를 시작하려면 먼저 정제 키트를 사용하여 적절한 세포주에서 DNA를 분리하십시오. 키트 제조업체의 지침에 따라 분광 광도계를 사용하여 세포주에 있는 각 정제된 소변 샘플의 DNA를 정량화합니다.

UCF DNA를 마이크로리터당 1나노그램으로 희석하고 무결성 테스트를 위해 준비될 때까지 희석된 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 세포주 DNA를 희석하여 서로 다른 농도의 6개, 100마이크로리터 표준물질을 생성합니다. 표준은 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

DNA 무결성 검사를 시작하려면 UCF DNA 샘플, 표준물질, 적절한 PCR 프라이머 및 그린 슈퍼믹스를 얼음에서 해동합니다. 그런 다음 스트립 튜브가 있는 72웰 로터 디스크 플레이트를 설정합니다. 10마이크로리터 표준 분취량 2개를 놓고 각 샘플을 웰에 넣습니다.

10마이크로리터 RNase가 없는 물의 두 우물을 음성 대조군으로 준비합니다. 채워진 각 웰에 대해 각 프라이머 1마이크로리터, 녹색 슈퍼믹스 12.5마이크로리터 및 RNase가 없는 물 6.5마이크로리터의 혼합물을 준비합니다. 15마이크로리터의 혼합물을 채워진 각 웰로 옮긴 다음 웰을 72웰 로터 디스크로 옮깁니다.

제조업체의 사양에 따라 Realtime 기기로 PCR을 수행합니다. 기기 소프트웨어를 사용하여 반복실험에서 하나 이상의 사이클링 임계값 차이가 있는지 확인합니다. 분석에서 해당 샘플을 버리고 나머지 샘플에 대한 중앙값 사이클링 임계값을 평가합니다.

PCR 산물 특이성을 평가하기 위해 중앙값 사이클링 임계값 36 이하로 각 샘플에 대해 용융 분석을 수행합니다. 그런 다음 표준 곡선을 사용하여 각 응용 프로그램에 대한 농도(마이크로리터당 나노그램)를 결정합니다. 소변 cell-free DNA를 분리하고 고형 종양에서 DNA 복제 수가 증가한 4개 영역에서 DNA 무결성을 평가했습니다.

각 샘플의 DNA 양이 무결성 테스트에 충분한지 확인하기 위해 대조 순서도 평가했습니다. 총 유리 DNA 농도 및 변이 계수는 각 유전자에 대해 계산되었습니다. 이 방법은 방광암을 검출하는 데 73%의 민감도와 84%의 특이도를 보이지만 전립선암에 대해서는 58%의 민감도와 44%의 특이도만을 보입니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 하루 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 디지털 PCR 또는 차세대 염기서열분석과 같은 다른 방법을 수행하여 관심 유전자의 복제 수 유도와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 매우 간단한 방법으로 소변에서 cell-free DNA를 분리하는 방법과 실시간 PCR 접근법을 사용하여 특정 관심 영역의 무결성을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.