Name: 중립 모세관을 사용하여 단일 클론 항체 동종의 모세관 전기 영동 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 배우세요 중성 모세관 전기영동을 이용한 단일 클론 항체 동종이성 분석 방법입니다. HPMC 용액 준비부터 시료 처리, 계측기 설정 및 데이터 처리까지 상세한 실험 프로토콜을 통해 분석 화학 실험실 인력의 기술 향상에 도움을 드립니다.

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저자는 이 자습서에 대해 다음 출판물의 개념을 사용할 수 있는 권한을 부여한 Wiley에게 감사드립니다. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: 모세관 영역 전기영동에 의한 재조합 단클론 항체 분석. 전기영동. 2013. 34. 1133-1140. 저작권 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 이 작업은 멕시코 CONACyT의 보조금 230551의 지원을 받았습니다.

솔루션 1. 준비 <ol><li> BGE 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 0.05 %로 이루어지는 용액 100㎖를 제조 하였다 (m / v)의 하이드 록시 프로필 메틸 셀룰로오스 (HPMC), 200 mM의 ε-N - 아미노 카프로 산 (EACA)와 30mm의 리튬 아세테이트. 주 : HPMC는 점탄성 폴리머이기 때문에, 유리 비이커에 분말을 부어 물 80 mL를 첨가하고 마지막으로 교반 막대를 추가한다. 일반적으로 남아있는 시약을 계속 추가합니다. 그것은 눈 자극을 일으킬 수있는 리튬 아세테이트를 취급 할 때는 보안경을 착용한다. </li><li> 50 % (v / v)로 아세트산으로 4.8 ± 0.1의 pH 값으로 조정한다. 용액을 5 분 동안 안정하고 필요에 따라 조정할 수 있습니다. </li><li> 메스 플라스크에 100 ㎖의 최종 부피를 만들기 위해 물을 추가합니다. </li><li> 0.2 ㎛의 세공 크기를 갖는 친수성 막을 통과 필터. </li><li> 최대 7 일 동안 2-8 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 내부 표준을 준비합니다. <ol><li> 1 mL의 준비1 % (m / v)로 히스타민 이루어지는 용액. </li><li> 0.2 ㎛의 세공 크기를 갖는 친수성 막을 통과 필터. </li><li> 최대 1 일 동안 2-8 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 샘플 준비 <ol><li> 1 mg / ml의 최종 농도로 트리스 완충액 (50 mM의 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄, pH를 8.0)으로 희석 된 단클론 항체의 샘플을 180 μL를 준비한다. </li><li> 1 % (m / v)의 히스타민의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 혼합하고 5 초 동안 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 보편적 인 유리 병 내부에 마이크로 병을 놓습니다. </li><li> 마이크로 바이알에 샘플을 전송하고 보편적 인 유리 병 캡. 기포를 도입하는 것을 방지하기 위해 위쪽으로 시료를 분배. </li><li> 최대 1 일 동안 2-8 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 샘플 입구 트레이 (시료 용액을 포함하는 마이크로 바이알)와 보편적 인 병을 놓습니다. </li></ol> CE 시스템 3. 준비. <ol><li> CE 시스템 청소. 참고 : 실시 일먼지 나 이물질이 축적 유래의 전류 누설을 방지하기 위해 적어도 일주일 절차이다. 그러나, 용도에 따라 (예를 들면, 점도가 증가 또는 높은 염 농도 증가 점도 시료와 BGE 사용) 전극 및 개방 레버 교차 오염 샘플 캐리 오버를 방지하기 위해 더 자주 세정 될 필요로 할 수있다. <ol><li> 은 CE 기기의 전원 스위치를 끄고 전면 도어를 엽니 다. </li><li> 물에 적신 부직포 와이프와 함께, 샘플 유지 시스템 (샘플 버퍼 트레이), 카트리지 커버, 클램프 바, 인터페이스 블록과 전극을 샘플 커버의 표면을 청소합니다. 과 절차를 반복 에탄올을 묻혀 닦아 사용하기 전에 건조. </li><li> 철저하게 물을 개방 레버를 씻어. 부직포 닦아 자신의 표면을 청소합니다. 과 절차를 반복 에탄올을 묻혀 닦아 설치하기 전에 건조. </li><li> 주의 광섬유 케이블의 양단 청소물에 적신 마이크로 화이버 천으로 사라져. 에탄올에 적신 천으로 절차를 반복합니다. </li></ol></li><li> 카트리지 어셈블리. <ol><li> 패키지에서 새로운 중립 모세관 (50 μm의 내경)를 제거합니다. </li><li> 테이프 워크 벤치에 모세관 보호 튜브의 한쪽 끝을 아래로. , 풀다 똑바로 튜브에서 모세관을 당기십시오. </li><li> 워크 벤치에 테이프 나 종이 스틱 다음과 같이 측정 마크를 추가 길이 검출기 (30cm), 출구 단부에 모세관 창 (0.2 cm) 길이 (10cm) (즉, 40.2 cm 전체 길이에, 30.0 cm 유효 길이). </li><li> 참조 논문에서 0.2 cm 측정 마크 모세관 창을 맞 춥니 다. 테이프로 모세관을 수정하고 모세관이 측정 마크 외부 2mm를 종료 표시합니다. </li><li> 클 리빙 돌의 평면 가장자리를 사용하여 하나의 직선 운동에 모세관 입구 끝 부분에있는 보호 캡 (창에서 최종 먼)를 잘라.<ol><li> 모세관 내부 코팅에 영구적 인 손상을 방지하기 위해 물이 가득 덮인 보편적 인 유리 병에 모세관 끝을 담가. 이 절차를 모세관 말단 이상 1 분 동안 대기에 노출 될 때마다 반복한다. </li></ol></li><li> 카트리지의 출구 측에 모세관 입구 끝을 삽입합니다. </li><li> 밀어 모세관 창 카트리지 창을 중심으로 될 때까지 필요에 따라 카트리지를 통해 모세관을 당기십시오. </li><li> 카트리지 창에 구멍 플러그 (100 μm의 X 200 μm의)를 삽입합니다. 주 : 빛의 화이트 소스에 노출되면 흰색 빛이 창을 통해 전달되었는지 확인합니다. 통과하는 광은 갈색 외관이 경우, 필요에 따라 조정한다. </li><li> (순서대로 양단에 사전 설치된 튜브 너트, 페룰 및 O 링 포함) 40.2 cm의 총 모세관 길이에 대한 미리 형성된 냉매 배관에 모세관을 삽입합니다. </li><li> coolan을 통해 모세 혈관을 눌러모세관이 관의 다른면에 나타날 때까지 필요한 t 튜브. </li><li> 카트리지의 출구 측에 냉각수 튜브의 끝을 삽입하고 튜브 너트를 조이십시오. </li><li> 카트리지의 입구 측에 모세관 입구 단부를 삽입한다. </li><li> 밀고 모세관 카트리지의 입구 측에 나타날 때까지 필요에 따라 카트리지를 통해 모세관을 당긴다. </li><li> 카트리지의 입구 측에 냉각수 튜브의 끝을 삽입하고 튜브 너트를 조이십시오. </li><li> 클 리빙 돌의 평면 가장자리를 사용하여 하나의 직선 운동에 모세관 출구 단부 (창에서 가까운 끝 부분)에서 보호 캡을 잘라. </li><li> 모세관 끝 부분을 통해 밀봉 고정 클립을 삽입하고 위치에 고정하는 키를 누릅니다. 시각적으로 모세관이 종료 검사합니다. 그들도없는 경우, 절차를 반복한다. </li><li> 워크 벤치의 가장자리에 모세관 길이 템플릿을 놓습니다. </li><li> AG를 아래로 향하게하여 카트리지를 배치모세관 길이 템플릿을 ainst과 모세관 템플릿의 참조 라인으로 끝 맞 춥니 다. 모세관 계측 마크 (3.2.4 참조) 기준선과 정렬되지 않는 경우, 필요에 따라 조정한다. </li><li> 모세관 길이, 모세관에 대해 템플릿을 잡고 템플릿 기준선 아래 절단 돌 2mm의 세척 에지 사용 모세관의 양쪽 끝을 절단. </li><li> 시각적으로 모세관은 돋보기로 끝나는 검사합니다. 모세관 말단이 평활하지 않은 경우, 클 리빙 스톤의 부드러운면을 사용하여 윤기. </li><li> O 링 삽입 도구를 사용하여 개구부 플러그 구멍에 개구 O 링을 삽입한다. </li><li> 유리 병에 삽입 모세관 끝 즉시 케이스에 카트리지 케이스와 장소 카트리지에 물이 가득 덮인 보편적 인 튜브를 설치합니다. 단기 및 장기 저장에 2-8 ℃에서 보관. </li></ol></li><li> 버퍼 트레이의 제조. <ol><li> 작성하고 출장 UNIVERS를 배치버퍼 입구에서 알 튜브 및 배출 트레이 (그림 1). 샘플 수에 따라 레인 2, 3, 4 및 5의 반복 바이알 위치가 매 6 샘플 주입 하나 차선 배치 분석한다. 주 : 누설 전류를 방지하기 위해 캡 바이알 습윤 피한다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> 그림 1 : 위치 및 버퍼 입구와 출구 트레이에 보편적 인 유리 병의 레벨을 입력합니다. 수준을 채우기 : 1/1 = 1400 μL, 3/4 = 1300 μL 1/2 = 1000 μL를. 요약 : W = 물, 염산은 0.1 M 염산. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="4"><li> CE 시스템 구성 요소 어셈블리. <ol><li> 자외선 검출기를 설치합니다. </li><li> 개방 레버를 설치인터페이스 블록에 최대 눌러. </li><li> 광섬유 케이블을 설치한다. 양쪽 끝을 잡고 시계 방향으로 회전 클램프 표시 줄에 해당 끝을 삽입합니다. 자외선 검출기 다른 쪽 끝을 연결합니다. 참고 : 그 파괴의 원인이 굴곡 때문에이 절차를 수행하는 동안주의 광섬유 케이블을 처리합니다. </li><li> 장소 샘플과 샘플 유지 시스템에 버퍼 트레이 및 위치에 걸립니다. </li><li> 양단의 클램프 바가하면서 손잡이를 조여, 상기 인터페이스 블록으로 모세관 카트리지 놓고. </li></ol></li></ol> 4. 악기 방법 셋업 <ol><li> 전압, 최대 : 다음 매개 변수를 표 1에있어서, 상기 조절을 만들고 실행 및 종료 악기 방법 30.0 kV의; 현재, 최대 : 300.0 μA; 카트리지 온도 : 20.0 ° C; 샘플 보관 온도 : 10.0 ° C; UV 검출기 초기 조건 : 파장 : 214 nm 인; 데이터 속도 : 4 Hz에서; 필터 : 일반; 피크 폭 () 포인트 : 16-25; 흡광도 신호 : 직접. 참고 : 데이터 수집 속도는 좁은 분리 영역의 커버리지를 향상시키기 위해서는 25 Hz로까지 증가시킬 수있다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8"> 컨디셔닝 방법 시간 프로그램 </td></tr><tr><td> 시간 (분) </td><td> 행사 </td><td> 값 </td><td> 지속 </td><td> 입구 유리 병 </td><td> 아울렛 유리 병 </td><td> 개요 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 1.0 분 </td><td> BI : C1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로 </td><td> 염산 0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 2.0 분 </td><td> BI : B1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로 </td> &lt;TD&gt; 물 </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 10.0 분 </td><td> BI : E1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td> 별도 - 전압 </td><td> 15.0 KV </td><td> 10.0 분 </td><td> BI : D1 </td><td> BO : D1 </td><td> 0.17 최소 램프, 정상 극성 </td><td> 갈라진 </td></tr><tr><td> 10.00 </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2758 밀리바 </td><td> 10.0 분 </td><td> BI : E1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20.01 </td><td> 기다림 </td><td> - </td><td> 0.0 분 </td><td> BI : A1 </td><td> BO : A1 </td><td> - </td><td> 린스 팁 </td></tr><tr><td colspan="8"> 방법 시간 프로그램을 실행 </td></tr><tr><td> 시간 (분) </td><td> 행사 </td><td> 값 </td><td> 지속 </td><td> 입구 유리 병 </td><tD&gt; 아울렛 유리 병 </td><td> 개요 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 1.0 분 </td><td> BI : C1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로, 인 / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> 염산 0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 2.0 분 </td><td> BI : B1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로, 인 / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> 물 </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 4.0 분 </td><td> BI : E1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로, 인 / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td> 주입 - 압력 </td><td> 34 밀리바 </td><td> 20.0 초 </td><td> SI : A1 </td><td> BO : B1 </td><td> 앞으로, 재정의 </td><td> 샘플 주입 </td></tr><tr><td> - </td><td> 기다림 </td><td> - </td><td> 0.4 분 </td><td> BI : A1 </td><td> 악: A1 </td><td> / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> 워시 팁 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 별도 - 전압 </td><td> 15.0 KV </td><td> 30.0 분 </td><td> BI : D1 </td><td> BO : D1 </td><td> 0.17 최소 램프, 정상 극성 인 / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> 샘플 분리 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> 자동 영점 조정 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.01 </td><td> 데이터를 중지 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.02 </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 2.0 분 </td><td> BI : B1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로, 인 / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> 물 </td></tr><tr><td> 32.03 </td><td> 기다림 </td><td> - </td><td> 0.0 분 </td><td> BI : A1 </td><td> BO : A1 </td><td> / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> 린스 팁 </td></tr><tr><td> 32.04 </td><td> 종료 </td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 종료 </td></tr><tr><td colspan="8"> 종료 방법 시간 프로그램 </td></tr><tr><td> 시간 (분) </td><td> 행사 </td><td> 값 </td><td> 지속 </td><td> 입구 유리 병 </td><td> 아울렛 유리 병 </td><td> 개요 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 1.0 분 </td><td> BI : E6 </td><td> BO : E6 </td><td> 앞으로 </td><td> 염산 0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 6.0 분 </td><td> BI : F6 </td><td> BO : F6 </td><td> 앞으로 </td><td> 물 </td></tr><tr><td> - </td><td> 램프 - 오프 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 기다림 </td><td> - </td><td> 0.0 분 </td><td> BI : A1 </td><td> BO : A1 </td><td> - </td><td> 린스 팁 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 컨디셔닝, 실행 및 종료 시간 프로그램. 5. 데이터 수집 및 처리 <ol><li> 샘플 세트를 프로그램. <ol><li> 컨디셔닝기구 방법을 사용하여 컨디셔닝 모세관 프로그램. 모세관가 처음 사용되는 경우, 네 개의 반복 과정; 그렇지 않으면 조절 방법의 두 반복 프로그램. </li><li> 주행 계기 방법을 이용하여 분석 될 시료 프로그램. </li><li> 셧다운기구 방법을 이용하여 저장을 위해 모세관 프로그램 섹션 3.2.22에 나타낸 절차를 반복한다. </li></ol></li><li> 실험을 실행합니다. </li><li> electropherograms를 내 보냅니다. </li><li> 마이그레이션 시간과 기본 주 (A)의 함유율을 계산electropherogram 프로필의 수직 드롭 라인 통합을 사용하여 차 산성 이성체. </li></ol>

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</ol>

저자 Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz 및 Emilio Medina-Rivero는 바이오시밀러 제품을 개발, 제조 및 마케팅하는 Probiomed S.A. de C.V.의 직원입니다. 모든 저자는 Probiomed의 바이오시밀러 제품 개발에 참여하고 있습니다.

실시 CZE가 성공 확률을 높이기 위해 모노클로 날 항체 분석 할 때이 튜토리얼에서, 우리는 적절한 방법의 중요성을 강조 표시합니다. CZE가 일상적으로 사용하는 경우에는, 문제가 필연적으로 발생한다 (12). 최상의 결과를 얻으려면, 그들이 극복하고 어려운 단계 문제를 해결하는 분석가 도움이 될 것 같은 프로토콜을 통해 포함 된주의 사항을 따르는 것이 중요합니다. 주어진 조건에 최적의 해상도를 얻기 위해 중요한 고려 BGE 용액의 정확한 제제이다. 이 프로세스는 완충제, 비 버퍼링 첨가제의 pH 농도의 이온 강도 엄격하게 제어 데 필요하다. 전반적으로, CE 시스템은 세부 사항에 관심과주의가 필요합니다. 시스템 청소 또는 어셈블리에 관한 단계를 무시할 경우 그것은 쉽게 손상 될 수 있습니다. 본 방법은 중성 모세관의 사용을 고려한다. 베어 융합 실리카 모세관 달리중성 모세관 따라서 분리 효율, 정확성 및...

단일 클론 항체 (단클론 항체는)으로 인해 여러 가지 만성 및 퇴행성 질환 일에 대해 행동하는 능력에 관심을 증가 biotherapeutic 단백질이다. 다른 생체 분자와 마찬가지로, 모노클로 날 항체가 (최종 제품에 생합성에서, 예) 수명주기의 모든 단계에서 여러 가지 물리 화학적 변형을 받아야하는 경향이있다. 이러한 변형을 포함하지만 이에 한정되지 않는다 : 탈 아미드 화, 글리코 실화, 산화, 폐환 반응, 이성화 반응, 응집 단백질 분해 절단이. 따라서, 극한 이성체를 해결할 수있는 분석 기법은 품질 사양을 설정하기 위해 모노클로 날 항체 얼룩이 안정성을 모니터링 할 필요가있다. 모세관 전기 영동 (CE)는 배경 전해질 (BGE)로 채워진 좁은 용융 실리카 튜브 (μm의 범위)의 outinside 실시 고성능 분리 기술이다. 전계의인가시에, 충전 분자 (30,000 V까지)의는 반대 전하 (즉, 전기 구동 분리)와 전극으로 이동한다. CE에서 높은 전압의 사용은 전통적인 겔 전기 우수한 고속 분석 및 증가 된 효율을 허용한다. 모세관 영역 전기 영동 (CZE)는 통상적으로 제품의 품질 평가 3-9에 대한 생물 약제 산업에 사용되는 CE 기반 기술이다. CE의 다른 모드 (예, 모세관 전기 영동, 모세관 등전점 포커싱) 또는 크로마토 기반의 방법과는 달리, CZE은 그 나라의 상태 (10)에 가까운 모노클 고유의 이질성의 분석을 허용 변성제 고체상 인터페이스를 사용하지 않고 수행 될 수있다 . 단클론 항체 동종의 CZE 분리는 친수성 고분자 (중립 모세관)으로 피복 용융 실리카 모세관 내부의 발생 전하, 질량, 크기 및 형상 (또는 유체 역학적 부피) (11)에 의해 지배되고 서로 다른 전기 영동 이동성을 기반으로한다. 단클론 항체 잔기 때 검출이들은 동원 214 내지 4에서 자외선 (UV) 흡수 검출기에 의해 감지 된 검출 윈도우를 통과한다. 이러한 분석 기술의 성공적인 구현은 전 실험 기간 동안 세부 적절한주의에 달려있다. 궁극적으로 지속적인 실패와 좌절로 이어지는 분석을 수행하기 위해 비용과 시간을 증가시킬 것이다, 그렇지 않으면 연기. 여기서는 용액 및 시료 CE 시스템 설정 악기 방법, 데이터 수집의 제제의 제조에 대한 상세한 설명을 통해 CZE 의해 단클론 이질성 성공적인 분석을 수행하는 단계별로 제시하고, 처리. 이 가이드의 목적을 위해, 재조합 완전 인간 항 종양 괴사 인자 알파 (TNFα 항) 단클론 항체 단백질 모델로서 사용된다; 그러나,이 프로토콜은 쉽게 간단한 수정을 고려하여 다른 단백질의 분석을 위해 사용자 정의 할 수 있습니다. 에이dditionally 몇 가지 권장 사항은 잠재적 인 문제가 제안 완화합니다. 독자는 엄격하게 증가 할 것이다 성공 확률로, 제안 된 프로토콜을 따르도록 권장합니다.

<table><tbody><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Tecsiquim</td><td>AT0035-7</td><td></td></tr><tr><td>ACS 등급 염산</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td></td></tr><tr><td>히스타민 디하이드로클로라이드</td><td>Fluka</td><td>53300</td><td></td></tr><tr><td>(하이드록시프로필) 메틸 셀룰로오스&nbsp;</td><td>Fluka</td><td>09963</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세테이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>6-Aminocaproic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,&nbsp; pH 8</td><td>Beckman Coulter</td><td>477427</td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus 제약 분석 시스템</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66528</td><td></td></tr><tr><td>eCAP 중성 모세관&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>477441</td><td></td></tr><tr><td>바이알, 마이크로, 200 &마이크로; l</td><td>Beckman Coulter</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>범용 바이알 캡</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62250</td><td></td></tr><tr><td>범용 바이알</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62251</td><td></td></tr><tr><td>케이블, 광학, UV/Vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>144093</td><td></td></tr><tr><td>UV/Vis 검출기 모듈</td><td>Beckman Coulter</td><td>144733</td><td></td></tr><tr><td>카트리지 어셈블리 키트, 빈</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>144738</tr></tbody></table>

중립 모세관을 사용하여 단일 클론 항체 동종의 모세관 전기 영동 분리

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

단클론 항체(mAb)와 같은 생물 치료 단백질은 만성 퇴행성 질환 치료를 위한 실현 가능한 대안입니다. 이러한 단백질의 생물학적 활성은 물리 화학적 특성에 따라 다릅니다. mAbs의 물리화학적 이질성 분석을 위해 크로마토그래피 및 모세관 전기영동과 같은 고성능 기술의 사용이 설명되었습니다. 오늘날 모세관 영역 전기영동(CZE) 기술은 생체 분자 분석을 위한 가장 단호하고 민감한 분석 방법 중 하나입니다. 또한 CZE의 전기 구동 분리는 물질의 광범위한 특성에 의해 제어되며 단백질을 원래 상태에 가깝게 분석할 수 있는 이점을 제공합니다. 그러나 일상적인 분석을 위한 이 기법의 성공적인 구현은 시료 및 시스템 준비 중 중요한 단계에서 분석가의 기술에 달려 있습니다. 이 튜토리얼의 목적은 mAb의 CZE 분석에서 성공하기 위한 단계를 자세히 설명하는 것입니다. 또한 이 프로토콜은 단백질 분석 화학 실험실에 관련된 인력의 기술 개발 및 향상에 사용할 수 있습니다.

도 2는 200 mM의 EACA, 30mm의 리튬 아세테이트의 전형적인 전류 프로파일을 도시 트리스 완충액 (50 mM의, pH를 8.0)로 희석 한 항 - TNFα 단클론 항체 샘플을 사용하여 pH 4.8 BGE. 관찰 될 수있는 바와 같이, 전류는 분석에 걸쳐 안정하고 30 내지 35 μA의 값 사이에서 발진 할 수있다. 검출 된 피크가 히스타민 내부 표준에 대응한다 그림 3은 빈 샘플의 CZE의 electropherogram을 보여줍니다. 3.7 ~ 4.1 분의 이동 시간을 갖고 히스타민 예상된다. 그림 4 항 TNFα 단클론 항체의 CZE의 electropherogram을 보여줍니다. 언급 될 수있는 바와 같이, 주 피크는 선행 작은 강도의 피크를 따른다. 분리가 (양에서 음 예) 정상 극성 하에서 수행되기 때문에, 분석의 기본 이성체 (단클론 항체는 양전...

여기에서는 단클론 항체의 고유한 물리화학적 이질성을 품질 속성으로 평가하기 위한 포괄적인 모세관 영역 전기영동 프로토콜을 제시합니다.

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

오늘날 모세관 세포 전기영동 기술은 단클론 항체와 같은 생체 분자 분석을 위한 가장 분해능이 높고 민감한 방법 중 하나입니다. 하지만 이 기술의 성공적인 구현은 시료 및 시스템 준비 과정의 핵심 단계에서 분석가의 지식과 숙련도에 달려 있습니다. 본 튜토리얼의 목적은 성공적인 분석 수행 방법을 안내하는 것이며, 용액 및 시료 준비, 모세관 전기영동 시스템 준비, 기기 분석법 설정, 그리고 데이터 판독 및 처리 과정에 대해 상세히 설명합니다.전반적으로 이 프로토콜은 분석 화학 실험실 준비에 참여하는 인원의 기술 개발 및 향상에 활용될 수 있습니다. 100 mL에서 최종 농도가 0.05%가 되도록 HPMC의 양을 칭량합니다. HPMC는 기본적인 탄성 폴리머이므로, 첫 번째 단계로 분말을 유리 비커에 붓고 80 mL의 물을 천천히 가하여 분말을 분산시킵니다.그런 다음, 분말 잔여물을 제거하기 위해 적심 트레이를 물로 헹굽니다. 나머지 시약들을 평소와 같이 첨가하고 용액을 교반합니다. 50% 아세트산을 사용하여 pH 값을 4.8로 조절합니다.용액을 5분 동안 안정화합니다. 그 후, 필요에 따라 pH를 조정합니다. 최종 부피가 100 milliliters가 되도록 증류수를 추가합니다.준비된 BG 용액을 중성 막으로 여과한 후 유리병에 붓습니다. 마지막으로 유리병에 적절한 라벨을 붙이고 냉장 보관합니다. 샘플을 준비하기 위해 첫 번째 단계로 1.5 milliliter 튜브에 trace buffer 용액 162 microliters를 넣습니다.그 다음, 10 mg/mL 농도로 미리 준비한 MAP 샘플 18 µL를 첨가합니다. 세 번째 단계로, 최종 샘플 부피가 200 µL가 되도록 미리 준비한 1% 히스타민 용액 20 µL를 첨가합니다. 다음 단계로, 샘플을 5초 동안 준비합니다.5초 동안 원심 분리합니다. 샘플의 전체 부피를 흡입합니다. 그리고 기포가 생기지 않도록 마이크로 바이알의 위쪽 방향으로 분주합니다.마지막으로, 바이알의 캡을 닫고 냉장 보관하십시오. 전원 스위치를 눌러 CE 기기의 전원을 끕니다. 그리고 앞문을 엽니다.인터페이스 블록 아래에 새 이동식 와이프를 배치합니다. 세척병을 사용하여 인터페이스 블록을 통해 전극을 물로 헹굽니다. 구멍을 통해 물이 떨어지게 한 후 인터페이스 블록을 완전히 건조시킵니다.와이프를 사용하여 전극의 과잉수를 조심스럽게 제거하십시오. 이 과정 동안 전극에 닿지 않도록 주의하십시오. 시

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 동영상은 DsRed-2F5-Epitope 또는 DFE 리간드를 사용하여 2F5 단클론 항체를 정제하기 위한 친화성 크로마토그래피 기술에 대해 설명합니다. 정제된 2F5 단클론 항체는 면역 요법에 필수적인 약물입니다.

DFE 기반 친화성 크로마토그래피: 높은 이온 강도 기반 용리 조건을 사용하여 미처리 샘플에서 2F5 단클론 항체를 정제하는 기술

이 비디오는 항체 생산 세포 배양에서 얻은 배양 상등액에서 단클론 항체를 정제하는 기술을 보여줍니다. 이 공정에는 접합된 단백질 A와 교차된 아가로스 비드의 매트릭스를 사용하는 것이 포함되며, 이는 비드의 상등액에 있는 항체를 고정시켜 오염 물질로부터 효과적으로 분리할 수 있습니다. pH가 낮은 용출 완충액을 적용하면 단백질 A-항체 상호 작용이 느슨해져 항체 함유 분획의 수집이 용이해집니다.

단클론 항체 정제를 위한 친화성 크로마토그래피 기법

이 비디오는 인간의 혈소판에서 근위축성 측삭 경화증(ALS)과 관련된 단백질 바이오마커를 검출하기 위한 모세관 전기영동 면역분석 프로토콜을 보여줍니다. ALS 바이오마커 단백질의 존재 확인은 혈소판 단백질의 크기 기반 분리와 화학발광 검출을 통해 이루어집니다.

단백질 바이오마커 검출을 위한 모세관 전기영동 면역분석

단백질 A 아가로즈 비드가 포장된 컬럼을 이용한 전통적인 친화성 크로마토그래피와 비교하여, 단백질 A 멤브레인 흡착제는 항체 및 기타 Fc 단편 발현 단백질의 실험실 규모 절연을 크게 가속화할 수 있습니다. 적절한 분석 및 정량화 방법은 단백질 처리를 더욱 가속화할 수 있으므로 20시간 이상의 근무 시간이 아닌 한 작업 시간에 격리/특성을 완료할 수 있습니다.

단백질 A 멤브레인 흡착제 및 간소화된 워크플로우를 사용하여 키메라 인간 Fc 발현 단백질의 격리 및 특성화

모 세관 기반 immunoassay 상용 플랫폼을 사용 하 여 총 단백질 준비에서 대상 단백질을 측정 하는 보여 줍니다. 또한, 노출 시간, 단백질 농도, 및 항 체 희석의 분석 결과 매개 변수 셀 문화 모델 시스템 최적화 되어 있다.

절차 및 자동화 된 모 세관 전기 이동 기반 Immunoassay 방법에 대 한 중요 한 최적화 전략

모 세관 전자 초점 단백질과 매우 작은 생물 학적 샘플에서 그들의 isoforms의 상세한 특성을 사용 하는 항 체 기반, 磁, 높은 처리량 기법입니다. 다음 자동화 하 고 운반할 방식 검색 및 특정 단백질과 그들의 isoforms의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

단백질 및 모 세관 전자 초점 방법으로 그들의 Isoforms의 매우 민감하고 정량적 검출

자동화된 미생물반응기의 수확된 세포 배양 유체(HCCF)로부터의 단일클론 항체의 정제 및 후속 분석을 위한 상세한 프로토콜이 기술되었다. 분석을 사용하여 중요한 품질 특성(CQA)을 결정하고 제한된 샘플 볼륨을 최대화하여 중요한 정보를 추출하는 것도 제공됩니다.

자동화된 미생물체 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소 세포의 단일 클론 항체의 정화 및 분석

쉬스 다공질 팁 인터페이스 설계를 이용하여 모세관 전기 영동 - 질량 분석법에 의한 생체 시료의 대사 프로파일 링을위한 프로토콜이 제시된다.

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

이 논문은 비변성 PAGE와 웨스턴 블롯 분석의 조합을 사용하여 인간 세포의 용해물에서 다이나민 유사 GTPase MxA 단백질의 올리고머 상태를 평가하는 간단하고 빠른 프로토콜에 대해 설명합니다.

비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 사용하여 인간의 MXA의 멀티 서브 유닛 단백질 복합체의 특성

이 프로토콜은 포유 동물 발현 시스템에서의 치료 용 항체의 생산을 설명한다. 설명하는 방법은 친 화성 크로마토 그래피를 사용하여 대규모 문화와 정화의 설정 벡터 DNA, 안정적인 형질 전환 및 인간 배아 신장 293 세포주의 무 혈청 적응의 준비를 포함한다.

실험실 규모의 생산과 치료 용 항체의 정제

배우세요 중성 모세관 전기영동을 이용한 단일 클론 항체 동종이성 분석 방법입니다. HPMC 용액 준비부터 시료 처리, 계측기 설정 및 데이터 처리까지 상세한 실험 프로토콜을 통해 분석 화학 실험실 인력의 기술 향상에 도움을 드립니다.

중립 모세관을 사용하여 단일 클론 항체 동종의 모세관 전기 영동 분리

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