Name: 유전자 발현 및 조직 학적 분석을위한 단일 마우스 골격근의 연속 지역의 냉동 절편 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 배우세요 단일 마우스 골격근의 연속 냉동 절편을 이용하여 조직학적 및 분자적 매개변수를 분석하는 방법을. 이 기법은 근육 재생 및 유전자 전달 연구에서 조직학 데이터와 유전자 발현 데이터를 직접적으로 상관관계시켜 실험 조직의 효율적인 활용을 가능하게 합니다.

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Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre, Junna Luan이 기술 지원을 제공했습니다. 이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 관절염 및 근골격 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 지원을 받았습니다(수상 번호 AR065077). 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

<ol><li>Foltz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+skeletal+muscle+regeneration+plus+mild+alterations+in+mature+fiber+type+specification+in+Fktn-Deficient+Dystroglycanopathy+Muscular+Dystrophy+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice.</a> PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).</li>
<li>Bartoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+monitoring+of+therapeutic+gene+transfer+in+animal+models+of+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies.</a> Gene Ther. 13, 20-28 (2006).</li>
<li>Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+RNA+preparation+options+for+archived+myocardial+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung+Circ%22%5BJournal%5D)">Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies.</a> Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).</li>
<li>Beedle, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fukutin+deletion+impairs+dystroglycan+processing+and+recapitulates+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy.</a> J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).</li>
<li>Foltz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-week+rapamycin+treatment+improves+muscular+dystrophy+in+a+fukutin-deficient+mouse+model+of+dystroglycanopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy.</a> Skeletal Muscle. 6, 20(2016).</li>
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<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).</li>
<li>Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+commercial+RNA+extraction+kits+for+preparation+of+DNA-free+total+RNA+from+Salmonella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells.</a> BMC Res. Notes. 3, 211(2010).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+Myf5+to+support+myogenic+differentiation+without+myogenin%2C+MyoD%2C+and+MRF4%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4.</a> Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).</li>
<li>Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+transgenic+skeletal+muscles+with+altered+timing+of+expression+of+the+basic+helix-loop-helix+muscle+regulatory+factor+MRF4%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4.</a> Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).</li>
<li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+chloroform+by+bromo-chloropropane+in+the+single-step+method+of+RNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation.</a> Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).</li>
<li>Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+RNA+from+tough+tissues+with+high+proteoglycan+content+by+cryosection%2C+second+phase+separation+and+high+salt+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation.</a> J. Biol. Methods. 2 (2), 20(2015).</li>
<li>Guo, D., Catchpoole, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+RNA+following+cryosections+of+archived+frozen+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue.</a> BioTechniques. 34, 48-50 (2003).</li>
<li>Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flexible+mouse-on-mouse+immunohistochemical+staining+technique+adaptable+to+biotin-free+reagents%2C+immunofluorescence%2C+and+multiple+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining.</a> J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).</li>
<li>Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+gene+analysis+of+130+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy+with+a+special+reference+to+muscle+mRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis.</a> Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).</li>
<li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).</li>
<li>Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection technology.</a> Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

과잉 수지가 풀 저온부의 수집 속도가 느려집니다 및 RNA 분리에 수지 오염을 포함 증가시킬 수 있기 때문에이 방법으로 최상의 결과를 얻으려면, 조직 냉동 보존하는 동안 근육의 낮은 세 번째 또는 절반으로 제한 수지를 포함 유지. 또한, 바늘 균질화 동안 세심한주의 수율을 최대화하고, 바늘 막힘 가능성을 최소화하는 것이 중요하다. 프로토콜은 니들이 차단 방해물을 제거하기 위해 높은 압력이 필요로 될 경우의 샘플 손상을 방지하기 위하여 루어 코리아 주사기를 사용하여 변형 될 수있다. 25 또는 26 게이지 바늘과 바늘 추가적인 균질화 단계는 상기 RNA 수율을 향상 할 수있는 미세 조직 현탁액을 생성하기 위해 첨가 될 수있다. 클로로포름은 BCP 대체 할 수 있지만 BCP 덜 독성 및 RNA (12)의 유기 추출 동안 수성 단계에서 게놈 DNA 오염의 낮은 수준의 결과로,이 권장되지 않습니다. 증가균질화 덜 효율적입니다으로 풀링 저온부 μm의 30의 단면 두께는 사용하지 않는 것이 좋습니다. <p cl...

이 기술의 목적은 하나의 작은 골격근 조직 소스로부터 액세스 같은 조직 학적 및 유전자 발현과 같은 다른 양상, 여러 실험을 분석하는 것이다. 현미경 애플리케이션 신중 동결 동안 얼음 결정 생성물의 형성을 제한하도록 제어 되어야만 보존 방법을 시료에 가장 민감하다. 따라서, 분석법 개발을 경골근에 기초한다 (TA) 근 부분적으로 면역 형광 현미경 유전자 발현 양 분석을위한 원료로서 -140 ° C 액체 질소 냉각 -2- 메틸 부탄 욕에서 수지 매립 덮여 냉동. 다양한 기술적 접근법 동일한 원료를 사용할 필요가 좌우 근육 상이한 조건 실험 하나는 제어를 나타내는 근육 주사 기반 실험을 위해 특히 중요하다. 예를 들어, 근육의 재생 과정에서, 하나의 MUscle는 반대측 근육 차량 주입 제어 한 역할을하면서 광범위한 조직 손상을 유발하는 독소를 주사한다. 마찬가지로, 근육 질환에 대한 유전자 치료 연구는 일반적으로 반대쪽이 빈 벡터, 벡터 또는 비 관련 차량 제어와 비교되는 근육 내 주사에 의한 유전자 치료 벡터의 유효성 시작한다. 따라서, 다른 어플리케이션에 각각 TA 근육을 소싱 할 수 없다. 이러한 문제점을 해결하기위한 일반적인 전략은 : ⅰ) ⅱ) 추가 마우스를 사용하거나, ⅲ) 각각의 애플리케이션에 대한 근육의 일부를 잘라, 어플리케이션마다 다른 근육 그룹을 사용. 그러나, 근육 그룹간에 상당한 차이가 어려운 개별 애플리케이션으로부터 데이터를 비교할 수 있도록, 추가 동물 비용을 증가시키고, 다른 대안이있을 경우 제대로 정렬된다. 다른 응용 프로그램을 소스로 절개 한 후 근육을 나누는 것은 최선의 선택의 난입니다n은 많은 경우. 단, 근육의 조각들은 균질화 2-5 액체 질소 또는 기계적 연마 기술에 따라 분쇄를 사용하기에는 너무 작다. 근육 세포 외 매트릭스 단백질과 수축 포장 높은 조직 구조이기 때문에, 불충분 한 기계적 균질화 이후 DNA, RNA 또는 단백질의 낮은 수율로 이끈다. 여기에 자세한 방법은 여러 응용 프로그램에서 사용하기위한 하나의 소스 근육에서 조직의 소량을 허용하고, 냉동 절편 바늘 분쇄의 포함은 더 나은 RNA 수율 기계적 균질화을 향상시킨다.

<table><tbody><tr><td>코르크</td><td>VWR Scientific</td><td>23420-708</td><td>날카로운 칼날로 작은 사각형으로 자릅니다.</td></tr><tr><td>플라스틱 커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td>얼어붙는 동안 근육의 방향을 잡는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>저온 온도계</td><td>VWR Scientific</td><td>89370-158</td><td></td></tr><tr><td>2-메틸부탄</td><td>시그마</td><td>M32631-4L</td><td>주의: 위험한 화학 물질. 가연성 캐비닛에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>임베딩 레진: "cryomatrix"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6769006</td><td>다른 임베딩 레진으로 cryomatrix를 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td>: <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>microm HM550(일회용 블레이드 캐리어 포함</td>) <td>작동하는 모든 저온 유지 장치가 프로토콜에 충분해야 합니다.</td></tr><tr><td>일회용 저온 유지 장치 블레이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3052835</td><td>사용할 저온 유지 장치에 적합한 블레이드 또는 나이프를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>RNAse 오염 제거 솔루션: "RNase Zap"Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>페인트 브러시</td><td>Daler Rowney</td><td>214900920</td><td>냉동 절편을 처리하는 데 사용합니다. 간단한 미술 용품이 있는 상점에서 찾을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>면도날</td><td>VWR Scientific</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR Scientific</td><td>48311600</td><td></td></tr><tr><td>RNA 유기 추출 시약: TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>주의: TRIzol은 유해 화학 물질입니다. 참고: 골격근에서 RNA를 추출하는 데는 유기 추출 시약만 권장됩니다.</td></tr><tr><td>18 게이지 바늘</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305185</td><td></td></tr><tr><td>22 게이지 바늘</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305155</td><td></td></tr><tr><td>26 게이지 바늘</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305115</td><td>선택 사항입니다. RNA 추출 프로토콜에서 3차 시료 분쇄에 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>VWR Scientific</td><td>BD309659</td><td>매우 높은 가치의 샘플의 경우 Luer-Lok 주사기를 권장합니다 (><예 : , VWR BD309628).</td></tr><tr><td>1-브로모-3-클로로펜탄(BCP)</td><td>시그마</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 물에 70% 에탄올: 200 프루프 알코올</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>+M18027161M</td><td>35ml 200프루프 알코올 + 15ml DEPC 물을 섞습니다.</td></tr><tr><td>DEPC 물 중 70% 에탄올: DEPC 처리된 물</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9922</td><td>35ml 200프루프 알코올 + 15ml DEPC 물을 혼합합니다.</td></tr><tr><td>RNA 정제 키트: PureLink RNA minikit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>RNA 준비의 마지막 단계.</td></tr><tr><td>DNase/Rnase-free 물&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td>DEPC 처리수도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>분광광도계: Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2222</td><td>정제된 RNA를 처리하여 다운스트림 적용 전에 DNA 오염을 제거합니다.</td></tr>소수<tr><td>성 펜</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8899</td><td></td></tr>, <tr><td>Dulbecco의 PBS,</td><td>Gibco</td><td>14190</td>, <td>PBS, 면역형광 프로토콜용.</td></tr><tr><td>당나귀 세럼</td><td>Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc</td><td>017-000-121</td><td>제조사의 지시에 따라 일반 당나귀 세럼 재고를 재수화하고, 면역형광을 위해 분취액을 5%로 희석하십시오.&nbsp; 일반 염소 혈청도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>eMHC 항체</td><td>University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>Collagen VI 항체</td><td>Fitzgerald Industries</td><td>#70R-CR009x</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 AlexaFluor488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG1 AlexaFluor546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21123</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6- 디아미디노-2-페닐린돌)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>수성 장착 매체: Permafluor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td>페이드 방지 특성이 있는 형광 애플리케이션용으로 설계된 장착 매체만 사용하십시오.</td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>VWR Scientific</td><td>16004-314</td><td>면역형광 프로토콜 끝에 슬라이드 장착에 사용</td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어: ImageProExpress</td><td>Media Cybernetics, Inc.</td><td>Image-Pro Express 또는 고급 제품</td><td>프리웨어 ImageJ도 수동 카운팅에 사용할 수 있습니다. 세분화 준수 기능이 있는 고급 소프트웨어는 프로세스의 부분 자동화를 허용할 수 있습니다. 예: , ImageProPremier.</td></tr><tr><td>섹션 이미지 병합 및 매핑: Photoshop</td>, <td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td></td></tr>, <tr><td>Cardiotoxin</td><td>Sigma</td><td>C9659</td>, <td>Sigma C9659가 중단되었습니다. 심독소에 대한 다른 옵션은 EMD Millipore #217503; 미국 사용자 정의 화학 공사 # BIO0000618; 또는 Ge 스크립트 # RP17303; 그러나 이것들은 검증되지 않았습니다.</td></tr><tr><td>역전사 키트: Superscript III First-strand synthesis system</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080051</td><td>검증된 고품질 역전사 시약을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>표준 PCR: GoTaq Flexi 중합효소 시스템</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td>검증된 고품질 Taq 중합효소 시스템을 사용할 수 있습니다. DNA 염기서열분석이 PCR의 모든 애플리케이션 다운스트림에 사용되는 경우, 대신 고충실도 PCR 시스템을 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7585</td><td>전용 qPCR 마스터 믹스를 사용하지 않을 때 qPCR에 사용합니다. SuperROX(Applied Biosystems 기기용) 및 GoTaq Flexi 중합효소 및 완충액과 함께 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>ROX: SuperROX, 15 mM</td><td>BioResearch Technologies, Inc. Novato CA</td><td>SR-1000-10</td><td>SuperROX는 PCR 반응에서 더 안정적이므로 ROX(카르복시-X-로다민)보다 qPCR 수동 참조 염료로 사용하는 것이 바람직합니다. Applied Biosystems 기기를 사용한 qPCR의 경우</td></tr><tr><td>Real-time PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT</td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 발현 및 조직 학적 분석을위한 단일 마우스 골격근의 연속 지역의 냉동 절편

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

이 방법으로, 연속 저온부는 하나의 마우스 골격 근육에서 인접 영역을 사용하여 유전자 발현을위한 조직 조직학 및 RNA의 농축 모두 현미경 응용 프로그램을 사용하기 위해 수집됩니다. 전형적으로, 그것은, 버퍼 볼륨이 효율적으로 연마 애플리케이션 너무 낮을 수 있기 때문에 아직 충분한 기계적 중단없이 작은 골격근 샘플의 적절한 균질화를 달성하는 도전 버퍼 시약 근육 제한 침투 치밀한 조직 구조는 궁극적으로 저 RNA 수율을 야기. 여기에보고 된 프로토콜에 따라 30 ㎛의 섹션을 수집하고 버퍼 침투 노출 표면적을 증가 저온 절편 이후 니들 균질화가 근육을 방해 기계적하게 풀링. 이 기술의 주요 제한은 저온 유지가 필요하다고하고, 이는 상대적으로 낮은 스루풋이다. 그러나, 고품질의 RNA를 풀링 m 작은 샘플로부터 얻을 수있다uscle 저온부는 여러 가지 골격 근육과 다른 조직이 방법은 액세스 할 수 있도록. 또한,이 기술은 유사한 가능 분석 (예, 조직 병리학 및 유전자 발현) 측정치가 직접 실험 불확실성을 감소시키고위한 작은 조직 소스 필요 복제 성 동물 실험을 감소시키는 애플리케이션에서 비교 될 수 있도록 하나의 골격근의 인접 영역에서 여러 응용 프로그램.

근육을 동결 절단 (Cryosections)의 RNA는 품질이 높고, 대부분의 응용 프로그램에 충분한 수율을 제공합니다 여섯 골격근 RNA 제제의 분석은 8 대조군 마우스로부터 풀링 경골근 (TA) 근 19.4 41 mg의 사용 표 1에 나타낸다. 모두 좌측 (L) 및 우측 (R) TA 근육이 방법을 이용하여 근육 손상을 일으킬 삼일 식염수 또는 10 μM의 cardiotoxin 25 μL의 길이 근육 주사 후 채취 근육 재생 실험에서 제조 된 이전에 1을보고 하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 근육 동결 절단 (Cryosections)의 RNA에 대해 A260 / 280 비를 대표 샘플이 전형적으로 가깝거나 더 높다. &quot;순수한&quot;RNA는 2.2 / 2.0 및 A260...

연속 크라이 섹션은 단일 마우스 골격근에서 인접 영역을 이용한 유전자 발현 측정 학적 어플리케이션 및 RNA의 농축을 가능하게 수집된다. 직접 애플리케이션에서 비교 풀링 저온부 및 측정 30mg을 - 고품질 RNA를 (20)로부터 얻어진다.

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

이 절차의 전반적인 목표는 단일 조직의 인접한 부분에서 조직학적 및 분자 매개변수를 분석할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법을 통해 우리는 골격근 생물학 및 질병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 근육 손상 후 재생 효과는 무엇이며 근육 주사에 의한 바이러스 유전자 전달의 효과는 무엇입니까?이 방법의 장점은 조직학적 및 분자 데이터가 단일 조직에서 직접 상관될 수 있다는 것입니다. 이를 통해 데이터를 보다 효과적으로 분석하고 실험 조직을 더 잘 활용할 수 있습니다. 해부를 완료하기 5분 전에 냉동 보존 수조를 식힙니다.조직 샘플을 삽입할 준비가 되면 먼저 근육이 코르크와 만나는 조직의 아래쪽 3분의 1에서 절반에 임베딩 레진을 적용합니다. 이것은 다운스트림 단계와의 수지 간섭을 줄이기 위해 깔끔하게 수행되어야 합니다. 그런 다음 즉시 코르크를 섭씨 영하 140도로 냉각된 2-메틸부탄 욕조에 떨어뜨립니다.배치당 최대 8개의 조직 제제를 포함할 수 있습니다. 욕조에서 30초 동안 조직을 저어주고 비커의 바닥을 긁어내어 조직 코르크가 용액 속으로 얼지 않도록 합니다. 30초 후 금속 도구를 사용하여 2-메틸부탄에서 조직 코르크를 당깁니다.그런 다음 지지하는 커버 슬립을 빠르게 제거합니다. 여분의 2-메틸부탄을 다시 수조에 두드린 다음 조직 코르크를 외부 질소 수조에 떨어뜨립니다. 모든 조직을 액체 질소로 옮긴 후 용기로 옮겨 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.저온 유지 장치를 준비하고 조직 샘플을 장착한 후 굵고 미세한 컨트롤을 사용하여 검체를 블레이드까지 전진시켜 블레이드에 닿도록 합니다. 이 시점에서 단면 두께의 합을 0으로 재설정합니다. 다음으로, 저온 유지 장치를 단면 두께가 30미크론인 트림 기능으로 설정합니다.그리고 원하는 조직 깊이까지 절편을 자르고 버립니다. RNA 추출을 위한 극저온 절편을 효율적으로 수집하려면 먼저 수집 튜브를 열고 블레이드 캐리어 근처에 놓습니다. 거기에서 미리 냉각된 깨끗한 브러시를 사용하여 각 섹션을 집어 튜브로 옮깁니다.400에서 4, 000 미크론 조직 깊이에서 취한 풀링 30 미크론 쥐 경골 전방 절편은 일반적으로 25 - 50 밀리그램의 근육을 산출합니다. 임베딩 레진이 동결 절편을 둘러싸고 있는 경우 핸드 브레이크를 잠그고 면도날을 사용하여 근육 상단 주위에 얇은 층만 남을 때까지 작은 레진 조각을 면도합니다. 항상 칼날이 근육에서 멀어지도록 레진을 자릅니다.포매딩 수지의 얇은 층은 다운스트림 RNA 추출을 실질적으로 손상시키지 않습니다. 더 두꺼운 임베딩 레진이 있는 경우, 동결 절편을 수집 튜브로 이동하기 전에 브러시를 사용하여 근육에서 레진을 떼어냅니다. 절편 과정에서 조직학적 절편이 필요한 경우 저온 유지 장치 컨트롤을 사용하여 절편 두께를 7미크론으로 재설정합니다.그런 다음 4-7개의 섹션을 자르고 버리면 일관되고 균일한 조직 표면을 얻고 이 조직 깊이를 기록해 둡니다. 이제 좋은 부분을 잘라 블레이드 캐리어 표면의 방향을 잡습니다. 실온 현미경 슬라이드를 사용하여 섹션을 선택하고 슬라이드를 실온으로 되돌립니다.원하는 모든 섹션을 수집한 다음 최종 조직 깊이를 기록해 둡니다. 절편을 완료한 후 RNA 분리를 위해 풀링된 동결절편의 중량을 빠르게 기록합니다. 즉시 튜브를 저온 유지 챔버로 되돌려 섹션의 온도를 섭씨 영하 20도에 가깝게 유지합니다.먼저 풀링된 극저온 절편을 얼음으로 빠르게 옮기고 극저온 절편 50mg당 약 1밀리리터의 유기 RNA 추출 시약을 추가합니다. 시약을 빨리 살포할수록 RNA의 분해가 줄어듭니다. 다음으로, 18게이지 바늘이 있는 1밀리리터 주사기를 사용하여 용액을 반복적으로 추출하고 튜브 벽으로 배출하여 너무 많은 기포를 만들지 않고 극저온 절편을 균질화합니다.바늘 끝을 사용하여 뭉친 조각을 분산시킵니다. 다섯 번 칠 때마다 샘플을 얼음에 잠시 되돌려 식히십시오. 균질화되면 22게이지 바늘을 사용하여 5회 더 스트로크를 사용하여 샘플을 조심스럽게 분쇄합니다.그런 다음 샘플을 얼음에 다시 넣습니다. 이 과정을 3-4회 반복하여 매우 미세하게 분산된 조직 균질성을 얻습니다. 최종 균질액이 만들어지면 실온에서 5분 동안 배양하여 분자 복합체를 파괴합니다.다음으로, 흄 후드에 RNA 분리 시약 1밀리리터당 0.1밀리리터의 BCP를 첨가합니다. 그런 다음 15초 동안 튜브를 세게 흔듭니다. 소용돌이를 사용하지 마십시오.그런 다음 실온에서 2-3분 동안 샘플을 배양합니다. 짧은 배양 후, 12, 000g 및 섭씨 4도에서 15분 동안 샘플을 원심분리합니다. 그런 다음 RNA를 포함하는 투명한 상부상을 조심스럽게 수집합니다.깨끗한 튜브로 옮기고 심해수로 구성된 70% 에탄올을 같은 부피로 첨가하십시오. 튜브를 잠시 와류로 가열한 후 실온에서 10분 동안 배양하고 텍스트 프로토콜에 따라 진행합니다. 골격근 RNA 제제는 마우스의 경골 전방으로부터 이루어졌다.3일 전, 일부 근육에는 10마이크로몰의 심독소를, 다른 근육에는 식염수를 주입했다. 이 샘플에서 추출한 RNA의 순도와 수율은 우수했습니다. RNA 수율은 독소 손상 후 경골 전방 근육에서 상당히 높았습니다.조직 무결성과 RNA 생산이 이러한 관찰에 영향을 미칠 수 있습니다. 준비된 RNA 품질의 지속성은 18개월 동안 섭씨 영하 20도에서 보관된 1마이크로리터의 RNA를 사용하여 평가되었습니다. 두드러진 18S 및 28S 리보솜 RNA 띠는 높은 RNA 품질을 보여주는 샘플에서 여전히 분명합니다.7미크론 절편은 빨간색으로 보이는 배아 미오신 중쇄의 발현을 위해 염색되었습니다. 재생 섬유를 감지하기 위해, 콜라겐 6으로 염색되고, 근육 섬유의 윤곽을 그리는 녹색으로 보이며, 파란색으로 염색되어 핵을 관찰합니다. 독소 주입이 불량하면 부상이 경미한 것처럼 보입니다.성공적인 독소 주입은 표적 근육 구획의 훨씬 더 큰 영역이 영향을 받는 결과를 낳습니다. 손상 정도는 RNA 분석을 위한 포함 기준으로 사용할 수 있습니다. 일단 마스터하면 RNA 추출 및 조직학적 슬라이드를 위한 절단 절편을 단일 조직에 대해 30분 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차에 따라 면역형광 염색의 다른 조직학을 따라 다양한 질문에 답할 수 있습니다. 풀링 동결절편은 DNA 또는 단백질을 수집하는 데에도 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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냉동 조직 절편에서 전사체 및 후생유전체 표적의 공간적으로 분리된 단일 세포 통합 다중체체 프로파일링

배우세요 단일 마우스 골격근의 연속 냉동 절편을 이용하여 조직학적 및 분자적 매개변수를 분석하는 방법을. 이 기법은 근육 재생 및 유전자 전달 연구에서 조직학 데이터와 유전자 발현 데이터를 직접적으로 상관관계시켜 실험 조직의 효율적인 활용을 가능하게 합니다.

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