Name: 전임상 치료의 양적 및 종 방향 평가를위한 동계 마우스 모델 전이성의 신장 세포 암 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 학습하세요 면역능력이 있는 마우스에서 신세포암의 정위 모델을 수립하여 종양 성장과 전이를 연구하는 방법을. Renca 세포를 신장 내 이식하여 임상과 유사한 폐 전이를 유도하고 전임상 치료 효능을 평가합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 국립 암 연구소 (R15CA173657 AW와 TSG에 R01CA109446에), (AW까지) 시몬스 암 연구소 및 Minnestoa 대학에서 보조금 (TSG에) 4 신장 암 재단 등반에 의해 지원되었다. 우리는 면역에 도움 박사 크리스틴 앤더슨합니다.

다음 프로토콜은 유도 및 실험 소성을 신장 종양 및 잠재적 자연 전이의 성장을 모니터링하기위한 실험 절차를 설명합니다. 다음 절차는 모두 실험 동물의 인도적인 사용에 관한 제도적 정책 및 승인 절차에 따라 수행됩니다. 세포주 1. 유지 관리 <ol><li> 쥐 신장 선암 세포주를 유지 Renca은 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 배지를 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 및 1 mM의 보충 비 필수 아미노산, L- 글루타민 각 (완전 RPMI 함), 나트륨 피루 베이트. 배양 37 ℃ 세포 배양기에서 5 % CO 2. 주 : 확립 된 세포주와 마찬가지로 장기 종파 후 발생할 수있는 표현형 또는 유전 적 변화를 최소화하기 위해 형질 전환 이후의 주입을위한 통로 낮은 번호 Renca 세포를 사용하는 것이 권장URE. <ol><li> 안정적으로 녹색 형광 단백질 (GFP)와 반딧불 루시 페라을 표현하는 Renca 세포를 엔지니어링하는 트랜스포존 시스템을 사용합니다. <ol><li> 트랜스 발현 벡터 (pPGK-SB11) 및 개똥 벌레 루시페라아제의 발현 트랜스포존 벡터 부호화뿐만 아니라 GFP하는 융합 유전자 부호화와 제 오신 내성 유전자를 가진 양이온 성 리포솜 기반의 형질 감염 시약, 공동 트랜 Renca 세포를 사용 , 양방향 프로모터 (pKT2 / LuBiG) (19)의 전사 제어하에 둘. </li><li> 이틀 후, 제한 희석에 형질 전환 된 세포를 도금하고 완전한 RPMI이 오신 (300 ㎍ / mL)으로 보충에 세포가 확장 할 수 있습니다. 유동 세포 계측법에 의해 각 클론의 GFP 발현을 확인한다. 이 세포들은 Renca-GL을 불린다. 주 : 제한 희석 클로닝 단일 세포로부터 유도 될 수있는 선택된 셀을 허용한다. </li></ol></li></ol></li><li> intrarenally Renca 세포를 이식하려면 Renca 세포 전 준비행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)에 2 × 106 세포 / ㎖의 단일 세포 현탁액 NTO. <ol><li> HBSS에서 0.25 % 트립신을 이용하여 조직 배양 플라스크에서 Renca 부착 세포를 제거한다. ~ 5 분 후, 트립신을 중화 세정하는 원심 분리 튜브에 세포를 전송하는 완전 RPMI 플라스크에 추가. 원심 25 ° C에서 5 분 동안 300 g의 원심 상대 력 (RCF XG)의 세포. </li><li> 상등액을 가만히 따르다 HBSS에서 세포를 재현 탁. 혈구를 사용하여 세포를 세어 / ㎖를 2 × 106 세포를 수득 HBSS로 볼륨을 조절한다. </li><li> 세포의 전단 응력을 방지하기 위해, 18 게이지 바늘이 장착 된 1 ml 주사기로 세포를 그린다. 종양 세포의 주입 이전에 28 게이지 바늘을 18 게이지 바늘을 장착. 0.1 용액의 주입은 신장에 2 × 105 세포를 제공한다. </li></ol></li></ol> 2. 외과 영역 준비 <ol><li> 멸균 수술 준비가열 패드 위에 멸균 된 수술 용 드레이프를 배치하여 바이오 캐비닛 영역. 핀셋, 메스 위, 점안제, 5 % 포비돈 요오드 살균, 멸균 거즈 포함하는 모든 물품을 수집. 사용하기 전에 모든 악기를 압력솥. </li><li> 무균 팁 기술을 사용하여 수술을 수행합니다. 구슬 살균기와 동물 사이의 재 멸균 악기. 멸균 장갑, 실험실 코트, 그리고 얼굴에 마스크를 착용 할 것. </li></ol> 3. 동물 제조 <ol><li> 기관 가이드 라인에 따라 (각각 87.5 ㎎ / ㎏ 12.5 밀리그램 / kg, IP)을 케타민 / 자일 라진으로 마취 한 마우스. 발가락 핀치를 수행하여 마취 깊이를 결정합니다. </li><li> 동물은 무응답 성으로 간주되면 (손가락) 버릴 면도 또는 털 (가위를 사용)으로의 Balb / c 마우스에 주입 부위 (예를 들어, 왼쪽 측면)을 준비한다. </li><li> 수술 영역 (예를 들어, 주택 케이지) 수술 준비 영역에서 마우스를 이동하고에 수의사 연고를 적용눈이 건조를 방지합니다. 대충 5 % 포비돈 - 요오드와 방부제 제조 절개 부위를 면봉. </li><li> 절개는 수술 전 마취로한다 지역으로 부피 바카 인 히드로 클로라이드 (2.5 ㎎ / ㎖ 용액, SC 0.1 ㎖)에 주입한다. </li><li> 조심스럽게 있도록 복막을 침투하지, 멸균 메스 나 가위를 사용하여 동물의 왼쪽 측면에 - (1.5 cm ~ 1.0) 단일 절개를합니다. 멸균 가위 복막에서 진피 별개. 모든 혈액을 제거 멸균 거즈로 절개 사이트를 DAB. </li><li> 옆구리를 지원하기 위해 머리와 오른손을 잡고 왼손을 사용하여, 두 손으로 마우스를 잡고. </li><li> 아래에서 만져 마우스 오른쪽 손의 하나 개의 손가락, 복막을 통해 비장을 식별하고; 신장은 이제 복막을 통해 볼 수 있어야합니다. 복막 및 신장에서 긴장을 제공하기 위해 동물의 확고한 보류를 유지합니다. </li><li> 두 번째 사람은 종양의 CE 마크를 삽입 한LLS (섹션 1.2에서 제조). 본래 복막으로 28 게이지 바늘이 장착 1 mL를 주사기를 사용하여 신장의 중심으로. 천천히 세포 0.1 ㎖ (2 × 105)를 제공한다. (10)의 셀의 역류를 감소 - 세포를 주입 후 5가 제자리에 바늘을 잡아. 세포를 주입 사람이 마우스를 잡고 사람의 손가락에 가까이에 바늘을 가져 오는 것,이 단계에서 극단주의에 대한 필요성을 주목하는 것이 중요하다. </li><li> 바늘을 제거하고 조직 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 얇은 층을 절개를 닫는다. </li><li> 멸균 종이 타월 깨끗한 케이지로 다시 동물을 놓는다. 동물이 가열 패드에 복구 할 수 있습니다. 회복 기간 동안 무인 동물을 두지 마십시오. 그들은 똑바로 세워 흉골 때까지 표준 주택 조건에 동물을 반환하지 않습니다. 실험 동물을 사용하는 모든 과정에서 제도적 지침을 따르십시오. </li></ol> 4. 바이오발광 이미징 <ol><li> 생물 발광 영상으로 종양의 성장을 모니터링합니다. 참고 : 발광 생물 이미징을 수행하기위한 절차 세부 사항은 임 등의 알에서 얻을 수 있습니다. 20 루시퍼 신호는 종양 세포 주입 후 빠르면 24 시간을 검출 할 수있다. 이 모델에는 외부 보이는 종양이 없기 때문에, 주기적으로 종양의 성장을 모니터링하는 것이 필수적입니다. 설계된 실험에 따라, 동소 종양의 성장은 시간의 길이를 변화시키는 진행할 수 있습니다. 루시퍼 라제 - 표현 Renca 세포를 사용하여 하나의 장점은 종양의 성장이 반복적으로 실험 기간 동안 일정한 간격으로 같은 동물에서 모니터링 할 수 있으며, 종양 - 베어링과 종양이없는 기관의 특정 질의가에서 할 수 있다는 것입니다 정의 된 엔드 포인트. <ol><li> 루시페린 IP (멸균 PBS에 15 ㎎ / ㎖ 용액 0.1 ㎖)을 주입하고 생물 발광 이미징 시스템에 마우스를 배치하기 전에 10 분 동안 순환 할 수있다. 미주리 배치<html> 그 등쪽면을 위로 사용 위로 향 분사 신장을 위해, 약간 옆으로 겹쳐서. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 (ROI)의 규정 된 영역 내에 초 (광자 플럭스)마다 발광 광자 종양 부담을 측정한다. </li></ol></li><li> 개별 기관에서 종양 부담의 정량. 참고 : 정량 안락사 생쥐에서 그들의 제거 후 개별 기관에 정의 된 시간 지점에서 수행 할 수 있습니다. <ol><li> 단계 4.1에서와 같이, 루시페린과 쥐를 주입. </li><li> 10 분 후, 승인 된 절차를 사용하여 마우스를 안락사. </li><li> 관심있는 기관 해부 (예를 들어, 신장, 폐, 아래 섹션 5 참조). 35 × 10-mm 배양 접시에 조직을 전송하고 생물 발광 이미징 시스템에 배치합니다. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정의 된 ROI 내에 제 (광자 플럭스)마다 발광 광자 종양 부담을 측정한다. </li></ol></li></ol><html> e_title &quot;&gt; 5. 장기 수확 <ol><li> 각 실험에 대한 엔드 포인트 정의 바람직 기관 가이드 라인 (예를 들어, CO 2, 경추 탈구 마취 과다)에 의한 종양 - 함유 마우스를 안락사. 폐 인도 잉크 인플레이션 이후에 수집되는 경우, 자궁 경부 탈구를 방지. </li><li> 습식 장기 중량을 측정함으로써 주입 신장 차 신장 종양 성장의 육안 평가를 수행한다. <ol><li> (g)에서 종양 질량을 결정하기 위해 (21)을 분리하고, 종양 - 함유 신장과 신장 무게의 차이는 종양 덩어리를 정의하는 동일한 마우스에서 대측 신장을 단다. 조심스럽게 자신의 무게를 측정하기 전에 절제된 신장에서 불필요한 결합 조직을 멀리 해부하다. </li></ol></li><li> Fekete의 솔루션에 폐를 인도 잉크 전 절제술을 함께 폐를 팽창 즉시 고정에 의해 폐에 종양 전이의 정도를 평가아가씨 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 22. 폐 표면에 전이 병변의 수동 계산은 다음을 수행 할 수 있습니다. <ol><li> 흉곽을 통해 중반 복부에서 시작 가위를 사용하여 중간 선 절개를 확인하고 최대 목 / 침샘을 통해. 조심스럽게 폐 조직을 손상시키지 않고, 가위와 집게를 사용하여 갈비뼈를 제거합니다. </li><li> 결합 조직을 제거하여기도를 노출. </li><li> HBSS 10 % 먹물 용액으로 충전 된 18 게이지 바늘을 가진 주사기 3 ㎖를 준비한다. </li><li> 집게를 사용하여 조심스럽게 기관에서 실크 봉합사 스레드. 이것은 한 번 팽창 기관을 묶는 데 사용됩니다. </li><li> 조심스럽게 기관 아래 바늘을 삽입하고 천천히 인도 잉크 솔루션으로 폐를 팽창 할 수있는 주사기를 우울. 약 한 - 인도 잉크 액 1.5 mL를 완전히 폐를 부풀려 것입니다. </li><li> 잉크의 역류를 억제하는 바늘 아래 봉합사 여러 묶은 의해 폐쇄기도 핀치. </li><li> Remov전자 바늘 조심스럽게 팽창 된 폐를 제거하는 결합 조직을 버려야. </li><li> 화학 퓸 후드에서 5 ㎖ Fekete의 용액을 함유하는 15 mL의 원뿔형 튜브에 폐를 배치했다 (95 %의 EtOH 35 ㎖, DH 2 O 15 ㎖, 포름 알데히드 5 ㎖ 및 빙하 산성 산 2.5 mL를 100 ML 글래스 병) 23. </li><li> 실온에서 48 시간 이전에 수동으로 탈 염색 종양 결절을 계산하기 - 폐는 24 / destain를 해결 할 수 있습니다. </li><li> 탈색 후 그대로 폐를 제거하고 조심스럽게 35 X 10mm 페트리 접시에 엽에 의해 고정 된 폐를 해부. 해부 현미경 하에서 각 로브에 종양 결절의 개수 (흰색 결절) 개수. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.3322/caac.21387/full">Cancer statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 66, 7-30 (2016).</li>
<li>Chow, W. H., Dong, L. M., Devesa, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+risk+factors+for+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and risk factors for kidney cancer.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 245-257 (2010).</li>
<li>Hollingsworth, J. M., Miller, D. C., Daignault, S., Hollenbeck, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rising+incidence+of+small+renal+masses%3A+a+need+to+reassess+treatment+effect%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Rising incidence of small renal masses: a need to reassess treatment effect.</a> J. Natl. Cancer Inst. 98, 1331-1334 (2006).</li>
<li>Lee-Ying, R., Lester, R., Heng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+management+and+future+perspectives+of+metastatic+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Current management and future perspectives of metastatic renal cell carcinoma.</a> Int. J. Urol. 21, 847-855 (2014).</li>
<li>Rini, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+in+kidney+cancer%3A+therapeutic+advances+through+understanding+the+molecular+basis+of+response+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">New strategies in kidney cancer: therapeutic advances through understanding the molecular basis of response and resistance.</a> Clin. Cancer Res. 16, 1348-1354 (2010).</li>
<li>Acquavella, N., Fojo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+cell+carcinoma%3A+trying+but+failing+to+improve+the+only+curative+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Renal cell carcinoma: trying but failing to improve the only curative therapy.</a> J. Immunother. 36, 459-461 (2013).</li>
<li>Salup, R. R., Wiltrout, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+immunotherapy+of+established+murine+renal+cancer+by+interleukin+2-stimulated+cytotoxic+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes.</a> Cancer Res. 46, 3358-3363 (1986).</li>
<li>Ko, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+differential+suppression+of+myeloid-derived+suppressor+cell+subsets+by+sunitinib+is+compartmentally+constrained%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct and differential suppression of myeloid-derived suppressor cell subsets by sunitinib is compartmentally constrained.</a> Cancer Res. 70, 3526-3536 (2010).</li>
<li>Kusmartsev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+regulates+expression+of+VEGFR1+in+myeloid+cells%3A+link+to+tumor-induced+immune+suppression+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress regulates expression of VEGFR1 in myeloid cells: link to tumor-induced immune suppression in renal cell carcinoma.</a> J. Immunol. 181, 346-353 (2008).</li>
<li>Rocha, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endostatin+gene+therapy+enhances+the+efficacy+of+IL-2+in+suppressing+metastatic+renal+cell+carcinoma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Endostatin gene therapy enhances the efficacy of IL-2 in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice.</a> Cancer Immunol. Immunother. 59, 1357-1365 (2010).</li>
<li>Shanker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+metastatic+solid+tumors+with+bortezomib+and+a+tumor+necrosis+factor-related+apoptosis-inducing+ligand+receptor+agonist+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Treating metastatic solid tumors with bortezomib and a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonist antibody.</a> J. Natl. Cancer Inst. 100, 649-662 (2008).</li>
<li>VanOosten, R. L., Griffith, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+tumor-specific+CD8%2B+T+Cells+after+intratumoral+Ad5-TRAIL%2FCpG+oligodeoxynucleotide+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of tumor-specific CD8+ T Cells after intratumoral Ad5-TRAIL/CpG oligodeoxynucleotide combination therapy.</a> Cancer Res. 67, 11980-11990 (2007).</li>
<li>Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+models+of+cancer+for+preclinical+drug+evaluation%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages.</a> Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).</li>
<li>Devaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+in+different+anatomical+sites+can+sculpt+and+vary+the+tumor+microenvironment+to+affect+responses+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy.</a> Mol. Ther. 22, 18-27 (2014).</li>
<li>Devaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+potency+of+regulatory+T+cell-mediated+immunosuppression+in+kidney+tumors+compared+to+subcutaneous+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Differential potency of regulatory T cell-mediated immunosuppression in kidney tumors compared to subcutaneous tumors.</a> Oncoimmunology. 3, 963395(2014).</li>
<li>Devaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk+between+tumors+can+affect+responses+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Cross-talk between tumors can affect responses to therapy.</a> Oncoimmunology. 4, 975572(2015).</li>
<li>Norian, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+metastatic+renal+cell+carcinoma+after+adenovirus-encoded+TNF-related+apoptosis-inducing+ligand+%28TRAIL%29%2FCpG+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Eradication of metastatic renal cell carcinoma after adenovirus-encoded TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/CpG immunotherapy.</a> PLoS One. 7, 31085(2012).</li>
<li>Matin, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+response+to+renal+cryoablation+in+an+in+vivo+orthotopic+renal+cell+carcinoma+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Immunological response to renal cryoablation in an in vivo orthotopic renal cell carcinoma murine model.</a> J. Urol. 183, 333-338 (2010).</li>
<li>Wilber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+source+of+transposase+for+Sleeping+Beauty-mediated+gene+insertion+and+expression+in+somatic+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues.</a> Mol. Ther. 13, 625-630 (2006).</li>
<li>Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescent+imaging+of+mammary+tumors+using+IVIS+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+and+CTL+adoptive+transfer+immunotherapy+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+experimental+pulmonary+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of experimental pulmonary metastases.</a> J. Natl. Cancer Inst. 36, 641-645 (1966).</li>
<li>James, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG-mediated+modulation+of+MDSC+contributes+to+the+efficacy+of+Ad5-TRAIL+therapy+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">CpG-mediated modulation of MDSC contributes to the efficacy of Ad5-TRAIL therapy against renal cell carcinoma.</a> Cancer Immunol. Immunother. 63, 1213-1227 (2014).</li>
<li>James, B. R., Brincks, E. L., Kucaba, T. A., Boon, L., Griffith, T. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24711083">Effective TRAIL-based immunotherapy requires both plasmacytoid and CD8a DC.</a> Cancer Immunol. Immunother. 63, 685-697 (2014).</li>
<li>James, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+alters+dendritic+cell+function+in+the+presence+and+absence+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity alters dendritic cell function in the presence and absence of tumor growth.</a> J. Immunol. 189, 1311-1321 (2012).</li>
<li>Brincks, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triptolide+enhances+the+tumoricidal+activity+of+TRAIL+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Triptolide enhances the tumoricidal activity of TRAIL against renal cell carcinoma.</a> FEBS J. 282, 4747-4765 (2015).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+intravascular+staining+redefines+lung+CD8+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses.</a> J. Immunol. 189, 2702-2706 (2012).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nat. Protocols. 9, 209-222 (2014).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

우리는 동소 RCC의 마우스 모델을위한 프로토콜을 제시한다. 마우스 신장에 마우스 신장 선암 종양 세포의 주입은 mRCC의 임상 관련 모델을 제공합니다. 이 모델은 고급 RCC의 특징입니다 둘 다 폐의 신장과 원격 전이가 내 차 종양 발생합니다. 본 명세서의 설명은 면역을 Balb / c 마우스에서 Renca 세포주에 특이. 이 동소 모델을 사용하여, 우리는 치료 시험 17, 24, 25, 26, 27이 모델의 유용성을 입증의 Renca 종양이 면역 요법에 반응하는 것으로 나타났습니다. 이식을위한 동계 종양 세포 라인을 사용할 수있는 기능은 면역 학적 손상 동물에서 종양의 진행을 공부의 이점을 제공한다. 동계, 동소, 임상 관련 chara...

신장 세포 암 (RCC)는 전 세계 모든 성인 악성 종양의 악성 신장 종양의 대부분 및 약 3 % 1, 2를 차지한다. 증상의 부족, 오진 및 RCC에 대한 불충분 한 심사 도구로 인해, 환자의 약 30 %는 전이성 2 단계로 진행 환자의 추가 20 ~ 30 %로, 진단시 전이성 신 세포 암 (mRCC)와 함께 발표 할 예정이다. 이러한 경우 매년 ~ 13,500 사망 1, 3 초래한다. 이전 탐지 및 기본 RCC의 치료가 향상되었습니다 있지만, RCC 관련 사망률은 전이성 질환 사망률 3 크게 책임이 있다고 제안 증가하고 있습니다. RCC에 대한 치료의 개발은 발견과 표적으로 한 치료와 면역 요법의 구현 지난 10 년 동안 진행하고있다. 불행하게도, 무 진행 surviv 중알 및 고급의 경우 전체 생존 기간은 여전히 환자 4, 5, 6의 대부분 잘 아래 이년 있습니다. 이 통계는 더욱 식별에 대한 연구와 RCC에 대한 효과적인 치료법의 개발에 대한 필요성을 보증합니다. 적절하게 mRCC에 대한 치료 적 개입을 사전에 질병의 병진으로 관련 전 임상 모델이 먼저 필요하다. 적절하고 일관성있는 모델의 개발은 몇 가지 주요 질문 해결해야 고급 RCC의 인간 조건을 요점을 되풀이하기 : 1) 모델은 해부학 적으로 관련을; 2) 인간의 병리 유사하게 종양의 진행을합니까; 3) 전이는 원발 종양에서 발생합니까; 4) 기본 및 전이성 종양 진행 시간이 지남에 모니터링 할 수 있습니까? 치료의 종류에 따라, 마우스 RCC 종양 세포주 RCC 인간 종양 세포주 및 인간 RCC 환자 유래 xenog 조사되고보트는 면역 또는 면역 결핍 마우스에서 사용될 수있다. 온전한 기능적 면역 체계를 가진 호스트의 Balb / c 마우스 (7)의 자발 신장 선암 유래의 잘 설명 Renca 세포주의 사용을 필요로, 면역 요법의 일부 측면을 평가 이러한 연구에 필요하다. 대부분의 연구는 실험 폐 &quot;전이&quot;8, 9, 10, 11, 12을 생성 (IV)을 Balb / c 마우스에 정맥 쉬운 측정 로컬 종양을 형성하거나 Renca 세포를 피하 (SC)을 주입. 인간의 RCC 모델에 SC-이식 Renca 종양의 사용은 혈관 (13)의 부정확 한 신경 분포를 포함하여 많은 제한을 가지고, 미세 14, 15, 및 기관의 부족 / 종양 세포 COMMUNIC의 차이ATION 13, 16. 또한, 많은 사우스 캐롤라이나 종양 (특히 Renca)은 일반적인 임상 특성 17 이벤트의 연구를 억제, 말초 장기로 전이되지 않습니다. mRCC을 연구하기 위해, Renca 세포는 RCC 환자에서 전이의 폐 - 기본 위치에 종양 부담을 수립 IV 주입 할 수있다. 전이성 종양을 시작의 정맥 주입 방법은, 그러나,의 조사를 허용하지 않는 방법,시기, 또는 세포가 먼 사이트에 주요 기관 (즉, 신장)에서 마이그레이션 이유. 같은 동물에서 분명 기본 및 전이성 질환을 가진 모델은 특히 전이는 일반적으로 이러한 환자에서 사망률의 원인 점을 감안, 고급 질병의 진행 및 치료를 연구하는 것이 중요하다. 우리 연구실은 위에서 설명한 모든 기능을 통합 mRCC의 쥐 모델을 개발했다. 홍보를 설정하려면imary, 동소 종양, Renca 세포 투광성 복막을 통해 동물의 신장에 직접 주입된다. 왼쪽 측면에 작은 절개 (랜드 마크 등) 비장과 좌측 신장의 시각화를 허용. 작은 게이지 바늘을 사용 Renca 종양 세포 주입 동소 복막을 통해 신장에 직접 주입된다. 신장 캡슐 18 이하 Renca 세포를 주입하는 다른 방법에 비해, 이식이 방법은, 봉합을 필요로하지 않고, 비교적 비 침습적 인 저 통증 클래스이고, 시간이 효율적으로 더 높은 처리량을 허용 연습. 폐에 주입 된 신장에서 재현 차 종양 부담 (~ 99 % 포획 비율)뿐만 아니라 전이성 종양 부하이 잘 특성화 모델 결과. 이 모델의 중요한 장점은 면역 조사를 허용, 자사의 동계 특성을 포함한다; 의 자발적인 전이는 공부하기dvanced 질환; 그 동소 이식은 질병의 진행 및 치료에 대한 해부학 적 영향을 모델링합니다. RCC를 대상으로하기위한 치료는 크게 임상 개발하는 동안이 모델의 이용 혜택을 누릴 것입니다.

<table><tbody><tr><td>인공 눈물 안과 연고</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond 조직 접착제</td><td>3M</td><td>CBGBIW011019</td><td></td></tr><tr><td>Betadine 용액 (포비돈 - 요오드, 5 %)</td> <td>Purdue Products, L.P.</td><td>NDC 67618-155-32</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 마르카인(부피바빈 HCl 주사)</td><td>호스피라</td><td>0409-1587-50&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Sunbeam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Venture</td><td>908291</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>NDC 57319-609-02</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp;</td><td>아콘</td><td>NDC 59399-111</td><td></td></tr><tr><td>행크 s Balanced</td><td>Salts Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>IVIS</td><td>캘리퍼스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, 칼륨 염</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>India Ink</td><td>Chartpak Inc</td><td>44201</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>겸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 트랜스포존 시스템</td><td>Neuromics</td><td></td><td></td>SBT0200</tr><tr><td>렌카</td><td>ATCC</td><td>CRL-2947</td><td></td></tr></tbody></table>

전임상 치료의 양적 및 종 방향 평가를위한 동계 마우스 모델 전이성의 신장 세포 암

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

신장 세포 암 (RCC)는 매년 미국&gt; 60,000명 영향을 미치며, ~ RCC 환자의 30 %는 진단 당시 여러 전이 있습니다. 전이성 신 세포 암 (mRCC)는 단지 18 개월 평균 생존 시간, 불치이다. 면역 기반 중재 (예를 들면, 인터페론 (IFN) 및 인터루킨 (IL) -2) mRCC 환자의 일부에서 영구 응답 및 multikinase 억제제 (예 sunitinib에 또는 sorafenib)을 유도 또는 항 VEGF 수용체 모노클로 날 항체 (항체)이다 대부분 완전 관해가 드문, 완화. mRCC 환자의 현재 치료에서 이러한 단점은 새로운 치료 프로토콜의 개발을위한 이론적 근거를 제공한다. mRCC위한 새로운 치료법의 임상 시험에서의 핵심 요소는 적절한 동물 모델이다. 인간의 조건을 요점을 되풀이 유익한 기능은 치료 중심의 면역 effecto을 조사하기 위해 차 신장 종양, 신장 종양 전이 및 손상 면역 시스템을 포함R 반응 및 종양 - 유도 된 면역 인자의 형성. 이 보고서는 이러한 모든 기능이있는 소성을 mRCC 마우스 모델을 설명합니다. 우리는 종양 신장 (주 사이트)의 성장과 폐 (전이성 사이트)의 평가 다음에 마우스 신장 선암 세포주 Renca를 사용하여 신장 내 주입 기술을 설명합니다.

<html> Renca 세포의 성공적인 이식은 쥐의 폐에 신장과 전이 종양 개발에 발생합니다. 종양 베어링과 반대측 신장 적출 후, 웨트 티슈의 무게 (g)의 중량 증가 (도 1)에 기초하여 종양 부담을 입증 측정 하였다. Renca 사이토 케라틴 종양은 8, 18 염색법 (도 2)를 통해 면역에 의해 식별 될 수있다. 길이 연구, 루시퍼 라제 발현 Renca 세포주를 이식 하였다. 생물 발광 이미징 종양 부담과 시간 (도 3A) 위에 요법에 대한 응답을 추적하는 생체 내 이미징 시스템 (IVIS)를 사용하여 수행 하였다. 폐에 전이는 생물 발광 영상 (그림 3B)과 인도 잉크 폐 인플레이션 (그림 3C)에 의해 확인되었다. <p class="jove_content" fo:keep-together....

면역 적격 마우스에서 신 세포 암의 동소 모델의 구현은 연구자에게 동일한 동물의 신장 차 종양 및 폐 전이의 존재에 의해 정의 된 임상 관련 시스템을 제공한다. 이 시스템은 전임상 생체 내에서 다양한 트리트먼트를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

이 프로시저의 전체적인 목표는 종양 세포의 신장 내 이식을 통해 마우스 정위성 신장 종양을 형성함으로써, 종양의 성장 및 전이와 항종양 치료의 효능을 연구하는 것입니다. 이 방법은 신장암 전임상 모델에서 새로운 치료법이 얼마나 효과적인지와 같이 비뇨기 종양학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신장 내 종양 이식을 통해 임상적 신세포암의 병태생리를 모방한 폐 전이성 일차 신장 종양을 형성할 수 있다는 점입니다.Renca 종양 세포를 준비하려면, 먼저 PBS로 세척한 후 0.25% Trypsin과 HBSS를 사용하여 세포 배양물을 분리합니다. 5분 후 Complete RPMI Medium으로 반응을 중화시킵니다. 세포를 원심 분리용 원추형 튜브로 옮긴 후, 펠릿을 신선한 HBSS에 재현탁합니다.세포 수를 센 후, HBSS를 사용하여 세포 농도를 2 × 10⁶ cells/mL로 조정하고, 18게이지 바늘이 장착된 1 mL 주사기로 세포를 흡입합니다. 다음으로, 가열 패드 위에 멸균 수술용 드레이프를 덮고 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 적절한 진정 수준을 확인합니다. 마우스의 왼쪽 옆구리 털을 제거하고 눈에 수의학용 연고를 도포합니다.그런 다음 이식 부위를 5% 포비돈 요오드 소독제로 닦아내고, 멸균 메스로 왼쪽 옆구리에 1~1.5 cm 길이의 단일 절개를 가하되 복막을 뚫지 않도록 주의합니다. 가위를 사용하여 진피를 복막에서 분리하고, 멸균 면 거즈로 절개 부위를 가볍게 눌러 혈액을 제거합니다. 그런 다음 왼손으로 머리를 잡고 오른손으로 옆구리를 지지하여 복막을 통해 비장을 찾습니다.오른손 손가락 하나를 사용하여 마우스의 하단을 촉진합니다. 그러면 신장이 확인될 것입니다. 복막과 신장에 텐션이 가해지도록 동물을 단단히 잡은 상태에서, 보조자가 0.1 milliliters의 Renca 세포를 손상되지 않은 복막을 통해 신장 중앙으로 천천히 주입하도록 합니다.세포의 역류를 줄이기 위해 바늘을 5~10초 동안 그대로 유지하십시오. 그 다음, 시아노아크릴레이트 조직 접착제를 얇게 도포하여 절개 부위를 폐쇄합니다. 실험 종료 시점에 가위를 사용하여 복부 중앙부터 늑골, 목, 침샘까지 이어지는 정중선 절개를 수행하십시오.가위와 포셉을 사용하여 폐 조직이 손상되지 않도록 주의하며 갈비뼈를 제거하고, 결합 조직을 제거하여 기관을 노출시킵니다. 18 gauge 바늘이 장착된 3 mL 시린지에 10% India Ink와 PBS를 채웁니다. 그런 다음 포셉을 사용하여 실크 봉합사를 기관 아래로 조심스럽게 통과시킨 후 느슨하게 매듭을 짓습니다.다음으로, 바늘을 기관에 조심스럽게 삽입하고 1~1.5 mL의 인디아 잉크(India Ink) 용액을 이용해 폐를 천천히 팽창시킵니다. 잉크의 역류를 막기 위해 기관 주위의 매듭을 단단히 조인 후, 바늘을 제거하고 결합 조직을 조심스럽게 절단하여 팽창된 폐를 적출합니다. 실온의 화학 흄 후드 내에서 5 mL의 Fekete 용액이 담긴 15 mL 원추형 튜브에 폐를 고정합니다.24~48시간 후, 염색 제거가 완료된 온전한 폐를 꺼내어 35 x 10 mm 페트리 접시에서 엽을 조심스럽게 분리합니다. 그다음 해부 현미경 하에서 흰색 종양 결절의 수를 측정합니다. 마우스 신장 내 Renca 세포 이식이 성공하면 신장에 종양이 발생하고 폐로 전이되며, 종양이 형성된 동물은 종양이 이식된 신장의 무게 증가로 측정되는 강력한 종양 부담을 나타냅니다.관찰된 바와 같이, Renca 종양은 Cytokeratin 8 및 18에 대한 면역조직화학 염색을 통해 식별할 수 있습니다. 루시페라아제를 발현하는 Renca 세포주를 이식하면 생물 발광 이미징을 통해 신장의 종양 부담과 폐로의 전이를 추적할 수 있으며, 이는 인도 잉크 폐 팽창법으로 추가 확인되었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 마리당 5분 이내에 완료할 수 있습니다.이 실험 절차를 수행할 때는 정확한 신장 내 종양 이식을 위해 복막을 통해 신장을 명확하게 식별하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 새로운 약물이 신장 내 종양의 성장이나 전이에 어느 정도 영향을 미치는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 전임상 약물 테스트와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 마우스에서 정위성 신장 종양을 형성하기 위한 신장 내 종양 세포 이식 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.살아있는 동물 및 수술 기구를 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 기관의 동물 취급 지침을 준수하고 수술 구역과 기구의 멸균 상태를 유지하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 유념하십시오.

a-syngeneic-mouse-model-metastatic-renal-cell-carcinoma-for

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는 신세포암의 정소성 마우스 모델을 개발합니다. 이 모델은 주입된 신장에서 재현 가능한 원발성 종양과 폐에서 전이성 종양을 생성하여 질병 진행 및 치료를 평가할 수 있습니다.

신세포암 모델 생성: 암세포의 신장 내 이식에 의한 정소성 RCC 쥐 모델을 개발하기 위한 프로토콜

인간의 전립선 암이 동 소성 모델에 폐 종양 세포와 구별 전이의 형성을 순환, 종양 크기의 정량을 허용한다. 세포가 일차 장기 탈출해야 같이, 혈류를 입력하고, 보조 사이트에 이식,이 모델은 인간에서 효과적으로 시나리오 되풀이되었습니다.

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

자발 전이성 신장 세포 암종 (RCC) 질병 진행의 모델은 관련 임상 설정에서 치료를 평가하는 데 사용될 수있다. 이 프로토콜은 동소 신장 종양 세포 주입, 적절한 절제를위한 다른 절차를 설명하고, 마지막으로 전이성 부담 및 현지화의 시각 및 생물 발광 점수에 대한 부검 가이드를 간략하게 설명합니다.

마우스의 자발적인 전이성 신장 세포 암 (mRCC)를 모델링에 따라 신장 절제술

간 전이 전임상, 뮤린 모델 hemispleen 주입 기법을 통해 수행 하였다.

간 전이의 전임상 쥐과 모델

암의 전이 확산 암 관련 사망의 주요 원인이다. 우리는 고형 장기의 종양에서 전이의 메커니즘을 연구하기위한 "환자와 같은"동 소성 동계 마우스 모델 시스템 구축을위한 우리의 생존 수술 방법에 대한 심층적 인 설명을 제공한다.

&quot;환자와 같은&quot;동소 이식 동계 마우스 모델 간세포 암의 전이

이 프로토콜은 암컷 C57BL / 6J 마우스의 종양 성장을 모니터링 뮤린 동소 방광 종양의 발생을 설명한다.

쥐 동소 이식 방광 종양 모델 및 종양 탐지 시스템

전이성 맑은 세포 신장 세포 암은 철저한 전임상 조사를 위한 포괄적인 동물 모델이 없는 질병이다. 이 프로토콜은 질병에 대한 두 가지 새로운 동물 모델을 보여줍니다: 정형 이식 마우스 모델과 닭 융모난토막 모델, 둘 다 임상 사례를 닮은 폐 전이를 보여줍니다.

마우스 신장과 닭 융모알란투암 막에 설립된 전이성 맑은 세포 신장 세포 암종 모델 비교

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

이것은 암 전이의 억제제 또는 드라이버를 위해 검열하는 효과적인 방법입니다. 발현 라이브러리로 변환된 세포는 전이성 콜로니를 형성하기 위해 닭 초리오알란토아막 혈관에 주입됩니다. 감소 또는 증가 된 침략을 갖는 식민지는 절제, 확장, 자신의 표현형을 확인하기 위해 재주입, 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 분석.

신속하고 정량적인 병아리 Chorioallantoic 멤브레인 모델을 사용하여 전이성 레귤레이터의 발견

이 기사는 흑색종 전이의 새로운 후보 매개체와 그 작용 메커니즘을 테스트하는 데 사용되는 기술의 워크 플로우에 대해 설명합니다.

흑색종 전이의 새로운 중재자 식별을 위한 강력한 발견 플랫폼

폐암에 대한 새로운 치료법 개발의 주요 과제에는 국소 질환이 전이성 질환으로 진행됨에 따라 종양 미세 환경을 모델링하는 것이 포함됩니다. 여기에서는 시간이 지남에 따라 질병의 생체 내 추적을 가능하게 하는 폐암의 동소 동계 모델을 확립하는 간단한 방법을 설명합니다.

폐암의 동계 동소 마우스 모델을 생성하기 위한 최소 침습적 방법

학습하세요 면역능력이 있는 마우스에서 신세포암의 정위 모델을 수립하여 종양 성장과 전이를 연구하는 방법을. Renca 세포를 신장 내 이식하여 임상과 유사한 폐 전이를 유도하고 전임상 치료 효능을 평가합니다.

전임상 치료의 양적 및 종 방향 평가를위한 동계 마우스 모델 전이성의 신장 세포 암

더 많은 동영상 탐색