출생 후의 쥐의 청각 수포의 해부 : 중이의 뼈와 조직 학적 분석의 분리

해부 절차의 전반적인 목표는 이치포와 캡슐을 분리한 다음, 다양한 전체 마운트 및 조직학적 분석을 위해 출생 후 마우스의 개별 청각 이소를 분리하는 것입니다. 이 방법은 형태 형성 불량, 연골내 골화 또는 미네랄 대사 불량의 메커니즘과 같은 상처 생물학 분야의 주요 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 해부학적 세부 사항에 대한 심층적인 지식을 기반으로 합니다.

일반적으로 생물학적 시스템으로서 마우스에 익숙하지 않은 개인은 인간 중이에 대한 지식이 마우스에 적용되지 않을 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 기술자인 Ayako Sakamoto가 맡을 것입니다. 먼저 수포와 캡슐을 주변 두개골 뼈와 함께 실온에서 pH 7.4의 인산염 완충 식염수가 들어 있는 표본 접시에 넣습니다.

양안 해부 현미경으로 다음과 같이 청각 캡슐을 둘러싼 두개골 뼈를 식별합니다. 한 세트의 집게를 사용하여 주변 두개골을 잡고 두 번째 세트를 사용하여 기저 페노이드와 후두골을 잡아당깁니다. 그런 다음 집게를 사용하여 두정골과 두정골을 캡슐에서 부드럽게 당겨 빼내고 완전히 풀리면 제거합니다.

다음으로, 수포와 캡슐에서 편평 세포를 당겨 뼈와 연조직을 부드럽게 떼어냅니다. 다음으로, 바깥쪽 귀를 잡고 표본을 뒤집어 내측을 드러냅니다. 다음으로, 표본을 180도 돌리고 캡슐을 잡고 남은 연조직을 당겨 빼냅니다.

이제 등쪽 볏이 보입니다. 이 각도에서는 내이도(internal auditory canal), 아치하와(subarcuate fossa) 및 전방 반고리관(anterior semicircular canal)의 안면 및 전정-달팽이관 신경이 명확하게 보입니다. 등쪽 볏이 해부 접시의 아래쪽으로 기울어지면 청각 수포가 명확하게 보입니다.

제제가 약간 기울어져 있으면 수포(bulla) 내에서 추골(malleus)이 보입니다. 집게를 사용하여 추 위의 외이도를 골절하고 고막고막의 측면으로 골절하는 것으로 시작합니다. 첫 번째 팩처보다 앞에 두 번째 팩처를 만듭니다.

그런 다음 고막이 보이도록 외이도 조각을 제거합니다. 다음으로, 복벽과 후벽 모두에서 malleal processus brevis 근처의 고막과 고막의 일부를 제거합니다. 이제 malleus, incus, stapes 및 tensor tympani muscle이 노출되어야 합니다.

추골을 들어 올리고 27 게이지 바늘의 비스듬한 가장자리로 텐서 고막 근육을 자릅니다. malleal manubrium은 다른 포유류에서 볼 수 있는 것처럼 고막에 단단히 부착되어 있습니다. goniale에서 malleus의 전방 돌기를 골절하여 ossicular joint의 incus에서 malleus를 탈구합니다.

겸자를 사용하여 추골(malleus)을 청각수포(audiry bulla)에서 분리합니다. 수포의 주요 부분을 제거하여 incus와 stapes를 노출시킵니다. 그런 다음 27 게이지 바늘의 비스듬한 가장자리를 사용하여 짧은 능선에서 incus의 후방 인대를 자릅니다.

겸자를 사용하여 incus를 분리합니다. 27 게이지 바늘의 비스듬한 가장자리로 등골 근처의 등골 동맥을 잘라냅니다. 둥근 창이 바닥에 위치하도록 샘플을 회전합니다.

그런 다음 등골의 폐쇄기 구멍에 재봉 바늘을 삽입하고 등골을 들어 올립니다. 등골을 제거한 후 타원형 창 개구부가 명확하게 보여야 합니다. 27 게이지 바늘을 사용하여 재봉 바늘에서 등골을 밀어냅니다.

조직 포매를 시작하려면 먼저 가위를 사용하여 수포의 앞쪽 끝에서 스타일리폼 프로세스를 잘라냅니다. malleus와 dorsal crest는 절단 부분을 통해 볼 수 있습니다. bulla와 캡슐을 PBS의 1-2% 파라포름알데히드에 담그십시오.

수포에 공기가 갇힌 경우 바늘과 주사기를 사용하여 제거합니다. 수포와 캡슐을 튜브 회전기에서 밤새 섭씨 4도의 고정제에 그대로 두십시오. 다음날 PBS에서 수포와 캡슐을 빠르게 세척하십시오.

그런 다음 즉시 섭씨 4도의 액체 극저온 임베딩 화합물에 담그십시오. 기포는 중이와 외이 수준에서 cryo-embedding 화합물에 형성되는 것이 일반적입니다. 바늘로 흡인을 통해 중이에서 기포를 제거합니다.

외이의 기포에 대해서도 동일한 기술을 사용하십시오. 모든 기포가 제거되면 얻을 단면 유형에 따라 조직의 방향을 지정합니다. 그런 다음 절편 전에 조직을 동결 블록에 삽입할 수 있습니다.

이 이미지는 문자 M으로 표시된 석회질화된 추골의 세로 파라핀 부분과 P14 마우스의 청각 수포 및 캡슐의 H 및 E 염색을 보여줍니다. 고막은 문자 TM으로 표시됩니다. 이 이미지는 문자 M으로 표시된 동결된 석회질화되지 않은 축골의 세로 부분과 P21 마우스의 청각 수포의 칼슘 뼈 표지를 보여줍니다. 칼슘 녹색 신호는 추골(malleus), 수포(bulla) 및 캡슐(capsule)에 새로운 뼈 형성을 나타냅니다.

이 기법을 숙달하면 절차가 제대로 수행되면 10분 안에 수포와 캡슐을 분리할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 본문에 설명된 마우스의 청각 이소골과 수포의 해부학적 방향을 잘 이해하게 될 것입니다.