3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

맞춤형 하이드로겔을 만들기 위한 이 방법의 전반적인 목표는 폐 세포외 기질의 복잡성을 복제하는 세포와 배양 조건을 연구하는 것입니다. 이 방법은 건강하고 병리학적인 조건에서 폐 세포가 ECM과 어떻게 상호 작용하는지와 같은 폐 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 폐 ECM 하이드로겔이 2D 또는 3D 배양 응용 분야에 맞게 조정할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 탈세포화 기술의 복잡성으로 인해 어려움을 겪을 수 있으며, 때로는 생존 가능한 조직의 양을 최적화하기 위해 여러 사람과 세부 사항에 주의를 기울여야 합니다. 이 프로토콜의 경우 탈세포화를 위해 돼지 폐를 준비해야 합니다. 준비에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.

폐가 준비되면 폐동맥에 맞게 캐뉼레이션된 핸드 펌프를 사용하십시오. 먼저 약 1리터의 물을 혈관 구조로 관류한 다음 1.5리터를 기관으로 관류합니다. 이 작업을 세 번 수행하여 세포 파편이 제거될 때 관류되는 물의 양을 늘립니다.

다음으로, 역시 핸드 펌프를 사용하여 Triton X-100으로 조직을 관류합니다. 그런 다음 조직을 섭씨 4도의 Triton X-100 용액에 24시간 동안 담그십시오. 24시간 후 증류수로 혈관과 기관을 3회 헹굽니다.

헹굼 후 핸드 펌프를 사용하여 조직에 데옥시콜레이트를 관류시킵니다. 그런 다음 조직을 섭씨 4도에서 24시간 동안 디옥시콜레이트에 담그십시오. 다음 날, 이전과 같이 증류수로 조직을 세 번 헹굽니다.

헹굼 후 핸드 펌프를 사용하여 여과된 염화나트륨으로 조직을 관류합니다. 그런 다음 조직을 여과된 염화나트륨에 섭씨 4도에서 한 시간 동안 담그십시오. 목욕 후 혈관과 기관을 증류수로 3회 관류하여 헹굽니다.

헹굼 후 조직을 DNase 용액으로 관류한 다음 섭씨 4도에서 1시간 동안 DNase 용액에 담그십시오. 한 시간 후 물이 아닌 PBS를 사용하여 혈관 구조와 기관을 5회 관류합니다. 이제 불투명한 백색 조직만 사용하여 직경이 2mm 이상인 모든 세뇨관을 해부합니다.

그들은 주로 폐의 hilum 및 medial 부분 주변에서 발견됩니다. 대부분 주변부에 있는 호흡 부위는 그대로 두십시오. 세뇨관을 제거한 후 조직을 1인치 또는 더 작은 부분으로 절개합니다.

이러한 블록의 방향은 중요하지 않습니다. 조직 블록을 배출한 후 50ml 원추형 튜브로 옮기고 섭씨 80도에서 얼립니다. 세포와 파편의 제거를 확인하기 위해 조직학을 위해 몇 개의 블록을 따로 설정할 수 있습니다.

폐 조직을 탈세포화된 분말로 가공하려면 냉동 조직 튜브의 덮개를 여과지로 교체하고 탄성 밴드로 고정합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 동결 건조기를 사용하여 과도한 액체가 모두 사라질 때까지 조직을 동결 건조합니다. 그런 다음 밀링할 수 있을 때까지 조직을 섭씨 80도에서 보관하십시오.

밀을 준비하려면 먼저 액체 질소를 로드하고 밀 튜브를 위한 공간을 남겨둡니다. 그런 다음 밀 튜브에서 마그네틱 밀 바를 제거하고 튜브 바닥을 티슈로 덮습니다. 그런 다음 밀 바를 교체하고 튜브를 채우기 위해 더 많은 조직을 느슨하게 포장합니다.

그런 다음 밀 튜브를 닫고 냉동고/밀에 넣고 밀에 액체 질소를 최대 용량까지 채웁니다. 이제 분당 약 600의 충격 속도로 약 5분 동안 분쇄기를 가동합니다. 그런 다음 필요할 때까지 탈세포화된 분말을 섭씨 80도에서 보관하십시오.

프리 겔 재료를 만들려면 탈세포화된 조직 분말과 펩신을 원뿔형 튜브에 추가합니다. 그런 다음 튜브에 0.01 몰 염산을 첨가하여 1 % 탈세포화 된 조직 분말과 0.01 % 펩신의 최종 농도를 얻습니다. 이 용액을 실온에서 48시간 동안 지속적으로 교반하여 조직을 소화하십시오.

48시간 후 용액을 얼음 위에 5분 동안 넣습니다. 이제 차가운 0.1 몰 수산화나트륨을 사용하여 용액의 pH를 7.4로 조정한 다음 10X PBS를 추가하여 용액의 PBS 농도를 1X로 가져옵니다. 우리는 프리 겔의 시간과 pH를 변경하는 데 대한 경험이 있습니다.

사용할 수 있는 범위에는 약간의 유연성이 있지만 절차를 사소한 방식으로 변경하면 속성이 크게 변경될 수 있습니다. 이 용액은 프리 겔로 간주되지 않으며 처리되지 않은 플레이트를 코팅하여 세포를 형성하기 위해 하이드로겔을 형성하거나, 세포를 형성하기 위해 하이드로겔을 형성하거나, 하이드로겔을 형성하기 전에 추가로 수정하여 하이드로겔의 강성을 높일 수 있습니다. 2차원 미세다공성 겔 코팅에서 세포를 배양하려면 20마이크로리터의 프리겔 용액을 96웰 비처리 조직 배양 플레이트의 웰에 추가합니다.

그런 다음 단백질이 플레이트에 흡수되도록 섭씨 4도에서 밤새 플레이트를 냉장 보관합니다. 다음날, 프리겔 용액을 흡입하고 PBS로 웰을 헹굽니다. 그런 다음 각 웰에 3, 200개의 세포를 추가하고 각 웰의 배지 부피를 100마이크로리터로 채웁니다.

그런 다음 플레이트를 배양할 수 있습니다. 미세 다공성 겔 내부의 세포를 사용한 3차원 세포 배양의 경우, pre-gel 용액에서 관심 세포를 밀리리터당 100만 개로 재현탁합니다. 그런 다음 16마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 빠르게 분배하여 약 500미크론 두께의 3D 세포 배양을 형성합니다.

겔은 섭씨 37도에서 배양하면 30분 안에 형성됩니다. 겔이 형성된 후 최대 100마이크로리터 표시까지 웰에 매체를 추가합니다. 미세 다공성 겔 위에 세포가 있는 3차원 세포 배양의 경우, 100마이크로리터의 프리 겔 용액을 처리되지 않은 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다.

그런 다음 겔화를 위해 섭씨 37도에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 겔이 형성되면 하이드로겔 위에 100마이크로리터 배지에 3, 200개의 세포를 추가하고 플레이트를 배양합니다. 하이드로겔은 설명된 방법을 사용하여 정상적인 돼지, 쥐 및 쥐의 폐에서 생성되었습니다.

유변학적 테스트를 통해 겔화의 90% 이상이 섭씨 37도에 도달한 후 처음 몇 분 안에 발생하는 것으로 확인되었습니다. 형성된 하이드로겔은 PBS에서 장기간 동안 안정적이었지만 세포 부착 및 증식은 시간이 지남에 따라 변할 수 있습니다. pre-gel 용액은 세포 부착을 개선하기 위한 코딩으로 테스트되었습니다.

인간 제대 정맥 내피 세포 부착 및 증식은 MTTSA를 사용하여 측정했습니다. 우물을 ECM으로 코팅하여 개선이 관찰되었습니다. 3D 겔을 만들 때 Genipin을 첨가하면 하이드로겔 가교가 증가했습니다.

레오미터의 주파수 스윕을 사용하여 하이드로겔 강성은 Genipin 농도와 직접적인 상관관계를 보였으며, 중앙값 및 가장 관련성이 높은 농도는 0.01%였습니다.더 단단한 겔을 테스트한 결과, 세포 증식은 교차결합이 증가한 겔의 MTTSA에 의해 더 높은 것으로 측정되었습니다. 일단 숙달되면 탈세포화는 4일 동안 8시간 만에 수행할 수 있습니다. 프리 겔 용액은 이틀에 걸쳐 1시간 안에 만들 수 있으며, 겔 형성은 이틀에 걸쳐 2시간 안에 달성할 수 있습니다.

이 절차에 따라 탄성 계수, 단백질 조성 및 물질에 대한 세포 반응과 같은 추가 질문에 답하기 위해 AFM, 웨스턴 블롯, 염색 및 면역조직화학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.