Name: GFP - 태그 TMEM184A를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 배우세요 GFP-태그 TMEM184A를 이용한 헤파린 수용체 신원 확인 방법입니다. 전자기전법과 형광 현미경을 활용하여 고아 유전자의 기능적 식별을 수행하는 이 기법은 혈관 세포에서 단백질 역할을 규명하는 데 활용됩니다.

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Lowe-Krentz 실험실의 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 LLK에 HL54269 연구 보조금의 지원을 받습니다.

<ol><li>Pugh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+Protein+184A+Is+a+Receptor+Required+for+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Responses+to+Heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin.</a> J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).</li>
<li>Daher, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27063980">Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P.</a> Mol Biochem Parasitol. , (2016).</li>
<li>Vit, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+membrane+proteins+based+on+analysis+of+trypsin-protected+transmembrane+segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments.</a> J Proteomics. , (2016).</li>
<li>Attwood, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+based+identification+and+comprehensive+classification+of+four-transmembrane+helix+containing+proteins+%284TMs%29+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome.</a> BMC genomics. 17, 268(2016).</li>
<li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Identification+of+Jatropha+curcas+Aquaporin+Genes+and+the+Comparative+Analysis+Provides+Insights+into+the+Gene+Family+Expansion+and+Evolution+in+Hevea+brasiliensis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis.</a> Front Plant Sci. 7, 395(2016).</li>
<li>Gilotti, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+responses+in+vascular+smooth+muscle+cells+involve+cGMP-dependent+protein+kinase+%28PKG%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG).</a> J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).</li>
<li>Farwell, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+Decreases+in+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+%28TNFalpha%29-induced+Endothelial+Stress+Responses+Require+Transmembrane+Protein+184A+and+Induction+of+Dual+Specificity+Phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1.</a> J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).</li>
<li>Xu, D., Esko, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demystifying+heparan+sulfate-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Demystifying heparan sulfate-protein interactions.</a> Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).</li>
<li>Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin%2FHeparan+sulfate+proteoglycans+glycomic+interactome+in+angiogenesis%3A+biological+implications+and+therapeutical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use.</a> Molecules. 20, 6342-6388 (2015).</li>
<li>Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+realignment+and+cofilin+regulation+are+essential+for+barrier+integrity+during+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress.</a> J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).</li>
<li>Patton, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+heparin-binding+protein+using+monoclonal+antibodies+that+block+heparin+binding+to+porcine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells.</a> The Biochemical journal. 311, Pt 2 461-469 (1995).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Skalamera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+genome+scale+lentiviral+vector+library+for+EF1alpha+promoter-driven+expression+of+human+ORFs+and+identification+of+human+genes+affecting+viral+titer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer.</a> PloS one. 7, 51733(2012).</li>
<li>Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turn-on+switch+in+parathyroid+hormone+receptor+by+a+two-step+parathyroid+hormone+binding+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).</li>
<li>Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+with+the+EGFP-mCherry+fluorescent+protein+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair.</a> Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+the+ATP-sensitive+potassium+channel+complex+examined+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer.</a> J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).</li>
<li>Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+a+Potent+Free+Fatty+Acid+Receptor+1+%28FFA1%29+Fluorescent+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer.</a> J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).</li>
<li>Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+rendered+susceptible+to+proteolysis%3A+positions+for+protease-sensitive+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions.</a> Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에보고 된 프로토콜은 혈관 세포 1 헤파린 수용체로서 TMEM184A의 식별 확증 증거를 제공하도록 설계되었다. 최저 기술은 정기적으로 신규 단백질의 식별을 확인하기 위해 하나의기구로 사용된다. 그러나, 최저 후 일부 기능적 손실 후보 단백질 실제로 정확한 수용체 충분한 증거 (또는 다른 기능성 단백질)은 일반적 아니다. 이는 후보 단백질이 실제로 기능을 발휘한다는 증거를 갖는 것이 중요하다. GFP 태그 새로운 유전자에 대한 구조를 채용하는 기능 실험의 이득을 가능하게하고 GFP 선호도에 따라 태그 단백질의 분리를 용이하게한다. 이 프로토콜에서 사용되는 전기가 (셀의 80 % 이상이 구조를 나타냄) 구조체의 매우 높은 형질 전환 효율을 용이. 일렉트로 사용할 여부를 원하지 않는 경우에는, 다른 형질 전환 메커니즘이 사용될 수있다. 신규 단백질의 기능을 확인하는 GFP 태깅 구조를 선택하는 여러 가지 이점이있다. 우선, GFP는 형질 전환 유전자 발현에 대한 리포터로서 작용하며, ...

새로운 기능에 대한 후보 단백질의 식별은 종종 부분 서열 결정 하였다 선호도 기반 격리 프로토콜에 따라 달라집니다. 새로 확인 된 단백질의 최근 사례는 횡단 단백질 184A (TMEM184A), 헤파린 친 화성 상호 작용 1 일 이후에 확인 된 헤파린 수용체 및 TgPH1, 포스의 PI (3,5) P (2) (2)를 결합하는 플렉스 트린 상동 도메인 단백질을 포함한다. 다른 신규 한 단백질의 식별은, 등 비타 의한 것과 펩티드의 직접적인 서열 분석을 포함한다. 누가 미리지지 않은 유전자에서 3 단백질 제품을 식별하는 트랜스 펩티드를 사용했다. 이와 유사하게, 신규 한 단백질 서열의 확인은 새로운 4TM 단백질 (4)의 식별 앞서있어서 단백질 패밀리의 검색 생물 정보학을 이용하여 달성 될 수있다. 아쿠아 포린 가족 유전자 서열의 검사 등이있다그래서 새로운 기능 5 새로운 회원의 식별을 얻었다. 식별 한 후, 단백질의 기능 분석은 종종 예컨대 아쿠아 포린 마찬가지로 단백질 기능에 대한 구체적인 분석을 이용하여 조사 할 수있는 다음 단계는 전형적이다. 가능하면, 새로 확인 된 단백질의 기능은 특정 효소 또는 유사한 생체 외 기능 분석으로 관찰 할 수있다. 새로운 단백질의 많은 기능은 체외 분석에서 만 그대로 세포 또는 유기체에서 발생하는 복잡한 상호 작용에 의존하기 때문에 항상 적용되지 않습니다. 그러나, 생체 내 분석은 그들이 유전자 서열에 의존하는 방식으로 설계되어야한다. 세포 배양 및 / 또는 간단한 모델 생물에서 최저 단백질 / 기능 식별 6 뒷받침하는 근거를 제공 할 수 있습니다. 전술 한 바와 같이 식별 된 신규 단백질,이 기능을 확인하기 위해 단순히 단백질 노크 종종 불충분D 유전자 서열에 의존 생체 기능 분석의 디자인은 신규 한 단백질의 특성에 중요해진다. 최저의 식별과 일치하는 결과를 얻었다 후 헤파린 수용체로서 TMEM184A 최근 식별은 친 화성 크로마토 그래피와 MALDI MS 1을 사용하는 (즉, 혈관 평활근 및 내피 세포에서 염증 반응에서 확산 변조), 7은 분석의 컬렉션을 개발할 수있는 기회를 제공 . 최근의 검토 헤파린은 다양한 성장 인자, 이들의 수용체, 세포 외 매트릭스 성분, 세포 부착 수용체와 다른 단백질 8 구체적으로 작용 함을 확인 하였다. 혈관계, 헤파린 및 헤파 란 설페이트 프로테오글리칸에 수백 9 단백질과 상호 작용 (헤파린 유사한 구조 헤파 란 황산 사슬 함유). 기능적으로 그쪽을 확인하려면t TMEM184A는 헤파린 흡수 및 결합에 관여하고, TMEM184A의 유전자 구조를 이용 기술이 개발되었다. 본 보고서는 GFP-TMEM184A에 기초 분석법 모음 헤파린 수용체 TMEM184A 등의 신원 확인에 사용하기 위해 구성 포함한다.

<table><tbody><tr><td>GFP-TMEM184A 구조</td><td>OriGene</td><td>RG213192</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-204</td><td>Light Sensitive</td></tr><tr><td>Fluorescein-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-201</td><td>Light Sensitive</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>EMD Millipore</td><td>475904-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, methanol free)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, Fisher Scientific</td><td>PI28908</td> 통해 <td>사용 Fume Hood</td></tr><tr><td>Reacti-bind neutravidin 플레이트(Avidin 코팅된 검은색 96웰 플레이트)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, Fisher Scientific</td><td>PI15510</td> 통해 <td>유통 기한이 있는</td></tr> 검은색 96웰 플레이트에 주의 Fisher <tr><td></td><td></td><td></td> A7r5 혈관 평활근 세포에서 <td>Fisher Scientific 064432를 통해 구매한 Corning Life Sciences Plastic</td></tr>에 사용 <tr><td> line</td><td>ATCC</td><td>CRL 1444</td><td>MEM medium1</td></tr><tr><td>BAOEC 소 대동맥 내피 세포</td>로 교환 가능 Cell <td>Applications, Inc.</td><td>B304-05</td><td>배양액은 초기에 권장되는대로 지속적인 배양을 위해 MEM 배지로 교환 할 수 있습니다1,7</td></tr><tr><td>BAOSMC 소 대동맥 평활근 세포</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B354-05</td><td>배양액은 초기에 권장하는 대로 지속적인 배양을 위해 MEM 배지로 교환할 수 있습니다1</td></tr><tr><td>RAOEC 쥐 대동맥 내피 세포</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>R304-05a</td> 배양액은 처음에 권장되는 바와 같이 Fisher Scientific MA5-15256-BTIN Streptavidin-coated beads Sigma S1638 <td>HeBS를 통해 배양을 계속하기 위해 MEM 배지로 교환할 수 있습니다7</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-GFP</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech</td><td></td>는 Bio-Rad에서 사용할 수 있습니다.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> pH는</td></tr><tr><td>N-말단</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc292006</td>에 대한 항체 6.8 <td>TMEM184A N-말단 영역에 대한 항체TMEM184A 알려져 있습니다.</td></tr><tr><td>C-말단에 대한 TMEM184A 항체</td><td>ProSci Inc, Poway, CA&nbsp에서 획득</td>;<td></td><td>Figure 1</td></tr><tr><td>GFP 항체</td>에 사용되는 <td>Pro Sci Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc9996</td><td>Figure 5</td></tr><tr><td>Secondary antibodies, TRITC 또는 Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td><td>711 025 152 (당나귀 안티 마우스, TRITC) 715 165 150 (당나귀 안티 마우스, Cy3)</td> <td>비특이적 염색을 최소화하기 위해 교차 반응성이 최소화됩니다.</td></tr><tr><td>CHAPS</td> Sigma <td>C5849</td><td>에서 구매</td> 이 <td>특정 카탈로그 번호는 중단되었음을 유의하십시오.&nbsp; 공급업체는 교체에 관한 정보를 제공합니다.</td></tr><tr><td>라이브 이미징 35mm 접시</td><td>MatTek (Ashland MA)</td><td>P35G-1.0 &ndash; 20mm - C</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens</td><td>Figure 1, 2 and 3</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens <</td><td>strong>Figure 5</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 880, 63X 오일 이멀젼 렌즈 포함</td><td><강한>Figure 2C</강한></td></tr><tr><td>Electroporation 장비의</td> 이미지에 사용 <td>Bio-Rad</td><td>Gene Pulser X-Cell System</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳</td> MidSci <td>EC2L</td><td>에서 구할</td> 수 있습니다. 장비 공급업체인 Plate reader TECAN TECAN Infinite&reg; m200 Pro<td>에서도 구할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td> 플레이트 리더</td><td>표면이 아닌 우물 중앙에서 판독합니다.</td></tr><tr><td>염색 강도를 측정하기 위한 컴퓨터 프로그램</td><td>Image J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ 온라인에서 사용할 수 있는 프로그램 및 정보</td><td>적절한 프로그램을 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html 참조하십시오&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>세포 배양 트립신 용액</td><td>Sigma</td><td>T4174</td>를 <td>10x 용액으로 구매</td></tr></tbody></table>

gfp - 태그 tmem184a를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

새로운 단백질 선호도 기반 격리 및 생물 정보학 분석을 통해 확인하면, 그들은 종종 크게지지 않은 있습니다. 예측 된 시퀀스 내의 특정 펩타이드에 대한 항체는 일부 현지화 실험을 할 수 있습니다. 그러나, 다른 항체와의 상호 작용에 종종 배제 할 수 없다. 이러한 상황은 단백질 서열 분석에 의존 세트를 개발하기위한 기회를 제공했다. 특히, 단백질의 C 말단에 GFP 코딩 서열에 연결된 유전자 서열을 함유하는 작 제물을 수득하고 이러한 목적으로 사용 하였다. 실험 지역화 리간드 친 화성을 특징, 기능 및 이득은 원래 설계 헤파린 수용체 1과 TMEM184A의 식별을 확인하기 위해 수행되었다. 또한, 막 구조는 토폴로지 질문 상세한 단백질 - 리간드 상호 작용을 어드레싱 연구에 사용될 수있다. 본 보고서는 아칸소를 제공합니다쉽게 다른 새로운 단백질을 위해 적용 할 수있는 혈관 세포에서 발현되는 GFP-TMEM184A 구조를 기반으로 실험 프로토콜의 플랜지.

이론적으로, 어떤 DNA의 형질 전환은 친 유성 형질 전환 시약으로 수행 할 수있는 세포로 구성,하지만, 이전 보고서는 GFP의보다 효과적인 형질은 전기 (12)를 사용하여 내피 세포로 구성한다 나타냅니다. 여기서 제공되는 프로토콜은 통상적으로 사용되는 주 유래 내피 세포 및 평활근 세포의 80 % 이상에서 발현은 GFP-구성하였습니다. 고용 구조의 디자인은 빠른 속도로이 구조를 제공 할 수있는 상업적으로 사용할 수있는 시스템을 사용했다. 주요 용도는 최적의 진핵 세포 단백질 발현 및 주요 고려 사항이었다 계속 구조물 생산과 함께 위치 문제, 멤브레인에 따라서 정확한 전달에 집중했다. 포함 할 수 있습니다 기타 고려 사항 : 접힌 영역의 일부인 C 말단, 둘다 특별한 능력이있다 구내의 가능성과 다르게 지역화 된 단백질 또는 단백질에 대한 GFP의 다른 위치NG가 GFP (프로테아제 절단 부위를 추가) 및 2 친 화성 부위를 제...

진핵 세포 발현을 위해 디자인 된 카르복시 말단에 GFP 태그 컨스 부호화 TMEM184A는 혈관 세포에서 헤파린 수용체로서 TMEM184A의 식별을 확인하기위한 분석에 사용 하였다.

GFP - 태그 TMEM184A를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

GFP 표기된 구조물 사용의 전반적인 목표는 GFP를 핸들로 사용하여 이전에 알려지지 않은 단백질의 신원을 확인하는 것입니다. 이 방법은 특정 효소 활성을 확인할 수 없는 경우 희귀 유전자의 기능적 식별에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 GPF 태그를 사용하면 여러 유형의 실험에 동일한 구조를 사용할 수 있다는 것입니다.일반적으로, 이 방법을 처음 사용하는 개인은 transfection이 항상 strong-construct 발현을 초래하는 것은 아니며 세포가 항상 재생되는 것은 아니기 때문에 문제가 발생할 수 있습니다. 우리는 단백질에 대해 생성된 항체만을 사용하여 단백질을 식별하는 것의 어려움을 인식하기 시작했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 먼저 1ml의 HEPES 완충 식염수 전기천공 완충액에 관심 세포를 재현탁시키고 즉시 세포를 얼음 위에 놓습니다.DNA 밀리리터당 20마이크로그램의 최종 농도를 달성하기 위해 충분한 부피의 GFP-TMEM184A 표지된 혈장을 세포에 추가하고 약 0.4밀리리터의 세포를 사전 냉각된 전기천공법 큐벳으로 이동합니다. 세포를 전기천공하십시오. 그런 다음 형질 주입된 세포를 조직 배양 접시에 놓고 접시를 세포 배양 인큐베이터에 24-72시간 동안 놓습니다.transfection 단계는 세포가 생존할 수 없고 GFP-표지된 구조체의 상당한 수준을 발현하지 않는 경우 나머지 실험 작업의 대부분을 효과적으로 완료할 수 없기 때문에 절차의 가장 중요한 단계입니다. 적절한 실험 시점에서, GFP-플라스미드 발현 세포 배양 배지에 로다민 헤파린(Rhodamine Heparin) 100마이크로그램을 첨가하고, 형광 현미경 검사에서 관찰된 바와 같이 원하는 염색 수준에 도달할 때까지 빛으로부터 보호되는 세포를 배양합니다. 다음으로, PBS로 세포를 헹구고 빛으로부터 보호하여 몇 초 동안 부드럽게 흔든 다음 4 % 파라 포름 알데히드로 실내 온도에서 15 분 동안 부드럽게 흔들어 고정합니다.GFP 태그가 지정된 로다민 헤파린 공동 국소화를 평가하려면 적절한 GFP 및 로다민 여기 및 감소된 레이저와 함께 컨포칼 현미경을 사용하여 각 개별 라벨링 실험에서 최소 50개의 세포를 이미지화합니다. 적절한 이미지 분석 프로그램에서 이미지를 검사하여 각 세포에서 상대적인 로다민 발견 및 흡수를 결정하고, 자유형 도구를 사용하여 각 형광 이미지 내의 세포에 동그라미를

using-gfp-tagged-tmem184a-construct-for-confirmation-heparin-receptor

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다.

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

여기에서 우리는 GABA 해마 신경 세포에있는 수용체 표면의 현지화 및 엔도 사이토 시스를 측정하기 위해-bungarotoxin을 α에 결합 형광 알렉사 염료의 사용을 보여줍니다. α-bungarotoxin, 세포막 단백질의 세포 내 이입 매매 분석을 달성 할 수있는 바인딩 짧은 세포 태그 베어링 구조의 사용을 통해.

GABA 수용체 막 현지화 및 인신 매매를 연구하는 α-Bungarotoxin 바인딩 사이트 태그를 사용하여

이 원고는 기능화된 평면 지지 지질 이중층과 접촉하는 T 세포의 면역학적 시냅스 내에서 발생하는 T 세포 항원 수용체(TCR)와 항원 펩타이드 적재 MHC 분자 사이의 결합 역학을 측정하기 위해 (단일 분자) Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 기반 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

핵막 단백질은 많은 기본적인 생물학적 과정에서 중심적인 역할을 하며 다양한 인간 질병과 관련이 있습니다.  이 프로토콜은 LINC 복합체 파괴의 시공간 제어를 허용하는 새로운 Cre/Lox 기반 마우스 모델을 설명합니다.

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

속됨 부정맥은 종종 하나 이상의 이온 채널의 표면에 전달 변경 돌연변이에 의해 야기된다. 여기서는 TSA-201 세포에서 발현 된 재조합 이온 채널의 상대적 총 세포 표면 단백질 발현의 정량 분석을 제공하기 위해 유세포 적응.

유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

여기, 우리가 현재 네이티브, 태그 무료 단위체의 밀리 그램 수량과 작은 유비퀴틴 관련된 한정자 (스모) 과도 융합에 따라 Huntingtin 단백질 (Httex1)의 exon1의 소의 생산을 위한 강력 하 고 최적화 된 프로토콜.

네이티브, 태그 Huntingtin Exon1 모노 머와 스모 융합 전략을 사용 하 여 소의 생성

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

이 원고는 세포외 수용체-리간드 상호 작용을 확인하기 위해 게놈 규모의 세포 기반 스크리닝 접근법을 기술한다.

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

이 문서는 칸디다 알비칸스 ABC (ATP 결합 카세트) 단백질 Cdr1의 특성화를위한 소규모 플라즈마 막 격리 프로토콜을 제시, 사카로미세스 cerevisiae에서 과발현. 프로테아제-클레이블 C-단말 mGFPCdr1과 태그 사이에 16잔류 링커를 장착한 이중 태그는 Cdr1의 정제 및 세제 스크리닝을 용이하게 하도록 설계되었습니다.

칸디다 알비칸스 Cdr1-mGFPHis 분석을 위한 소규모 플라즈마 멤브레인 준비

배우세요 GFP-태그 TMEM184A를 이용한 헤파린 수용체 신원 확인 방법입니다. 전자기전법과 형광 현미경을 활용하여 고아 유전자의 기능적 식별을 수행하는 이 기법은 혈관 세포에서 단백질 역할을 규명하는 데 활용됩니다.

GFP - 태그 TMEM184A를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축

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