세포 유래 세포 외 매트릭스의 빠른, 분리, 기능 연구에 대한 확장 방법, 및 분석

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 다운스트림 실험을 위해 배양된 세포에서 세포외 기질을 분리하여 정상 조직 및 질병 과정에서 세포외 기질의 기능과 특성을 이해하는 데 도움이 되는 것입니다. 이 방법은 세포외 기질의 조직, 분자 구성, 단백질 상호 작용 또는 기능적 특성과 같은 세포외 기질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 세포외 기질은 모든 부착 세포 유형에서 준비할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 세포를 효율적으로 제거하고 세포 외 기질 단백질을 유지하기 위해 다양한 규모로 수행할 수 있다는 것입니다. 제 연구실의 대학원생인 실비아 로시니(Silvia Rosini)와 박사 후 연구원인 앤드류 헬레웰(Andrew Hellewell)이 시연을 할 것입니다. 우선, 커버의 플레이트 세포는 살아있는 세포와 세포외 기질 또는 ECM의 이미징을 위해 미끄러집니다.

개화 현미경 연구의 경우 고정 ECM. 또는 소규모 기능 연구를 위한 세포 유래 ECM 준비에 사용됩니다. 세포가 ECM을 침착할 수 있도록 적절한 시간 동안 적절한 온도와 습도에서 세포를 배양합니다.

일반적으로 16시간 이상입니다. 추출기 후드에서 탈이온수를 사용하여 원액을 1로 14로 희석하여 적절한 용기에 20밀리몰의 수산화암모늄을 준비합니다. 인큐베이터에서 세포를 제거하고 배양 배지를 부드럽게 제거합니다.

그런 다음 칼슘이나 마그네슘이 없는 PBS를 접시 벽에 부드럽게 부어 추가합니다. 접시를 두 번 흔들고 액체를 붓습니다. 그런 다음 세탁을 두 번 더 반복합니다.

추출기 후드에서 마지막 PBS 세척을 제거하고 60mm 접시당 1.5ml의 수산화암모늄을 추가한 다음 플레이트를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 모든 세포의 용해를 보장하기 위해 매분마다 접시를 부드럽게 저어줍니다. 다음으로, 각 접시에 많은 양의 탈이온수를 넣고 접시를 흔듭니다.

그런 다음 수산화암모늄, 용해된 세포 및 탈이온수로 구성된 수산화암모늄 용해 물질을 붓습니다. 불용성 ECM 층을 다량의 탈이온수로 4회 더 세척하여 모든 수산화암모늄 용해 물질을 완전히 제거합니다. 세포를 탈이온수로 충분히 세척하여 완전히 제거하는 것이 중요합니다.

이러한 단계를 적절하게 수행하지 않으면 세포 물질이 접시에 남아 다운스트림 분석을 오염시킬 수 있습니다. 면역형광으로 ECM을 검사하려면 남아있는 탈 이온수를 제거하고 2 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 첨가하여 ECM을 고정 한 다음 접시를 실온에서 10 분 동안 배양합니다. PBS를 사용하여 각 고정 샘플을 두 번 세척하고 텍스트 프로토콜에 따라 형광 현미경 검사를 수행하기 전에 용액을 액체 폐기물 용기에 폐기합니다.

층류 후드에서 칼슘 및 마그네슘, 20밀리몰 수산화암모늄 및 탈이온수가 없는 PBS의 멸균 용액을 0.2마이크로미터 멸균 필터를 통해 적절한 멸균 용기에 통과시켜 준비합니다. 멸균 기술을 유지하면서 멸균 PBS를 사용하여 커버 슬립의 매트릭스 생산자 세포를 세 번 부드럽게 세척합니다. 최종 PBS 세척을 제거한 후 60mm 접시에 1.5ml의 멸균 수산화암모늄을 넣고 간헐적으로 흔들면서 실온에서 5분 동안 배양합니다.

흔들림과 함께 접시에 다량의 멸균 탈이온수를 넣고 세포 용해물을 적절한 폐기물 용기에 붓습니다. 이 세척을 네 번 더 반복하여 용해된 물질이 완전히 제거되도록 합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 트립신화 및 펠릿화한 후 새로운 멸균 배지에 테스트 세포를 재현탁시키고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.

그런 다음 적절한 수의 테스트 세포와 배양 배지를 커버 슬립의 멸균 분리 ECM에 플레이트하고 2-3시간 동안 또는 필요한 시간 동안 배양합니다. 액틴 세포골격의 조직을 검사하려면 테스트 세포를 2%PFA에 고정하고 FITC-팔로이딘으로 염색하여 F-액틴을 시각화하고 DAPI로 염색하여 핵을 시각화합니다. 많은 수의 세포를 배양한 다음 세포를 제거하고 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 ECM을 세척한 후 각 플레이트를 비스듬히 기울여 접시 바닥으로 남아 있는 물을 배출하고 P200 피펫을 사용하여 플레이트가 완전히 마를 때까지 남아 있는 물을 조심스럽게 제거합니다.

동시에 100 밀리몰 DDT를 포함하는 SDS-PAGE 샘플 버퍼를 2 분 동안 섭씨 95 도에 가열하고 면역 블롯으로 검사 할 각 100 밀리미터 플레이트에 200 마이크로 리터를 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 샘플을 접시의 한쪽 면으로 모으고 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 튜브로 옮깁니다. 질량 분석법으로 ECM을 분석하려면 접시에서 SDS-PAGE 샘플 버퍼를 채취하여 섭씨 95도로 재가열한 다음 2-3개의 추가 플레이트에 동일한 부분 표본을 사용하여 보다 농축된 샘플을 준비합니다.

셀 스크레이퍼 팁에서 추출한 잔류 SDS-PAGE 샘플 버퍼 추출물을 튜브로 옮겨 ECM 물질의 손실을 최소화합니다. 분리된 ECM을 SDS-PAGE 시료 완충액으로 효과적으로 추출하려면 시료 완충액을 95도로 가열하고 환원제를 함유하며 플레이트를 광범위하게 긁어내는 것이 중요합니다. 다음은 유리 커버 슬립에서 자란 COS-7 세포입니다.

수산화암모늄 처리는 세포핵과 액틴 세포골격의 손실에 의해 확립된 바와 같이 세포를 효과적으로 제거했습니다. 이 그림에서 COS-7 세포는 RFP 태그 트롬보스폰딘-1로 형질주입되었습니다. 그리고 ECM은 수산화암모늄 처리 전후에 시각화되었습니다.

두 이미지에서 식별된 형광 반점은 ECM과 관련이 있는 것으로 추론됩니다. 이 실험에서는 인간 진피 섬유아세포를 수산화암모늄으로 제거하고 ECM을 항콜라겐 1 항체로 조사하여 특징적인 비골 및 그물망 염색 패턴을 보여주었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 피브로넥틴 염색은 수산화암모늄에서 추출한 쥐 연골 육종 세포로부터 ECM에서 수행되었습니다.

이 예시에서는 RCS 세포에 의해 생성된 멸균 ECM에 테스트 COS-7 세포를 2시간 동안 도말하고 FITC-팔로이딘 염색에 의한 F-actin 조직을 분석했습니다. COS-7 세포가 자체 ECM을 생성하는 것과 비교됩니다. 이 실험에서 ECM은 쥐 연골 육종 세포에서 분리되었으며 ECM 유래 단백질은 SDS-PAGE로 분리되었습니다.

그리고 4개의 주요 밴드를 분리하여 질량 분석법으로 분석했습니다. 피브로넥틴(Fibronectin), 트롬보스폰딘-1 및 5, 마트릴린-1이 확인되었다. 마지막으로, 인간 진피 섬유아세포의 내인성 ECM을 면역블로팅으로 분석했습니다.

피브로넥틴(Fibronectin)과 트롬보스폰딘-1(thrombospondin-1)은 검출된 반면, 세포 내 단백질인 알파-튜불린(alpha-tubulin)과 베타-액틴(beta-actin)은 없었다. 일단 마스터링되면 수산화암모늄으로 세포를 제거하고 3개의 100mm 접시에서 뜨거운 SDS-PAGE 샘플 버퍼로 ECM을 추출하는 작업을 적절하게 수행하면 1시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포를 제거하기 위해 매번 새로운 수산화 암모늄 작업 용액을 만드는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

모든 세포를 제거하기 위해 탈이온수로 충분히 세척하는 것도 매우 중요합니다. 이 절차에 따라 추출된 ECM의 단백질체학 분석과 같은 방법을 수행하여 다양한 세포 유형에 의해 생성된 ECM 단백질의 상대적 풍부함과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포 배양 접시에서 세포를 효율적으로 제거하는 방법과 ECM을 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

파라포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 추출기 후드에서 작업하고 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.