소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

이 절차의 전반적인 목표는 하나의 박테리아 균주에 의해 생성된 제제 중 두 번째 박테리아 균주에 대해 억제되는 제제를 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 여러 미생물 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있지만 미생물 생태학에서 길항 박테리아 상호 작용을 이해하는 데 특히 유용합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 저렴하고 수행 및 해석이 쉽다는 것입니다.

절차를 시연하는 것은 실험실의 학생인 Aretha가 맡을 것입니다. 실험을 시작하려면 P syringae의 단일 콜로니를 3ml의 King's Medium B 육수(KB)에 접종합니다. 하룻밤 사이에 문화를 배양하십시오. 다음 날 아침, 배양한 육수를 1-100으로 신선한 KB 육수 3ml에 희석합니다.

실온에서 흔들면서 3-4시간 동안 배양액을 배양합니다. 배양액의 탁도가 눈에 띄게 증가하는지 확인한 다음 Mitomycin C.Next를 첨가하여 실온에서 흔들면서 밤새 배양물을 배양합니다. 다음 날, 1-2 밀리리터의 미토마이신 C 유도 배양액을 벤치탑 마이크로 원심 분리기에서 펠릿으로 만들었습니다.

배양 상층액을 0.22마이크로미터의 기공 크기 필터에 통과시켜 배양 상층액을 제거하고 살균합니다. 염화나트륨을 첨가하여 1몰 농도에 도달하고 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG 8000을 10% 최종 농도로 멸균 상등액에 추가합니다. 염화나트륨과 PEG가 모두 완전히 용해될 때까지 샘플을 반복적으로 뒤집습니다.

얼음 수조에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로 샘플을 원심분리합니다. 회전 후, 상층액을 디캔팅하고 반복적으로 피펫팅하여 펠릿을 완충액에 다시 현탁시킵니다.

동일한 부피의 클로로포름으로 두 번의 순차적 추출로 잔류 PEG를 제거합니다. 클로로포름과 다시 현탁된 펠릿과 결합하고 혼합물을 15초 동안 와류로 가열합니다. 다음 20, 5 분 동안 G 000 시간에 혼합물을 분리기

상부 수성상을 새로운 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 수성 상과 유기 상 사이의 흰색 계면이 보이지 않을 때까지 이 추출을 두 번 반복합니다. 잔류 클로로포름이 흄 후드에서 추출된 상등액에서 증발하도록 합니다.

P syringae 균주의 단일 콜로니를 3ml의 KB로 접종하고 실온에서 진탕하여 밤새 배양합니다. 다음 날 아침, 배양액을 1에서 100까지 새로운 KB로 희석합니다. 실온에서 흔들면서 3-4시간 동안 배양액을 배양합니다. 다음으로, 초순수에 한천의 현탁액을 고압멸균하여 멸균된 물 한천을 준비합니다.

사용하기 전에 용융된 부드러운 한천을 섭씨 60도의 수조에서 유지하십시오. 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 3ml의 부드러운 한천을 멸균 배양 튜브에 옮깁니다. 배양 튜브를 수조에 다시 넣어 용융 상태로 유지하십시오.

오버레이를 붓기 전에 용융된 한천을 식히되 응고시키지 마십시오. 접종 전에 한천을 뜨겁고 완전히 용융된 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 오버레이가 거칠게 보이고 해석하기가 더 어려워집니다.

멸균 후드에서 100마이크로리터의 테스터 균주 배양액을 부드러운 한천과 와류에 접종하여 혼합합니다. 배양물을 10-15초 동안 손으로 회전시킨 다음 한천 접시 바닥에 붓습니다. 부드러운 한천이 바닥 한천을 고르게 덮도록 플레이트를 모든 방향으로 기울입니다.

접시를 덮고 굳을 때까지 20-30분 동안 기다립니다. 응고되는 동안 플레이트를 방해하지 않도록 주의하십시오. 응고되면 오버레이에 2-5마이크로리터의 상층액을 묻힙니다.

플레이트를 실온에서 밤새 배양합니다. 다음 날 아침에 결과를 관찰하고 기록합니다. 이 방법을 사용하면 두 가지 P syringae 균주가 서로 다른 박테리오신 (bacteriocin)에 의해 억제됩니다.

균주 A는 고분자량 박테리오신 Tailocin에 민감하지만 대체 저분자량 박테리오신 Bacteriocin에는 민감하지 않습니다. 반대로, B균주는 타이로신에 민감하지 않지만 저분자량 박테리오신 (Bacteriocin)에는 민감합니다. Tailocin은 PEG 침전 후 효율적으로 회수되지만 저분자량 Bacteriocin은 그렇지 않습니다.

박테리오파지 매개 살해(Bacteriophage mediated killing)는 희석 계열을 비교하여 다른 비복제성 항균제와 구별됩니다. 박테리오파지 매개 투명화의 경우, 상층액의 희석은 개별 플라크 또는 투명화 영역으로 분해된 반면, 박테리오신 매개 투명화는 이러한 플라크로 분해되지 않았습니다. 이 절차는 억제제를 식별하기 위한 초기 스크리닝으로 사용할 수 있으며, 이러한 활성의 원인을 식별하거나 확인하기 위해 다운스트림 유전자 조작과 결합할 수 있습니다.