유전자 발현 및 조직 학적 분석을위한 단일 마우스 골격근의 연속 지역의 냉동 절편

이 절차의 전반적인 목표는 단일 조직의 인접한 부분에서 조직학적 및 분자 매개변수를 분석할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법을 통해 우리는 골격근 생물학 및 질병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 근육 손상 후 재생 효과는 무엇이며 근육 주사에 의한 바이러스 유전자 전달의 효과는 무엇입니까?

이 방법의 장점은 조직학적 및 분자 데이터가 단일 조직에서 직접 상관될 수 있다는 것입니다. 이를 통해 데이터를 보다 효과적으로 분석하고 실험 조직을 더 잘 활용할 수 있습니다. 해부를 완료하기 5분 전에 냉동 보존 수조를 식힙니다.

조직 샘플을 삽입할 준비가 되면 먼저 근육이 코르크와 만나는 조직의 아래쪽 3분의 1에서 절반에 임베딩 레진을 적용합니다. 이것은 다운스트림 단계와의 수지 간섭을 줄이기 위해 깔끔하게 수행되어야 합니다. 그런 다음 즉시 코르크를 섭씨 영하 140도로 냉각된 2-메틸부탄 욕조에 떨어뜨립니다.

배치당 최대 8개의 조직 제제를 포함할 수 있습니다. 욕조에서 30초 동안 조직을 저어주고 비커의 바닥을 긁어내어 조직 코르크가 용액 속으로 얼지 않도록 합니다. 30초 후 금속 도구를 사용하여 2-메틸부탄에서 조직 코르크를 당깁니다.

그런 다음 지지하는 커버 슬립을 빠르게 제거합니다. 여분의 2-메틸부탄을 다시 수조에 두드린 다음 조직 코르크를 외부 질소 수조에 떨어뜨립니다. 모든 조직을 액체 질소로 옮긴 후 용기로 옮겨 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

저온 유지 장치를 준비하고 조직 샘플을 장착한 후 굵고 미세한 컨트롤을 사용하여 검체를 블레이드까지 전진시켜 블레이드에 닿도록 합니다. 이 시점에서 단면 두께의 합을 0으로 재설정합니다. 다음으로, 저온 유지 장치를 단면 두께가 30미크론인 트림 기능으로 설정합니다.

그리고 원하는 조직 깊이까지 절편을 자르고 버립니다. RNA 추출을 위한 극저온 절편을 효율적으로 수집하려면 먼저 수집 튜브를 열고 블레이드 캐리어 근처에 놓습니다. 거기에서 미리 냉각된 깨끗한 브러시를 사용하여 각 섹션을 집어 튜브로 옮깁니다.

400에서 4, 000 미크론 조직 깊이에서 취한 풀링 30 미크론 쥐 경골 전방 절편은 일반적으로 25 - 50 밀리그램의 근육을 산출합니다. 임베딩 레진이 동결 절편을 둘러싸고 있는 경우 핸드 브레이크를 잠그고 면도날을 사용하여 근육 상단 주위에 얇은 층만 남을 때까지 작은 레진 조각을 면도합니다. 항상 칼날이 근육에서 멀어지도록 레진을 자릅니다.

포매딩 수지의 얇은 층은 다운스트림 RNA 추출을 실질적으로 손상시키지 않습니다. 더 두꺼운 임베딩 레진이 있는 경우, 동결 절편을 수집 튜브로 이동하기 전에 브러시를 사용하여 근육에서 레진을 떼어냅니다. 절편 과정에서 조직학적 절편이 필요한 경우 저온 유지 장치 컨트롤을 사용하여 절편 두께를 7미크론으로 재설정합니다.

그런 다음 4-7개의 섹션을 자르고 버리면 일관되고 균일한 조직 표면을 얻고 이 조직 깊이를 기록해 둡니다. 이제 좋은 부분을 잘라 블레이드 캐리어 표면의 방향을 잡습니다. 실온 현미경 슬라이드를 사용하여 섹션을 선택하고 슬라이드를 실온으로 되돌립니다.

원하는 모든 섹션을 수집한 다음 최종 조직 깊이를 기록해 둡니다. 절편을 완료한 후 RNA 분리를 위해 풀링된 동결절편의 중량을 빠르게 기록합니다. 즉시 튜브를 저온 유지 챔버로 되돌려 섹션의 온도를 섭씨 영하 20도에 가깝게 유지합니다.

먼저 풀링된 극저온 절편을 얼음으로 빠르게 옮기고 극저온 절편 50mg당 약 1밀리리터의 유기 RNA 추출 시약을 추가합니다. 시약을 빨리 살포할수록 RNA의 분해가 줄어듭니다. 다음으로, 18게이지 바늘이 있는 1밀리리터 주사기를 사용하여 용액을 반복적으로 추출하고 튜브 벽으로 배출하여 너무 많은 기포를 만들지 않고 극저온 절편을 균질화합니다.

바늘 끝을 사용하여 뭉친 조각을 분산시킵니다. 다섯 번 칠 때마다 샘플을 얼음에 잠시 되돌려 식히십시오. 균질화되면 22게이지 바늘을 사용하여 5회 더 스트로크를 사용하여 샘플을 조심스럽게 분쇄합니다.

그런 다음 샘플을 얼음에 다시 넣습니다. 이 과정을 3-4회 반복하여 매우 미세하게 분산된 조직 균질성을 얻습니다. 최종 균질액이 만들어지면 실온에서 5분 동안 배양하여 분자 복합체를 파괴합니다.

다음으로, 흄 후드에 RNA 분리 시약 1밀리리터당 0.1밀리리터의 BCP를 첨가합니다. 그런 다음 15초 동안 튜브를 세게 흔듭니다. 소용돌이를 사용하지 마십시오.

그런 다음 실온에서 2-3분 동안 샘플을 배양합니다. 짧은 배양 후, 12, 000g 및 섭씨 4도에서 15분 동안 샘플을 원심분리합니다. 그런 다음 RNA를 포함하는 투명한 상부상을 조심스럽게 수집합니다.

깨끗한 튜브로 옮기고 심해수로 구성된 70% 에탄올을 같은 부피로 첨가하십시오. 튜브를 잠시 와류로 가열한 후 실온에서 10분 동안 배양하고 텍스트 프로토콜에 따라 진행합니다. 골격근 RNA 제제는 마우스의 경골 전방으로부터 이루어졌다.

3일 전, 일부 근육에는 10마이크로몰의 심독소를, 다른 근육에는 식염수를 주입했다. 이 샘플에서 추출한 RNA의 순도와 수율은 우수했습니다. RNA 수율은 독소 손상 후 경골 전방 근육에서 상당히 높았습니다.

조직 무결성과 RNA 생산이 이러한 관찰에 영향을 미칠 수 있습니다. 준비된 RNA 품질의 지속성은 18개월 동안 섭씨 영하 20도에서 보관된 1마이크로리터의 RNA를 사용하여 평가되었습니다. 두드러진 18S 및 28S 리보솜 RNA 띠는 높은 RNA 품질을 보여주는 샘플에서 여전히 분명합니다.

7미크론 절편은 빨간색으로 보이는 배아 미오신 중쇄의 발현을 위해 염색되었습니다. 재생 섬유를 감지하기 위해, 콜라겐 6으로 염색되고, 근육 섬유의 윤곽을 그리는 녹색으로 보이며, 파란색으로 염색되어 핵을 관찰합니다. 독소 주입이 불량하면 부상이 경미한 것처럼 보입니다.

성공적인 독소 주입은 표적 근육 구획의 훨씬 더 큰 영역이 영향을 받는 결과를 낳습니다. 손상 정도는 RNA 분석을 위한 포함 기준으로 사용할 수 있습니다. 일단 마스터하면 RNA 추출 및 조직학적 슬라이드를 위한 절단 절편을 단일 조직에 대해 30분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 면역형광 염색의 다른 조직학을 따라 다양한 질문에 답할 수 있습니다. 풀링 동결절편은 DNA 또는 단백질을 수집하는 데에도 사용할 수 있습니다.