GFP - 태그 TMEM184A를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축

GFP 표기된 구조물 사용의 전반적인 목표는 GFP를 핸들로 사용하여 이전에 알려지지 않은 단백질의 신원을 확인하는 것입니다. 이 방법은 특정 효소 활성을 확인할 수 없는 경우 희귀 유전자의 기능적 식별에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 GPF 태그를 사용하면 여러 유형의 실험에 동일한 구조를 사용할 수 있다는 것입니다.

일반적으로, 이 방법을 처음 사용하는 개인은 transfection이 항상 strong-construct 발현을 초래하는 것은 아니며 세포가 항상 재생되는 것은 아니기 때문에 문제가 발생할 수 있습니다. 우리는 단백질에 대해 생성된 항체만을 사용하여 단백질을 식별하는 것의 어려움을 인식하기 시작했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 먼저 1ml의 HEPES 완충 식염수 전기천공 완충액에 관심 세포를 재현탁시키고 즉시 세포를 얼음 위에 놓습니다.

DNA 밀리리터당 20마이크로그램의 최종 농도를 달성하기 위해 충분한 부피의 GFP-TMEM184A 표지된 혈장을 세포에 추가하고 약 0.4밀리리터의 세포를 사전 냉각된 전기천공법 큐벳으로 이동합니다. 세포를 전기천공하십시오. 그런 다음 형질 주입된 세포를 조직 배양 접시에 놓고 접시를 세포 배양 인큐베이터에 24-72시간 동안 놓습니다.

transfection 단계는 세포가 생존할 수 없고 GFP-표지된 구조체의 상당한 수준을 발현하지 않는 경우 나머지 실험 작업의 대부분을 효과적으로 완료할 수 없기 때문에 절차의 가장 중요한 단계입니다. 적절한 실험 시점에서, GFP-플라스미드 발현 세포 배양 배지에 로다민 헤파린(Rhodamine Heparin) 100마이크로그램을 첨가하고, 형광 현미경 검사에서 관찰된 바와 같이 원하는 염색 수준에 도달할 때까지 빛으로부터 보호되는 세포를 배양합니다. 다음으로, PBS로 세포를 헹구고 빛으로부터 보호하여 몇 초 동안 부드럽게 흔든 다음 4 % 파라 포름 알데히드로 실내 온도에서 15 분 동안 부드럽게 흔들어 고정합니다.

GFP 태그가 지정된 로다민 헤파린 공동 국소화를 평가하려면 적절한 GFP 및 로다민 여기 및 감소된 레이저와 함께 컨포칼 현미경을 사용하여 각 개별 라벨링 실험에서 최소 50개의 세포를 이미지화합니다. 적절한 이미지 분석 프로그램에서 이미지를 검사하여 각 세포에서 상대적인 로다민 발견 및 흡수를 결정하고, 자유형 도구를 사용하여 각 형광 이미지 내의 세포에 동그라미를 그리십시오. 측정 도구를 사용하여 원으로 표시된 각 공간 내의 강도를 결정한 다음 형광 강도 데이터를 스프레드시트로 내보내 강도를 곱한 면적을 계산하고 각 셀에 대해 동일한 양의 영역에 대한 배경을 뺍니다.

그런 다음 모든 세포에 대한 세포당 형광의 평균을 구하여 통계적으로 유의미한 데이터를 얻을 수 있습니다. GFP TMEM184A에서 로다민 헤파린으로의 형광 공명 에너지 전달을 용이하게 하기 위해 먼저 고정 GFP TMEM184A 로다민 헤파린 표지 세포를 유리 현미경 슬라이드에 형질 주입했습니다. 로다민(Rhodamine) 방출을 이미징하기 위해 405나노미터에서 세포를 여기(excitation)한 다음 488나노미터를 여기(excitation)하여 GFP 방출을 이미징합니다.

그런 다음 두 번째 로다민 방출 이미징을 위해 561나노미터에서 세포를 여기시킵니다. 로다민 헤파린 흡수의 라이브 셀 이미징을 위해 GFP TMEM184A 트랜스펙션된 세포의 100ml 합류 접시 배양을 635mm 라이브 세포 이미징 접시에 파종하여 합류 부근의 세포를 얻습니다. 48시간 후, 상등액을 페놀 레드가 없는 배양 배지로 교체하고 세포 접시를 섭씨 37도로 설정된 가온 현미경으로 컨포칼 현미경으로 옮깁니다.

현미경의 초점을 맞추고 로다민 헤파린(Rhodamine Heparin) 100마이크로그램을 세포에 부드럽게 섞어 넣습니다. 그런 다음 즉시 라이브 이미지 녹화를 시작하십시오. 시야 내에서 헤파린 흡수가 발생하지 않으면 접시를 약간 움직여 로다민 라벨을 포함하는 하나 이상의 녹색 소포가 있는 세포를 식별합니다.

체외 헤파린 결합 평가를 위해 검은색 아티반 코팅된 96웰 플레이트 1개와 검은색 비코팅된 96웰 플레이트 1개를 200마이크로리터의 0.2%CHAPS PBS 프로웰로 헹구어 5분 동안 3회 흔들어 세척합니다. 마지막 세척 후, 각 GFP 발견 그룹에 대해 아티반 코팅 플레이트에 3배로 비오틴화된 항-GFP를 웰당 100마이크로리터의 60피코몰을 추가합니다. 다음으로, 제어 웰에만 완충액을 추가하고 모든 웰을 플레이트 커버로 밀봉하여 흔들면서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 방금 설명한 것처럼 모든 웰을 CHAPS PBS에서 세 번 세척하고 GFP TMEM184A 웰당 5나노몰 100마이크로리터 또는 GFP만 ativan 코팅된 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 진탕하여 배양한 후 모든 웰을 새로운 CHAPS PBS로 세척하고 각 실험용 플루오레세인-헤파린 농도의 100마이크로리터를 적절한 테스트 웰에 3중으로 아티반 코팅된 플레이트에 추가합니다. ativan-coated 및 non-coated plates에 농도 표준물질을 추가하고, 두 plates를 빛으로부터 보호하여 실온에서 10분 동안 incubation합니다.

이제 플레이트 리더를 사용하여 두 플레이트의 제어 웰에서 초기 헤파린 형광 방출을 기록하고, 아티반 코팅 플레이트에서 고정된 GFP 또는 GFP TMEM184A이 있는 웰에서 초기 총 형광 방출을 기록합니다. 그런 다음 고정된 GFP TMEM184A 또는 GFP가 있는 웰에서 결합되지 않은 형광 헤파린을 코팅되지 않은 블랙 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 코팅되지 않은 블랙 플레이트에서 형광 방출을 즉시 판독한 후, 플루오레세인-헤파린이 제거된 웰에 100마이크로리터의 새로운 CHAPS PBS를 다시 추가하고 이러한 웰에 대한 형광 방출을 판독하여 코팅되지 않은 플레이트에서 제거되고 결합되지 않은 샘플에서 형광 방출을 얻습니다.

모든 언바운드 판독값을 얻었으면 총 헤파린 방출 값을 사용하여 값에서 평균 백그라운드 판독값을 빼서 각 웰에 올바른 수준의 헤파린이 추가되었는지 확인합니다. 그런 다음 추가된 총 플루오레세인-헤파린 대비 방출 플롯을 생성하여 헤파린의 양 대비 방출 규모를 결정하고, GFP 및 GFP TMEM184A 웰 모두에서 삼중체에 대해 추가된 헤파린과 비교하여 수정된 결합 헤파린을 플롯합니다. 형질주입 후의 시간은 GFP TMEM184A의 분포에 영향을 미치며, 이는 최소 72시간 동안 축적되는 것으로 보이며, 시간이 지남에 따라 준핵 영역에서 더 많은 GFP가 명백합니다.

이 대표적인 혈관 세포 배양에서 GFP의 염색 패턴은 GFP가 단백질의 C-말단에 있다는 점을 감안할 때 C 단자 펩티드에 대해 제기된 항체의 염색 패턴과 가장 유사한 것으로 보입니다. fluorescein-Rhodamine-Heparin 리간드의 사용은 시간 경과에 따른 리간드 수용체 공동 국소화의 실시간 평가에도 사용할 수 있습니다. GFP에서 헤파린 흡수를 증가시켜 transfection된 안정적인 녹다운 세포를 구축TMEM184A, 그 결과 야생형 세포 수준 이상에서 로다민 헤파린을 내재화할 수 있는 능력을 회복할 수 있는 세포가 생성됩니다.

입증된 플라스미드 인코딩 GFP 택트 시스템을 사용하여 anti-GFP 항체 분리 GFP TMEM184A 구조는 특정 사트리플 헤파린 결합을 입증하는 반면, 대조군 GFP는 헤파린에 결합하지 않습니다. 항체를 다시 이용한 간단한 면역형광 염색GFP는 비투과성 세포의 항체 접근을 기반으로 GFP 위치에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 원형질막에서 발현된 GFP가 세포 외라는 예비 증거를 제공할 수 있습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 배양의 24 48 시간 후에 우수한 GFP 구조물 표정, 귀착될 수 있습니다.

라이브 이미징 프로토콜을 시도하는 동안 일부 세포는 공동 국소화 흡수를 나타내지 않을 수 있으므로 다른 세포를 검사해야 하는 경우가 많다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. GFP 리간드를 사용한 결합 분석은 특히 세제 미셀에 있는 경우 GFP 단백질의 이량체 또는 고차 응집체에 의해 복잡할 수 있습니다. 전반적으로, GFP 표지된 단백질의 발현은 이전에 알려지지 않은 단백질의 정체성을 확인하기 위해 다양한 실험을 촉진할 수 있습니다.