중립 모세관을 사용하여 단일 클론 항체 동종의 모세관 전기 영동 분리

오늘날 모세관 세포 전기영동 기술은 단클론 항체와 같은 생체 분자 분석을 위한 가장 분해능이 높고 민감한 방법 중 하나입니다. 하지만 이 기술의 성공적인 구현은 시료 및 시스템 준비 과정의 핵심 단계에서 분석가의 지식과 숙련도에 달려 있습니다. 본 튜토리얼의 목적은 성공적인 분석 수행 방법을 안내하는 것이며, 용액 및 시료 준비, 모세관 전기영동 시스템 준비, 기기 분석법 설정, 그리고 데이터 판독 및 처리 과정에 대해 상세히 설명합니다.

전반적으로 이 프로토콜은 분석 화학 실험실 준비에 참여하는 인원의 기술 개발 및 향상에 활용될 수 있습니다. 100 mL에서 최종 농도가 0.05%가 되도록 HPMC의 양을 칭량합니다. HPMC는 기본적인 탄성 폴리머이므로, 첫 번째 단계로 분말을 유리 비커에 붓고 80 mL의 물을 천천히 가하여 분말을 분산시킵니다.

그런 다음, 분말 잔여물을 제거하기 위해 적심 트레이를 물로 헹굽니다. 나머지 시약들을 평소와 같이 첨가하고 용액을 교반합니다. 50% 아세트산을 사용하여 pH 값을 4.8로 조절합니다.

용액을 5분 동안 안정화합니다. 그 후, 필요에 따라 pH를 조정합니다. 최종 부피가 100 milliliters가 되도록 증류수를 추가합니다.

준비된 BG 용액을 중성 막으로 여과한 후 유리병에 붓습니다. 마지막으로 유리병에 적절한 라벨을 붙이고 냉장 보관합니다. 샘플을 준비하기 위해 첫 번째 단계로 1.5 milliliter 튜브에 trace buffer 용액 162 microliters를 넣습니다.

그 다음, 10 mg/mL 농도로 미리 준비한 MAP 샘플 18 µL를 첨가합니다. 세 번째 단계로, 최종 샘플 부피가 200 µL가 되도록 미리 준비한 1% 히스타민 용액 20 µL를 첨가합니다. 다음 단계로, 샘플을 5초 동안 준비합니다.

5초 동안 원심 분리합니다. 샘플의 전체 부피를 흡입합니다. 그리고 기포가 생기지 않도록 마이크로 바이알의 위쪽 방향으로 분주합니다.

마지막으로, 바이알의 캡을 닫고 냉장 보관하십시오. 전원 스위치를 눌러 CE 기기의 전원을 끕니다. 그리고 앞문을 엽니다.

인터페이스 블록 아래에 새 이동식 와이프를 배치합니다. 세척병을 사용하여 인터페이스 블록을 통해 전극을 물로 헹굽니다. 구멍을 통해 물이 떨어지게 한 후 인터페이스 블록을 완전히 건조시킵니다.

와이프를 사용하여 전극의 과잉수를 조심스럽게 제거하십시오. 이 과정 동안 전극에 닿지 않도록 주의하십시오. 시료 유지 시스템에서 와이프를 제거하십시오.

새로운 물에 적신 보풀 없는 와이프로 샘플 트레이의 표면을 닦아냅니다. 버퍼 트레이의 표면도 동일하게 닦아줍니다. 버퍼 트레이를 위로 밀어 올리고, 샘플 유지 시스템을 들어 올린 후 와이프를 사용하여 해당 표면을 닦아냅니다.

버퍼 트레이를 원래 위치로 다시 옮깁니다. 그 후, 인터페이스 블록을 철저히 세척하십시오. 클램프 바와 UV 램프 하우징을 세척하십시오.

마지막으로, 사용 전에 반드시 시스템을 테스트하십시오. 세척병을 사용하여 개폐 레버를 물로 헹굽니다. 먼지와 축적된 염분을 제거하기 위해 새로운 보풀 없는 와이프로 표면을 철저히 닦아내십시오.

마지막으로 설치 전 반드시 테스트를 수행하십시오. 물을 적신 극세사 천으로 광섬유 케이블의 양 끝단을 닦아내고, 양 끝단 사이의 라이트 포드를 확인하십시오. 패키지에서 새로운 중성 모세관을 꺼내십시오.

이제 모세관 보호 튜브의 한쪽 끝을 작업대에 놓습니다. 플라스틱 튜브를 풀어서 곧게 펴고, 모세관을 튜브에서 조심스럽게 꺼냅니다. 다음과 같은 측정 표시가 된 종이 한 장을 작업대에 붙입니다.

모세관 윈도우를 다음과 같이 센티미터 측정 표시의 영점에 맞춥니다. 그 후, 테이프를 사용하여 모세관 끝부분을 작업대에 고정합니다. 측정 표시에서 바깥쪽으로 2 mm 떨어진 지점에 모세관 끝부분을 표시합니다. 윈도우에서 가장 멀리 떨어진 모세관 끝의 보호 캡을 자릅니다.

그리고 모세관의 내부 코팅이 영구적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 모세관 끝부분을 물이 채워진 CE 바이알에 담그십시오. 바이알에서 모세관을 꺼내어 이 끝부분을 카트리지의 배출구 쪽에 조심스럽게 삽입하십시오. 모세관이 반대편에 나타나면, 다음과 같이 모세관 창이 카트리지 창의 중앙에 올 때까지 필요한 만큼 끌어당기십시오.

그 다음, 카트리지를 돌려 조리개 플러그를 카트리지 창에 삽입하고, 딸깍 소리가 날 때까지 눌러 고정합니다. 이 과정에서 모세관 창이 파손되지 않도록 주의하십시오. 넓은 광원에 노출시켰을 때 빛이 창을 통해 통과하는지 확인합니다.

페룰과 O-링이 미리 설치된 냉각수 튜브에 모세관을 삽입합니다. 모세관이 반대편으로 나올 때까지 튜브를 통해 밀어 넣습니다. 그다음, 카트리지의 배출측에 튜브 끝을 삽입하고 튜브 너트를 조입니다.

모세관의 입구 쪽 끝을 카트리지의 입구 측에 삽입하십시오. 모세관이 반대편에 나타나면 필요에 따라 당겨 조절합니다. 그 다음, 튜빙의 끝을 카트리지의 입구 측에 삽입하고 튜빙 너트를 조여 고정하십시오.

창에서 가장 가까운 모세관 끝부분의 보호 캡을 절단하십시오. 그리고 다음과 같이 딸깍 소리가 나도록 눌러서 모세관 끝부분에 셀 고정 클립을 설치하십시오. 모세관 연장 플레이트의 기준선 아래에서 모세관 끝부분을 절단하십시오.

돋보기로 모세관 끝부분을 반드시 점검하십시오. 모세관 끝이 매끄럽지 않은 경우, 클리븐 스톤(cleven stone)을 사용하여 연마하십시오. 조리개 오링을 조리개 파란색 구멍에 넣으십시오.

그리고 o-ring 삽입 도구를 사용하여 조심스럽게 삽입하십시오. 마지막으로, 물이 채워진 CE vial을 카트리지 케이스에 장착하고, 모세관 끝이 vial에 삽입된 상태로 즉시 카트리지를 케이스에 넣은 후 냉장 보관하십시오. 피펫 볼륨을 조정하십시오.

트레이 좌표 A1, B1, F6의 버퍼 유입구(buffer inlet)에 적정량의 물을 넣습니다. 또한, 버퍼 유출구(buffer outlet) 트레이 좌표 A1, B1, C1, E6 및 F6에도 물을 넣습니다. 버퍼 유입구 트레이 좌표 C1과 E6에는 0.1 normal HCl을 넣습니다. 버퍼 유입구 트레이 좌표 D1과 E6, 그리고 버퍼 유출구 트레이 좌표 D1에는 BGE를 넣습니다. 마지막으로 버퍼 유입구 및 유출구 트레이의 모든 CE 바이알 캡을 닫습니다. 작업 중 탄소 누출을 방지하기 위해 바이알 캡이 젖지 않도록 주의하십시오. CE 장비의 앞문을 엽니다.

먼저, UV 검출기를 설치하고 나사를 시계 방향으로 돌려 고정합니다. 내부 도어를 올리고, 인터페이스 블록에 오프닝 레버를 위로 눌러 설치합니다. 광섬유 케이블을 클램퍼에 삽입하고 시계 방향으로 돌립니다.

그리고 반대쪽 끝을 검출기에 연결하십시오. 광섬유 케이블은 굽힐 경우 파손될 수 있으므로 주의해서 다루십시오. 시료 트레이를 시료 홀딩 시스템에 넣고 딸깍 소리가 나도록 고정하십시오.

동일한 절차에 따라 버퍼 트레이를 샘플 홀딩 시스템에 넣습니다. 클램프 바를 들어 올리고 모세관 카트리지를 인터페이스 블록에 장착합니다. 클램프 바의 양 끝을 누르고 노브를 시계 방향으로 돌려 조입니다.

내부 도어를 닫고 전면 도어를 닫으십시오. 마지막으로 전원 스위치를 눌러 CE 장비를 켭니다. 장비 컨디셔닝 방법을 생성하십시오.

전압, 카트리지, 샘플 보관 온도 및 트리거 설정을 포함하여 초기 조건 탭에서 파라미터를 구성하십시오. 획득 파장으로 2014를 선택하십시오. 시간 프로그램 셀에 파라미터를 설정하여 기기가 수행할 동작을 지정하십시오.

각 세척, 주입 및 분리 단계에 대한 세부 설정을 포함하십시오. 이 절차를 수행하여 컨디셔닝 실행 및 기기 종료 방법을 생성하십시오. 다음 단계는 새로운 시퀀스를 생성하는 것입니다.

컨디셔닝 방법을 사용하여 모세관 컨디셔닝을 프로그래밍하십시오. 모세관을 처음 사용하는 경우 4회 반복하도록 프로그래밍하고, 그렇지 않은 경우에는 2회 반복하도록 프로그래밍하십시오.

그 다음, 분석할 시료를 분석법(running method)에 따라 설정하십시오. 마지막으로, 종료법(shut down method)을 사용하여 모세관을 보관 상태로 설정하십시오. 모세관 세포 전기영동 분석은 30분 이내에 완료됩니다.

첫 번째 결과는 시스템 성능의 적절성을 측정하는 지표로서 히스타민 내부 표준물질에 해당합니다. 이어 평가 대상인 단클론 항체의 염기성, 주성분 및 산성 이소형들이 뚜렷하게 나타납니다. 전체 분리 과정은 약 30 µA의 일정 전류 하에서 진행됩니다.

실험을 수행한 후, grab 소프트웨어에서 원시 데이터를 내보내고 empower 소프트웨어를 통해 가져와 처리합니다. 각 아이소폼의 백분율 함량은 전기영동도 프로파일의 수직 드롭라인 적분을 통해 얻습니다. 여기에서는 모세관 세포 전기영동으로 생성된 단클론 활성 분석을 수행하기 위한 상세한 단계별 가이드를 제시하였습니다.

잠재적인 문제를 완화하기 위한 여러 권장 사항과 더불어, 본 프로토콜은 전도도 및 pH 매개변수를 간단히 수정함으로써 다른 단백질 분석에 쉽게 맞춤화할 수 있다는 장점이 있습니다.