Name: 말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 배우세요 말초 혈액에서 세포막 유래 마이크로 소포를 분리하고 유동 세포 분석 및 웨스턴 블롯팅으로 특성을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 종양 바이오마커 발굴과 질병 진단에 활용될 수 있습니다.

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저자는 Meike Schaffrinski의 탁월한 기술 지원을 인정합니다. 말초 혈액 샘플 수집에 도움을 주신 다음 분들께 감사드립니다(모두 괴팅겐 대학 의료 센터에서): Henrietta Vida (수혈 의학과), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (일반, 내장 및 소아 외과), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (신경외과), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (이비인후과, Head and Neck Surgery)뿐만 아니라 학제 간 단기 종양학의 모든 직원. MV의 전자 현미경에 도움을 준 Dirk Wenzel(괴팅겐 Max Planck Institute for Biophysical Chemistry)에게 감사의 뜻을 전합니다. 
이 연구는 독일 교육 연구부(BMBF) 프로젝트 MetastaSys(보조금 번호 0316173)와 독일 암 원조(보조금 번호 109615)의 지원을 받았습니다.

인간의 과목을 포함하여 모든 실험은 지역 윤리위원회 (승인없이. 3/2/14)에 의해 승인되었습니다. 환자의 선택을위한 그러한 성별, 나이, 현재 치료 요법 때문에 혈액 MV 조성물 영향과 수 많은 여러 요인 컬렉션 22,23 샘플링하기 전에 고려되어야한다는 것을 주목해야한다. 플라즈마 샘플 1. 준비 <ol><li> EDTA (1.6 ㎎ / ㎖의 혈액을)를 포함하는 vacutainer 혈액 수집 튜브에 21 게이지 나비 바늘을 통해 기증자 당 혈액이 튜브 - 1을 그립니다. 효율적인 혈액 응고를 보장하기 위해 관 (들)을 여러 번 반전해야합니다. 참고 : - 15 mL의 후속 유동 세포 계측법과 서양 얼룩 분석을위한 혈액의 권장 용량은 5입니다. MV 열화 및 손실을 방지하기 위하여 혈액 샘플을 30 분 혈액 회수 후에 &lt;취급되어야한다. </li><li> 1,200 XG에에서 15 분 동안 샘플을 원심 분리하여 혈장 샘플을 준비실온 (RT). </li><li> 혈액 세포 (= 하층) 잔류 플라즈마 (= 상층)의 분리를 돕기 위해 밸브 필터를 적용한다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 플라즈마를 전송합니다. </li><li> 1,500 XG에 15 분 동안 원심 분리, RT는 큰 세포 파편 펠렛 및 남은 혈소판을 제거합니다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 뜨는을 전송하고 직접 -20 ° C에서 최대 6 개월 MV 격리 또는 저장 샘플을 진행합니다. 주 : 제시된 프로토콜은 세포 배양 상청액에서 MV를 (그리고 EXOS)을 분리하는데 사용될 수있다. (24) 80 % 컨 플루 - -이를 위해, 60 ℃에서 세포를 배양 소포 고갈 FCS로 보충 된 배지에서 48 시간 후 상층 액을 수집한다. 750 XG에 5 분, 4 ° C를위한 원심 분리기, 잔류 떠있는 세포를 고갈 큰 세포 파편을 펠렛 1,500 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 다시 새로운 15 mL의 튜브와 원심 분리기에 뜨는을 채우기 위해. 이 상등액을 다음 조작량의 분리를 위해 사용될 수있다2.16 - 2.1 단계에 설명 된대로. </li></ol> MV를 2. 분리 <ol><li> 적절한 원심 관에 혈장 샘플을 옮긴다. 필요한 경우, 원심 분리 과정에서 박벽 관 붕괴 샘플을 희석 방지하기 위해 PBS로 관을 채운다. </li><li> 14,000 XG, 4 ° C에서 35 분 동안 원심 분리기. </li><li> 가만히 따르다 뜨는, 튜브가 거꾸로 서서 종이 타월에 넣어 보관하십시오. 나머지 상층 액은 수건에 적셔하여 샘플에서 제거 될 때까지 5 분 - 3를 기다립니다. </li><li> 1000 μL PBS의 MV 펠렛을 재현 탁, 탁상 원심 분리기에서 14,000 XG, 4 ° C에서 35 분 동안 1.5 mL의 튜브와 원심 분리기에 전송합니다. </li><li> 기음 뜨는. </li><li> 펠렛의 크기에 따라, 500 μL PBS - 50에서 MV 펠렛을 재현 탁. 대안 적으로, RIPA 완충액 예를 Lyse 직접 MV를, (150 mM의 염화나트륨 / 0.1 % SDS / 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 - / 1 % 트리톤 X-100 / 50mM 트리스, pH를 7.2)이후 웨스턴 블롯 분석. -20 ° C에서 보관 MV를. 그들은 몇 달 동안 안정적으로 유지하지만, 반복 동결 - 해동 사이클을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 선택적 : MV 수율을 평가 또는 후속 실험 MVS를 투약하기 위해 단백질 분석과 MV 단백질 농도 (예를 들어, 브래드 포드 또는 로우리 법) 결정한다. </li><li> 추가 EXOS 플라즈마 샘플에서 분리 될 경우, 110,000 XG, 4 ° C에서 2 시간에 대한 초 원심 분리 튜브와 원심 분리기로 단계 2.3에서 뜨는을 가만히 따르다. 단계 2.3에 설명 된대로 뜨는을 가만히 따르다, 1,000 μL PBS에 출 펠렛을 재현 탁하고 작은 (1.5 mL)을 초 원심 튜브에 전송합니다. <ol><li> 75 μL PBS 또는 RIPA 버퍼 - 50 110,000 XG, 4 ° C, 기음 뜨는 및 재현 탁 출 펠릿에서 2 시간 동안 초 원심 분리기. </li></ol></li></ol> 유동 세포 계측법에 의해 MV를 3. 특성 <ol><li> 이전 15 μL PBS + 1 % 소포 고갈 소 태아 혈청 (F유동 세포 계측법 튜브 CS). 주 : 소포 고갈 된 FCS (24)는 이전에 설명 된 바와 같이 0.2 ㎛의 필터로 상청액을 110,000 XG에서 18 시간 동안 FCS (56 ° C에서 30 분) 열 - 불 활성화를 원심 분리 및 여과에 의해 제조된다. </li><li> PBS에서 MV를 (3 μg의도 적용 할 수있는 낮은 수율의 경우) 5 μg의 추가. </li><li> 조작량 표면에서 비특이적 결합 부위를 차단함으로써, 배경 얼룩을 감소시키기 위해 실온에서 30 분 동안 샘플을 인큐베이션. </li><li> 단백질의 관심에 대해 형광 표지 된 항체를 추가합니다. 낮은 신호 - 대 - 잡음비를 최적 농도를 결정하고 보장하기 위하여 사용하기 전에 염색에 사용 된 항체의 양을 적정한다. 또한 음성 대조군으로 염색 MV를 하나의 튜브 (항체의 1 μg의 사용하는 경우 예를 들어, 또한 이소 제어 1 μg의를 사용하는 것과 동일한 농도로 일치하는 이소 타입 대조군 항체로 염색 MV를 하나 튜브를 포함해야합니다tibody) 배경 염색을 정량화한다. 주 : 다른 형광 색소에 결합 된 다수의 항체를 첨가하여 세포 계측법 다색 플로우를 실행하는 것도 가능하다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 250 μL PBS를 추가하고 사이토 흐름을 사용하여 샘플의 측정을 진행합니다. <ol><li> 경우에 시료를 즉시 측정 할 수없는, 4 ° C에서 샘플 및 저장소를 해결하기 위해 150 μL PBS 50 μL 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가합니다. 주의 : PFA는 독성이다. 장갑과 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다. </li></ol></li><li> 가능한 최저 값으로 흐름 cytometer의 임계 값을 줄이고 로그 스케일의 측면 산란 (SSC) 플롯 대 앞으로 분산 형 (FSC)를 사용하여 MV 인구를 검색합니다. 뮤직 비디오 인구에 게이트 및 해당 히스토그램에서 형광 신호를 평가합니다. </li></ol> 웨스턴 블로 팅에 의해 MV를 4. 특성 <ol><li> 에서 직접 MV 펠렛을 재현 탁적합한 용해 완충액 (예, RIPA 완충액). <ol><li> 적합한 용해 완충액 (예, RIPA 완충액)에서 1 : MV 펠릿 이미 PBS에 재현 탁 된 경우에, 그것을 적어도 1 희석. </li></ol></li><li> 로우리 분석법에 의해 MV 샘플의 단백질 농도는, 예를 결정. </li><li> 22.5 μL RIPA 버퍼에 MV를 20 μg의 - (10)를 준비합니다. 그런 다음 95 ℃에서 5 분 동안 7.5 μL 배 램 믈리 로딩 버퍼와 열을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 폴리 아크릴 아미드 겔에로드 샘플 및 표준 프로토콜에 따라 전기 영동 및 면역를 수행합니다. </li><li> 막에 단백질을 전송 한 후, 표준 프로토콜에 따라 부하 제어 등의 개양귀비 빛 염색을 수행합니다. </li><li> 실온에서 5 분간 TBST에 Destain 막. </li><li> TBST에서 5 % BSA에서 실온에서 최대 1 시간 30 분 동안 차단 막. </li><li> 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 39 ° C에서 차 항체와 함께 막을 인큐베이션. </li><li> TBST 3 × 5 분으로 막을 씻으십시오.</li><li> 1의 희석에 HRP 결합 된 이차 항체와 멤브레인을 품어 : 10,000 5 %의 BSA를. 주 : 높은 배경 신호의 경우, 대신 BSA의 분유를 사용한다. </li><li> TBST 3 배 5 분에 막 씻으십시오. </li><li> ECL 검출 시약 막을 개발하고 화학 발광 필름 또는 화학 발광 이미징 시스템에서 신호를 검출한다. 참고 EXOS에서 MVS를 구별하기 위해, 튜 불린 등의 단백질이 사용될 수있다 4 티닌 또는 mitofilin 주로 16,25 조작량에 존재해야한다. EXOS 마커로서 사용되는 대부분의 tetraspanin 항체 (예, CD9, CD81)은, 환원 조건에서 작동하지 않으며, 따라서, 70 ° C에서 10 분 동안 가열 하였다 비 환원성 로딩 완충액을 제조한다주의. </li></ol>

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<html> 혈액에서 전기 자동차에 대한 최근의 연구는 EV 조성 및 계산은 여러 질병의 원인 중에 변경할 것을 증명하고있다. 따라서 이러한 전기 자동차의 분석 및 추가 특성 추가 진단 및 예후에 대한 질병 바이오 마커로서의 사용 가능성을 평가하거나 치료 반응을 평가하기 위해 높은 관심입니다. 우리가 여기에 제시 프로토콜은 모든 세포 소기관을 포함하지 않는 최대 600 nm의 직경 소포의 분리를 할 수 있습니다. 이러한 관측 된 MV의 현재의 정의에 부합하며, 세포 자멸 소체 (2)의 존재를 배제. 종종 엑소 마커로서 사용되는 tetraspanins CD9 및 CD81 발현 약간만 동안 웨스턴 블로 팅을 사용하여, 우리는 상기 격리 된 MV는 튜 불린의 높은 발현을 표시 함을 입증 할 수 있었다. 이 MVS가 EXOS 차이가 있음을 확인하고 프로테오믹스 (25)에 의해 최근 심도있는 특성 모두 EV 인구의 비교에 적합합니다. 혈액 샘플을 수집하는 동안 콘텐츠 &quot;&gt;는 MV 저하를 방지하기 위해 짧은 가능한 정맥 천자 혈장 제제 사이의 시간을 유지하기 위해 중요하다. 또한, 혈액 샘플의 장기간 보관이 향상 MV를 일으키는 혈액 세포의 활성화를 초래할 수도 궁극적으로 세포 사멸 기관의 발표 결과 세포 사멸을 발산합니다. MV 격리를위한 또 다른 중요한 고려 사항은 따라서, 아래로 회전 후 가능한 한 상층 액만큼을 제거하는 것이 중요하다. 혈장 단백질 이하 EXOS와 MV 준비의 오염을 방지하는 것입니다 펠렛 정상적으로 볼 단단히 튜브의 벽에 부착되어 있기 때문에 14,000 × g에서 조작량이. 상등액 용이 피펫 팁으로 제거 될 수있다. EXOS 달리 고속 초 원심 분리에 의해 제조시 응집체를 형성하는 경향이있는 자주 재현 탁하기 어려운이 문제가 MV를 발생하지 않습니다. 본 연구는 possi 것을 보여준다유동 세포 계측법에 의해 혈액에 존재하는 MV의 소집단의 특성에 상상력. 대부분의 유동 세포 계측기의 검출 한계는 200이지만 - 300 nm의 조작량이 재현 명확 배경 신호로부터 자신의 구별을 허용 동일한 분석 파라미터들 및 게이트들과 도너뿐만 아니라 세포 배양 샘플에서 측정 하였다. 이는 PBS가 유동 세포 계측법 (도 3) 중 높은 배경을 일으킬 수있는 오염 입자를 포함하지 않는 분석에 사용한 측정에 앞서 확인하는 것이 중요하다. 일부 작은 MV를가 유세포 방식에서 캡처되지 않을 수 있지만, 우리는 모든 주요 혈액 세포 집단 (예, 혈소판, 적혈구, 백혈구, 내피 세포)에서 MVS를 발견했습니다. 29 - 우리의 분석에서 우리는 이전에 MV를 26 일에 발견 된 다른 혈액 세포에 대한 표준 마커를 사용했다. 또한 주목해야한다, t 유동 세포 계측법에 의해 최적의 결과를 얻기 위해서는그 금액과 모든 항체의 농도는 관심의 항원을 발현하는 MV 샘플에 적정해야한다. 혈액에서 특정 MV의 소집단이 높은 특이성으로 식별되어야한다 경우, 각각의 MV를에 두 개의 서로 다른 항원 존재에 대해 이중 염색을 수행하고 이후 23 분석에만 모든 더블 긍정적 인 MVS를 고려하는 것이 가능하다. 현재 건강한 사람 23,30의 혈액에 MV의 개체군의 표준 범위를 정의하기위한 노력이있다. 이 연구는 이미 혈소판 유래 MVS가 우리의 관찰과 대응에 혈액의 MV를 가장 큰 인구를 구성하는 것으로 나타났습니다. MV 샘플의 특성을 유동 세포 계측법의 하나의 장점은이 방법은 이미 잘 일상적인 임상 진단에서 바이오 마커 등의 MV를의 가능한 사용을 허용하는 대부분의 임상 센터에서 진단 목적으로 설립된다는 점이다. 주로 초점을 혈액에서 전기 자동차에 대한 이전의 연구작은 EXOS에 에드 선택적 원하는 엑소 목표 인구 (31, 32)를 분석하는 특정 분류 절차 중 하나에 의존하거나 분석 18 일 전에 비드 라텍스 EXOS의 커플 링 시간 소모적 (2 일) 분리 공정을 필요로한다. 우리의 관찰되지 않은 전혈 제제의 조작량의 유세포 분석은 심지어 그러한 선택 과정없이 종양 유래의 MV와 같은 조작량의 검출을 허용하는 것이 제안한다. 여기에 제시된 프로토콜은 표준 실험실 장비와 말초 혈액 샘플에서 MV를의 빠른 분리를 허용하고 그 이후의 특성은 유동 세포 계측법과 서양 블로 팅하여, 함께. 전체 프로세스는 질병 표지자로서 조작량의 전위를 평가하는 데 필요한 환자의 혈액 MV 프로파일에 미래 연구를 용이하게 약 2 시간 동안 수행 될 수있다.

지난 몇 년 동안 시험 관내 연구에 많은 세포 소낭은 EVS (는) 간 통신에있어서 중요한 역할을한다는 것을 보여 주었다. 살아있는 세포는 지속적으로 크기, 콘텐츠 및 생합성에 차이가 소포를 흘렸다. 가장 좋은 공부 전기 자동차는이 multivesicular 몸에서 관내 소포로 저장되는 위치 엔도 좀의 시스템에서 발생하는 엑소 좀 있습니다. 세포막과 후자 퓨즈되면 함유 소포는 엑소 좀으로 방출된다 (EXOS 직경이 30-100 nm 인 1). 세포막이 직접 오프 꽃 봉오리 - 지난 몇 년 동안 증가 관심을 얻고있다 EV의 두 번째 인구는 큰 마이크로 소포 (1,000 nm의 MV를, 직경 100)이다. 5, 이들이 인접하는 C로 전송할 수있는 단백질의 과다 - 소포 두 유형, 예를 들어, DNA, mRNA의 또는 miRNA의 3 지질 이중층에 의해 둘러싸인 핵산이 포함되어있다ELL 학생. 일반적으로 소포의 단백질 조성물은 원래 셀의 상태를 반영하면서, 일부 단백질은 선택적 타겟팅 및 전기 자동차 (1)에 농축 된 것으로 보인다. 주요 연구 관심은 신규 한 바이오 마커로서 전기차의 사용을 허용 할 수 특정 EV 서명을 정의하기 위해 이상 및 질병 세포로부터 전기차의 특성이다. 특히 종종 종양 자체가 쉽게 액세스하지 않는 암에서 혈액 종양 특이 전기차 타겟팅 액체 생검 치료 반응의 모니터링을 허용하거나 침습적 6 없이도 일차 종양 특성화 도울 것이다. 실제로, 전기 자동차는 이미 성공적으로 소변 7, CSF 8, 모유 (9) 또는 혈액 (10) 등 다양한 체액에서 분리되었다. 몇몇 연구는 다른 인간의 질병에 EV 계수의 변화와 구성을 확인했다. 예를 들어, 패혈증 환자 프로 응집제 조작량의 수이다상당히 건강한 사람 (11)에 비해 증가했다. 또한 심각한 뇌 말라리아 환자에서 혈중 총 조작량의 증가가 관찰 될 수 있고, 혈소판 유래 된 MV의 수는 코마 깊이 감소증 (12)과 상관 관계. 다른 연구는이 심혈 13,14 높은 확률과 상관, 전신성 홍 반성 루푸스 또는 심부전 환자에서, 후자의 경우는 내피 - 유래 소체의 상승 된 수치를보고한다. 특히 암, 혈액의 전기 자동차는 현재 진단 및 예후 가치와 새로운 바이오 마커로 설명합니다. 이러한 MUC1, EGFR 또는 FAK 같은 종양 관련 단백질을 발현하는 MV를의 수준은 유방암 환자 (15, 16)의 혈액에서 증가 할 것으로 보인다. 또한 EXOS를 들어, 최근의 연구는 Glypican-1 초기 질병 드를 허용 유방암 췌장암 또는 델-1과 같은 종양 특이 항원을 운반하는 혈액 유래 EXOS을 보여 주었다높은 특이성과 감도 (17, 18)와 tection. 게다가, 혈청 - 유래 종양 EXOS는 KRAS 및 치료 예측 19의 사용을 제안 p53과 같은 돌연변이의 검출에 사용할 수있는 DNA를 포함 할 수있다. 최근 진보는 특정 마이크로 유체 칩을 사용하여 아교 모세포종 환자의 혈액에서 EXOS의 분석 요법 (20)의 감시를 허용 보여 주었다. 함께 찍은, 이러한 결과는 소포의 질병 별 소집단의 분석은 진단, 예후뿐만 아니라 치료 옵션과 성공에 대한 유용한 정보를 제공하는 것을 의미한다. 그러나, 혈액 EXOS의 분리 및 분석은 시간 소모적이다 특별한 실험 장비를 필요로하기 때문에 아직 일상적인 임상 진단에 적합하지 않다. 대조적으로, 조작량은 EXOS (18)에 필요로 계측법 라텍스 비드에 결합을 할 필요없이 쉽게 흐르지 의해 분석 될 수 있고, 그들의 큰 크기에 훨씬 빨리 격리 될 수21. 따라서, 우리가 혈액 샘플의 조작량의 표준 단리 및 유동 세포 계측법에 의해 MV의 개체군의 후속 특성화에 사용될 수있는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 추가 연구와 일상적인 임상 진단을위한 MVS를 사용하기 위해 필요합니다 큰 환자 그룹의 MV 프로파일의 깊이 특성에 허용됩니다.

<table><tbody><tr><td>나비 바늘 (21 게이지)</td> <td>Hospira Deutschland GmbH</td><td>490P29201</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 분획 V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td>10x TBS의 경우 24.2g Tris base 및 80g NaCl의 무게, ad 1 L H2O로 조정하고 pH를 7.6</td></tr><tr><td colspan="4"로 조정합니다>1x TBS-T의 경우 100mL 10x TBS와 900mL H2O를 혼합하고 1mL Tween-20</td></tr><tr><td>CD235a-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07792</td><td>를 추가합니다.5 &micro를 사용하십시오. l</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>7782</td><td>염색용 5 &micro 사용; l</td></tr><tr><td>CD62E-PE</td><td>Biolegend</td> 염색 <td>336008</td><td>0.8 &micro를 사용합니다. g 염색</td></tr><tr><td>CD62P-PE</td><td>Biolegend</td><td>304905</td><td>0.1 &micro 사용; </td></tr><tr><td>g: TBS-T의 5% BSA에서 CD81 항체 Biolegend 349501 1:2,000 염색</td><td></td><td></td><td></td>;</tr><tr><td>TBS-T의 5% BSA에서 1:1,000 in</td>Western Blotting<td>CD9 항체</td><td>Immunotools</td><td>21270091</td> 위한 비환원 조건 사용; Western Blotting</tr><tr><td>Chemiluminescence Imager ImageQuant LAS-4000</td><td>Fujitsu Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC 단백질 분석 키트 II</td><td>Bio-Rad에 비환원 조건 사용</td><td></td><td></td>5000112</tr><tr><td>ECL 검출 시약</td><td>GE 헬스케어</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>혈액 수집을 위한 EDTA 진공 청소기</td><td>Sarstedt</td><td>01.1605.001</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청 (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>열 비활성화 (30 분, 56 &deg; C)</td></tr> <tr><td>필터 0.22 & 마이크로; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>HRP 결합 안티 마우스 2 차 항체</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-2005</td><td>1 : 10,000 5 % 분유에 TBS-T</td></tr><tr><td>HRP 결합 안티 토끼 2 차 항체</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-2004</td><td>사용 1 : 10,000 TBS-T의 5 % 분유</td></tr><tr><td>4x Laemmli 로딩 버퍼, Roti-Load 1</td><td>Roth</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 fuge SIGMA 1-15K</td><td>시그마 Laborzentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분유(블로팅 등급 차단기, 탈지분유)</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>멀티퓨지 3 LR</td><td>헤레우스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, w/o Ca and Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>퍼퓨저 주사기 50 mL</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau-S 염색 용액</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2935,0500</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리용 로터 Sw32.1 Ti (6 x 17 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초원심분리용 로터 TLA-120.2 (10 x 1.5 mL)</td><td>Beckman </td> 유세포 분석용 쿨터 <td></td><td></td></tr><tr><td>튜브(5mL, 둥근 바닥)</td><td>BD Biosciences</td><td></td> 초원심분리용 352054<td></td></tr><tr><td>관(15mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td>초</td>원심분리용 344061<td></td></tr><tr><td>관(11* 34mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin 항체</td><td>Millipore</td><td>05-829</td><td>1:5,000 in 5%BSA in TBST</td></tr><tr><td>초원심분리기 Optima L-80 XP</td><td>벡크만쿨터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 TL-100</td><td>벡크만쿨터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>밸브 필터 Seraplas V15</td><td>Sarstedt</td><td>53,428</td><td></td></tr></tbody></table>

말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

작은 엔도 좀 유래 엑소 좀 (EXOS, 직경 &lt;100 ㎚) 및 대형 플라즈마 막 유래 마이크로 소포 (MV를, 직경&gt; 100 ㎚)를 포함하는 세포 외 소포 (전기 자동차)의 방출은 모든 살아있는 세포에서 발생하는 근본적인 세포 과정이다. 원산지 자신의 휴대 및 시험 관내 연구에서 특정이 소포 수송 단백질, 지질 및 핵산은 세포 간 의사 소통의 매개체로 자신의 중요성을 강조했다. 전기차 성공적 다양한 체액으로부터 분리 된 혈액에서 특히 전기차 암 또는 감염성 질병에 대한 생체 유망한 것으로 확인되었다. 혈액 MV의 개체군 연구를 허용하기 위해, 우리는 말초 혈액에서 조작량의 표준 단리 및 특성화를위한 프로토콜을 제시한다. MV를 차동 원심 분리하여 EDTA-항 응고 혈장 샘플에서 펠렛 일반적으로 (100)의 직경을 가지고있다 - 600 nm의. 그들의 더 큰 크기로, 그들은 수쉽게 유동 세포 계측법, 정기적으로 임상 진단에 사용되는 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 기술에 의해 연구 될 수있다. 격리 된 MV의 품질 관리 분석을위한 여러 실시 예를 설명한다 혈액 다른 MV 개체군의 판정에 사용할 수있는 마커를 제공한다.

전술 한 프로토콜에 따라 단리 될 수 조작량의 수율을 정량화하기 위해, 우리는 열 도너의 혈액으로부터 분리 된 MV의 양을 계산 하였다. 라 단백질 분석에서 평가 된 MV 수율은 mL의 혈액 당 19.2 μg의 MV를 (표 1)의 평균과 μg의 30까지 10에서였다. 나노 추적 분석 (NTA)에 의해 결정되는 입자의 농도가 1.66 × 109 mL의 플라즈마에서 샘플 당 5.9 × 109 입자 (표 2)의 평균이 2.36 × 106 (10)이었다. 투과 전자 현미경에 의한 MV를의 추가 특성은 지질 이중층에 의해 포위하고있는 세포 소기관 (그림 1A)를 포함하지 않은 직경&gt; 100 nm의와 소포의 인구를 한 것으로 밝혀졌습니다. NTA는 절연 조작량의 크기가 600 나노 미터 (도 1b) 및 MV 평균 크기 100 원거리에서 확인되었다 201나노 미터 (도 1C). 웨스턴 블로 팅에 의한 전형적인 MV 및 출 마커 염색하면 격리 MVS가 tubulin에 양성이었고, EXOS는 튜 불린에 대한 부정적이었고, CD9 및 CD81 (그림 2) 풍부한 동안 만, CD9 및 CD81의 약간의 표현을 보여 주었다 보여 주었다. 유동 세포 계측법 (도 3a)에 의해 격리 된 MV의 분석은 일반적으로 세포 배양 상청액에서 분리 된 MV들에 사용 된 것과 동일한 파라미터를 이용하여 게이팅 될 수있는 정의 소낭 집단을 계시하고는 PBS의 측정에 의해 얻어진 배경 신호로부터 명확히 달랐다 + 1 %의 조작량 (도 3b)을 첨가하지 않은 FCS를 소포 고갈. 혈액 중에 존재하는 다른 MV 개체군을 분석하기 위해, MV들은 예 CD62P 혈소판 유래 MV를 들어, CD45, 백혈구 유래 MV를 들면, CD235a 들어, 다른 혈액 세포 집단 확립 마커 염색적혈구 내피 세포 유래 MV를 (그림 4)에 대한 MV를하고 CD62E을 세포 유래. 이 특성은 MV를 대부분의 모든 샘플에서 혈소판에 의해 흘릴 듯하면서 MV의 개체군의 비율은 조사 기증자의 혈액 샘플 사이에 차이가 있음을 보여 주었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> 그림 1 : 말초 혈액에서 분리 된 MV의 크기 분포. A, 격리 된 MV는 투과 전자 현미경에 의해 가시화 하였다. B, 소포의 크기 분포를 나타낸 조작량의 대표적인 나노 추적 분석 (NTA). C (10)로부터 독립적으로 제제의 평균 MV 크기 NTA (평균)을 측정 하였다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">알을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 arger 버전입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> 그림 2 : 웨스턴 블로 팅에 의해 고립 된 MV의 특성. 두 기증자로부터 격리 된 MV들과 EXOS에 차등 단백질 발현은 웨스턴 블로 팅에 의해 가시화되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> 그림 3 : 유동 세포 계측법에 의해 MV를 분석. A, MV를 먼저 각각의 MV 인구에 게이트에 sidescatter (SSC) 플롯 대 앞으로 (FSC)에 시각화된다. 그 후,이 MV를가 관심의 항원에 의한에 대한 특징<html> 항원에 대해 지시 형광 표지 된 항체를 사용. B, 두 기증자의 혈장에서 분리 MV를위한 SSC 플롯 대 일반적인 FSC. 비교 만 PBS + 1 % 소포 고갈 조작량없이 FCS를 사용하여 세포 배양액뿐 아니라 음성 대조군으로부터 격리 A549 폐암 세포의 종양 세포 유래 MV를위한 전형적인 플롯은 오른쪽에 표시된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> 그림 4 : 유동 세포 계측법에 의해 고립 된 MV의 특성. 세 기증자 MV를 유동 세포 계측법에 의해 설립 된 혈액 세포 마커 (적색)의 발현을 특징으로 하였다. 각각의 아이소 타입 컨트롤은 회색으로 표시됩니다.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> MVS / mL의 혈액 [μg의] </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> #삼 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 18.7 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 말초 혈액 샘플에서 MV 단백질 수율. </str옹&gt; 표시됨 10 기증자에서 도출 된 mL의 말초 혈액 당 MV를의 양입니다. MV 수익률은 로리의 분석에 의해 정량화 하였다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> MVS / ㎖의 혈장 [입자 수] </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> #삼 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 말초 혈액 샘플에서 MV 입자 항복. </st룽&gt; MV 10 공여자 입자 계수는 나노 추적 분석에 의해 측정 하였다 혈장 샘플로부터 분리 하였다. 세 독립적 인 측정의 평균치가 도시.

혈액에 존재하는 세포외 소포체는 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커로 제안되었습니다. 여기에서는 말초 혈액 샘플에서 대형 원형질막 유래 미세소포를 분리하고 기존 유세포 분석 및 웨스턴 블로팅(Western Blotting)을 통한 후속 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다.

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

이 방법의 전반적인 목표는 말초 혈액에서 원형질막 유래 미세소포의 집단을 특성화하고 연구하는 것입니다. 종양 환자의 미세소포는 전향적 및 기능적 분석법입니다. 따라서 추가 특성 분석은 이러한 소포가 실제로 침입 및 전이에 어떻게 기여하는지에 대한 정보를 제공할 것입니다.이 기술의 주요 장점은 정교하거나 값비싼 재료와 장비 없이도 혈액 내 미세소포를 비교적 빠르게 분석할 수 있다는 것입니다. 지원자로부터 EDTA가 포함된 채취 튜브에 하나 또는 두 개의 혈액 튜브를 채취한 후 효율적인 혈액 항응고를 보장하기 위해 튜브를 여러 번 뒤집습니다. 채혈 후 30분 이내에 샘플을 원심분리하고 튜브에 밸브 필터를 추가하여 남아 있는 혈액에서 혈장을 분리하는 데 도움이 됩니다.두 번째 원심분리를 위해 플라즈마를 15ml 튜브로 옮깁니다. 상층액을 수확하여 새 튜브로 옮깁니다. 필요한 경우 PBS를 추가합니다.미세소포를 수집하기 위해 필요에 따라 PBS에 희석된 상등액이 포함된 혈장을 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 디캔팅하고 튜브를 종이 타월 위에 거꾸로 놓고 3-5분 동안 놓습니다. 남아 있는 모든 상층액이 수건에 스며들면 튜브 가장자리에 남아 있는 혈장을 제거하고 PBS 1ml에 미세소포 펠릿을 재현탁합니다.용액을 1.5 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 원심 분리 후 상등액을 흡입하고 펠릿의 크기에 따라 50-500 마이크로 리터의 PBS에 펠릿을 재현탁시킵니다. 그런 다음 단백질 분석으로 미세소포 단백질 농도를 측정합니다.유세포 분석으로 미세소포를 특성화하려면 1% 소포가 고갈된 FCS가 보충된 15마이크로리터의 PBS를 유세포 분석 튜브에 옮긴 다음 PBS에 부유하는 3-5마이크로그램의 미세소포를 옮깁니다. 시료를 실온에서 30분 동안 배양하여 미세소포 표면의 비특이적 결합을 차단합니다. 그런 다음 형광 표지된 관심 항체를 추가하여 어둠 속에서 20분 동안 실온 배양을 합니다.다음으로, 샘플을 250마이크로리터의 새 PBS로 희석하고 미세소포를 유세포분석기에 로드합니다. 유세포 분석기의 임계값을 가능한 가장 낮은 값으로 낮추고, 로고 스케일에서 forward versus side scatter plot을 사용하여 미세소포 집단을 검색합니다. 그런 다음 미세소포 집단 주위에 게이트를 만들고 해당 히스토그램에서 형광 신호를 평가합니다.기증자 혈액 샘플의 미세소포 수율은 Lowry 단백질 분석에서 혈액 1밀리리터당 10-30마이크로그램의 소포 수율과 입자 간 추적 분석에 의해 결정된 바와 같이 1.66 곱하기 10에서 9번째, 2.36 곱하기 10에서 10번째 범위의 입자 농도로 평가할 수 있습니다. 투과 전자 현미경에 의한 미세소포의 추가 특성화는 세포 소기관을 포함하지 않는 지질 이중층으로 둘러싸인 직경이 100나노미터 이상인 소포 집단을 보여줍니다. 나노 입자 추적 분석은 또한 분리된 미세소포의 평균 크기가 100에서 600나노미터 범위이며 평균 201나노미터임을 확인합니다.웨스턴 블로팅(western blotting)에 의한 일반적인 미세소포 및 엑소좀 마커에 대한 염색은 혈액 분리 미세소포는 일반적으로 세뇨관에 대해 양성이며 CD9 및 CD81의 약한 발현을 보이는 반면, 엑소좀은 일반적으로 세뇨관에 대해 음성이며 다른 두 마커로 풍부함을 보여줍니다. 유세포 분석은 세포 배양 상등액 분리 미세소포에 사용되는 것과 동일한 매개변수를 사용하여 게이트할 수 있는 정의된 donor 유래 소포 집단을 나타냅니다. 이는 또한 1%소포가 고갈된 FCS 전용 샘플로 보충된 제어된 PBS에서 관찰된 배경 신호와도 분명히 다릅니다.서로 다른 혈액 세포 집단에 대해 확립된 마커를 사용한 미세소포 염색은 미세소포 하위 모집단의 비율이 헌혈자 샘플마다 다르며, 대부분의 미세소포는 모든 샘플에서 혈소판에 의해 배출되는 것으로 보입니다. 일단 마스터되면 미세소포의 분리 및 유세포 분석에 의한 후속 특성 분석은 약 2-1/2시간 내에 수행할 수 있습니다. 미세소포 하위 집단의 특성화는 대조군과 비교하여 환자의 종양 시그니처를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.이것은 카운터 진단 및 치료를 위한 바이오마커로 유용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 적게 10 μL의 혈청 샘플에서 세포 외 소체 (전기 자동차), 셀로부터 방출 멤브레인 작은 입자를 분리하는 방법을 자세히 설명. 이 접근법은, 초 원심 분리의 필요성을 회피 분석 시간의 몇 분을 필요로하고, 제한된 양의 시료로부터 전기차의 분리를 가능하게한다.

세포 외 소포의 분리 및 특성에 대한 종이 기반의 장치

담즙액은 잠재적으로 중요한 바이오마커를 포함하는 세포 외 소포체/엑소좀의 귀중한 공급원입니다. 이 프로토콜은 miRNA 프로파일링을 포함한 추가 분석을 위해 인간 담즙에서 엑소좀을 분리하는 강력한 방법을 나타냅니다.

격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

결핵 균은 낮은 철 조건에 응하여 세포외 소포의 증가된 생산 그리고 방출을 보여줍니다. 이 작품은 철 결핍에 응하여 풀어 놓인 진균 세포외 소포의 정제 그리고 특성화를 위한 낮은 철 조건 및 방법을 생성하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다.

철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화

우리는 세자리 증후군으로 진단 된 환자로부터 얻은 전혈에서 말초 혈액 단핵 세포를 분리하기위한 간단한 프로토콜을 제시하고, CD4 + T 세포의 선택, phorbol12-myristate13-acetate 및 A23187 ionophore로 자극, 전사 프로파일 링을위한 RNA 준비.

전사 프로파일링을 위해 세자리 증후군 환자로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 CD4+ T 세포 분리

본 프로토콜은 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링과 함께 말초 혈액 및 고형 조직으로부터 세포외 소포를 추출하는 방법을 설명한다.

혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석

본 프로토콜은 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 대표적인 EV(엑소좀 및 마이크로베시클)를 분리하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 설명합니다. 이러한 EV의 추가 응용 프로그램도 이 기사에서 설명합니다.

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

이 기사에서는 인간 플라즈마 유래 세포외 소포체(EV)의 분리, 특성화 및 정량화를 위한 방법론을 설명하고 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 EV 단백질체의 무표지 분석을 위한 워크플로우를 제시합니다.

심혈관 바이오마커 발견을 위한 혈장 유래 세포외 소포체의 분리, 특성화 및 단백질체 분석

여기에서는 인간 피험자의 눈물 및 타액과 같은 생물학적 액체에서 수집된 세포외 소포체(EV)의 특성화 방법을 보여줍니다. 이 방법에 사용된 스캐너는 샘플의 1μL에서 EV의 표현형, 크기 및 총 입자 수를 감지할 수 있습니다.

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids(생물학적 유체로부터 세포외 소포체 특성화)

이 프로토콜은 효소 소화 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 소변 골격근과 골수에서 작은 세포외 소포를 분리하여 구조적으로 복잡하고 저수율 조직에서 소포 농축 분획을 재현 가능하게 회수하여 하위 분자 분석에 활용할 수 있도록 합니다.

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 쥐 골격근 및 골수에서 작은 세포외 소포 분리

여기, 우리는 murine 폐동맥 내피 세포의 격리와 문화 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 정비사 및 효소 폐 조직 분리뿐만 아니라 안티 - PECAM - 1과 대부분 microvascular 원산지 순수한 내피 세포 인구를 생산 자성 비즈에 복합 백신 ICAM - 2 항체를 사용하여 2 단계 정화 과정으로 구성됩니다.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

배우세요 말초 혈액에서 세포막 유래 마이크로 소포를 분리하고 유동 세포 분석 및 웨스턴 블롯팅으로 특성을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 종양 바이오마커 발굴과 질병 진단에 활용될 수 있습니다.

말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

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