Name: 3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 배우세요 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔을 제작하여 3차원 세포 배양을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 폐 세포와 ECM의 상호작용을 건강 및 병리 상태에서 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 그대로 돼지의 폐 조직 기증에 대한 스미스 필드 팜을 감사드립니다. 우리는 또한 우리 자신의 장비를 사용할 수 있도록 박사 후 양 박사 크리스티나 당나라와 VCU 성형 외과 부서에 감사의 말씀을 전합니다. 히드로 겔 및 조직 샘플은 자금 조달 형태 NIH-NCI 암 센터 지원 그랜트에 의해 부분적으로 NIH - NINDS 센터 코어 그랜트 (5) P30 NS047463에서 자금에 의해 부분적으로 지원되는 해부학 및 신경 생물학 현미경 시설의 VCU 부서에서 SEM을 준비했다 P30의 CA016059. VCU 나노 기술 핵심 특성화 시설 (NCC)에서 샘플의 SEM 영상. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation), CMMI 1351162에 의해 투자되었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 해결책 </td><td> 살균 필터 </td><td> 지도 </td></tr><tr><td> DiH 2 O </td><td> 예 </td><td> DiH 2 O; 무균 여과 </td></tr><tr><td> 0.1 % 트리톤 X-100 솔루션 </td><td> 예 </td><td> 흄 후드에서 DiH 2 O 100 ㎖에 100 μL 트리톤-X 100 솔루션을 추가하고 용해 될 때까지 교반; 살균 필터. </td></tr><tr><td> 2 % 데 옥시 콜레이트 솔루션 </td><td> 예 </td><td> 흄 후드에서 2g 나트륨 데 옥시 콜레이트 솔루션을 추가 100 ㎖ DiH 2 O 용해 될 때까지 교반 당; 살균 필터 </td></tr><tr><td> 1 M의 NaCl </td><td> 예 </td><td> DiH 2 O 1 L에 58.44 g의 NaCl을 추가; 용해 될 때까지 교반; 살균 필터 </td></tr><tr><td> DNase의 솔루션 </td><td> 예 </td><td> 12,000 추가단위 DNase의 1 L DiH 2 O에; 0.156 g 황산 추가 (무수물), 및 0.222 g의 CaCl2를; 용해 될 때까지 교반; 살균 필터 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 예 </td><td> , 27.2 g 나 2 HPO 4 · 7H 2 O (이염 수화물)를 결합 80g의 NaCl, 10 L DiH 2 O와 2g의 KCl; 용해 될 때까지 교반; 7.4으로 산도를 조정; 살균 필터 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 조직 탈세 포화에 필요한 솔루션. 탈세 포화 프로세스에 대한 위의 솔루션을합니다. 4 ℃에서 보관하십시오. 약 2.5 L은 한 돼지의 폐를 위해 필요합니다. 1. 하이드로 겔 형성 <ol><li> (참조 9,10에서 적응) 돼지 폐 탈세 포화 <ol><li> 마음과 vasc으로, 도축장에서, 블록 엔 정상 돼지의 폐를 구합니다ulature 그대로. </li><li> 마음에 최대한 가까운 혈관을 절단, 마음을 멀리 해부 조직 가위 또는 메스를 사용, 나머지 혈관이 관류에 대한 이후 단계에서 사용됩니다. </li><li> 조심스럽게 메스 나 가위를 사용하여 기관, 기관지 및 혈관 주위의 결합 조직을 멀리 해부하다. 참고 : 탈세 포화 과정의 효과를 방해 할 수 큰 상처 또는 천공 늑막 통해 무기폐 또는 혈관 폐색 많은 양의없이 폐를 선택하여 절차의 나머지에 사용할 최적의 폐를 결정합니다. </li><li> (처분 할 수있다 심장, 결합 조직 및 제거 된 폐의 로브) 가능한 한 기관에 부착만큼 기관지를 떠나 최적 폐를 버려야. 하나의 폐는 기관지와 혈관에 부착 된 남아가 있어야합니다. 참고 : 원하는 경우 조직학에 대한 섹션을 유지. 9 </li><li> 페이지에 클램프 또는 봉합와 연결이 끊어진 기관지를 닫습니다하지 못하 초과 역류. </li></ol><ol start="6"><li> (표 1) 필요할 때까지 4 ° C에서 탈세 포화 솔루션과 냉장을 준비합니다. </li><li> 폐동맥 맞게 폐동맥 및 기관 모두를 통해 폐 조직을 탈 이온수로 3 회 관류하는 유관 핸드 펌프를 사용. 제마다 혈관을 관류. 혈관에 약 1 L 각 관류에 대한 기관에 1.5 L로 시작하지만, 세포 파편 제거로 더 많은 액체가 시스템을 통해 관류 할 수 있습니다. </li><li> 트리톤 X-100 용액을 모두 혈관과 기관을 관류. </li><li> 4 ℃에서 24 시간 동안 트리톤 X-100 용액에 폐 조직을 잠수함. </li><li> DI 워터와 관류의 혈관과 기관 3 회 씻어합니다. </li><li> 옥시 콜레이트 솔루션을 모두 혈관과 기관을 관류. </li><li> 4 ℃에서 24 시간 동안 옥시 콜레이트의 조직 섹션 잠수함. </li><li> DI 워터와 관류의 혈관과 기관 3 회 씻어합니다. </li><li>NaCl 용액으로 모두 혈관과 기관을 관류. </li><li> 4 ℃에서 1 시간 동안 여과 NaCl 용액에 조직을 잠수함. </li><li> DI 워터와 관류의 혈관과 기관 3 회 씻어합니다. </li><li> DNase의 솔루션을 모두 혈관과 기관을 관류. </li><li> 4 ℃에서 1 시간 동안 여과 DNase의 솔루션에서 조직을 잠수함. </li><li> 혈관 및 기관 PBS로 5 회를 모두 관류. </li><li> 눈에 띄는 연골 조직, 기관 만 호흡 영역 (주로 주변 지역)을두고기도를 수행에서 (주로 폐문과 폐의 중간 부분 주위에 있음) 직경의 모든 세관 2mm 이상을 멀리 해부하다. </li><li> 1 인치 절 이하에 조직을 해부하다. 조직의 방향은이 단계에서 문제가되지 않습니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브를 초과하는 액체와 장소 조직을 따르십시오. -80 ° C에서 조직을 동결. 참고 : 조직학 세포 및 세포 debri의 제거를 보장하는 섹션을 유지S 원한다면. 우리는 H &amp; E를 사용, α - 갈 락토시다 아제, picogreen, 하이드 록시 프롤린, 닌히 드린, 알 시안 블루, SDS-PAGE 및 질량 분석의 특징입니다. 9 </li></ol></li><li> 폐 처리 <ol><li> decellularized 폐 조직을 포함하는 냉동 튜브의 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 튜브 입구에 필터 종이를 놓고 고무 밴드로 고정합니다. 참고 : 튜브 및 내용은 여전히 ​​고정 될 때까지 그렇지 않으면 -80 ° C에 배치 동결해야합니다. </li><li> 모든 초과 액체 제조 업체의 지시에 따라 동결 건조기를 사용하여, 사라 될 때까지 조직을 동결 건조. 밀 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 근로 조건에 절연 및 내부 부품의 온도를 냉장고 밀에 액체 질소를 추가 시작하기 전에. </li><li> 밀 튜브에서 자기 밀 줄을 제거하고 바닥을 충당하기 위해 조직을 추가합니다. </li><li> 밀 줄을 교체하고 느슨하게 포장 조직을 추가합니다. 밀 바는 여전히 자유롭게 이동해야합니다. </li><li> 밀 튜브와 괞 찮아을 닫습니다냉동 공장에서 가전. </li><li> 최대 적재 선에 액체 질소를 입력합니다. </li><li> 냉동기 밀 미분말에 모든 조직 (약 5 분 ~ 600 분의 충돌 속도 -1)와, 스테인레스 스틸 충격기 폴리 카보네이트 실린더뿐만 아니라 제조자 지시에 따라 냉동기 밀을 사용하여 스테인리스 단부 플러그이다. 사용 전까지 -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 마이크로 다공성 겔 형성 (8 ㎎ / ㎖) (참조 각색 9,11) <ol><li> 1 % 추가 (W / V)를 decellularized 분말 및 0.1 % (w / v)의 0.01 M 염산을 펩신, 일정한 교반하에 들면, 실온에서, (액체의 최상위에 흐름을 볼 수 있어야한다) 48 시간. 주 : 분말 정적 분말이 튜브 벽면에 과잉 세척 할 기회를 제공 한 후이므로 염산을 추가 충전된다. </li><li> 48 시간 동안 소화 한 후, 5 분 동안 얼음에 솔루션 및 시약을 배치합니다. </li><li> 냉장 10 % 사용 (v / v)의 0.1 M NaOH를,D 11.11 % (v / v)의 10 배 PBS는 7.4의 생리적 산도에 소화 단백질 용액을 가지고 (농도를 1 배 전체 솔루션을 가지고). 참고 :이 솔루션은 이제 일주까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 원하는 경우 유변학 (9)를 사용하여 겔화 반응 속도를 수행합니다. </li></ol></li></ol> 2. 기계적 강도를 개선하기 위해 하이드로 겔 가교 <ol><li> 1 %, 0.1 % 및 V genipin 가교 용액 / w 0.01 % 용액을 10 % DMSO에 genipin 분말의 필요량을 용해시켜 제조 하였다. </li><li> 1 시간 동안이 용액을 15 분마다 와동. </li><li> 이전 부분 1.3.4에서 조립 된 ECM 하이드로 겔 (96 웰 플레이트의 각 웰에 100 μL)를 커버하는 genipin 솔루션을 추가합니다. </li><li> 37 ° C에서 24 시간 동안 가교 각 ECM 하이드로 겔을 둡니다. </li><li> 세정액이 더 이상 청색까지 ECM 하이드로 겔을 PBS로 3 회 씻어 없다. 가교 하이드로 겔은 더 특성화 및 CE에 대한 준비가 될 것입니다LL 문화 연구. </li></ol> 미세 다공성 젤 3. 세포 배양 <ol><li> 이차원 코팅 <ol><li> 1.3.3에서 용액을 사용하여 96 웰 비 - 처리 된 조직 배양 플레이트의 각 웰에 프리 겔 용액 20 μL를 추가한다. </li><li> 4 ° C에서 냉장 하룻밤 단백질 흡착 플레이트 할 수 있습니다. </li><li> 기음 프레 겔 용액 PBS로 씻어. </li><li> 통로 세포 (9). </li><li> 우물에 10,000 세포 / cm 2를 추가합니다. </li><li> 물론 당 100 μL 미디어를 높이고 37 ° C에서 품어. </li></ol></li><li> 삼차원 세포 배양 9 <ol><li> 1.3.3에서 용액을 사용하여, 프리 겔 용액을 100 세포 / ml의 농도로 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 신속 3D 세포 배양 용 ~ 500 μm의 두께 하이드로 겔을 형성하기 위해, 96 웰 플레이트의 각 웰에 프레 겔 세포 현탁액 16 μL 분주. </li><li> 30, 37 ° C에서 품어젤 분 형성한다. </li><li> 형성된 하이드로 겔의 상단에 미디어 100 μl를 추가하고 37 ° C에서 품어. </li></ol></li><li> 가변 강성 젤에 세 차원 세포 배양 <ol><li> 96 웰 플레이트의 각 웰에 피펫 1.3.3에서 프리 겔 용액을 100 μL 용액을 사용. </li><li> 겔을 형성하도록 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 참고 : 여기에 사용할 수있는 2 부에서 단계를 상호 결합. </li><li> 통로 세포 (9). </li><li> 우물에 10,000 세포 / cm 2를 추가합니다. </li><li> 물론 당 100 μL 미디어를 높이고 37 ° C에서 품어. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

생물학 적분 측면 중 하나는 특정한 작업을 수행하는 계층 적 구조로 분자의 자기 조직이다. 연구실에서 (13)는, 자기 조립은 염 농도, 산도, 소화 기간 등 다양한 요인에 따라 달라집니다. 도시 된 바와 같이, 자기 조직화 하이드로 폼 가용화 된 단백질은 생리 학적 온도로 돌아 오면. 형성된 하이드로 겔은 생체 외에서 세포의 부착과 증식을 촉진 할 수있다. ECM에서 생물 물리학 신호를 세포 반응 고분자를 사용하여 연구 할 수 없습니다. 생물 물리학 신호 조직 특이 적 세포 반응이 다른 조직을 이용하여 조사 할 수 없다. 재생 연구자 및 임상 decellularized 비계를 사용하여 조직 재생 및 상처 치유를 향상 생각합니다. 만성 폐 질환 환자는 장기 가용성을 증가시키고 면역 원성을 감소시키는 치료 개선이 필요합니다. 장기 특정 셀 ECM 상호 작용해야합니다또한 장기 생물학을 연구. ...

체외 결과를 임상에 적용하는 것은 생물의학 연구자들이 직면한 가장 어려운 문제 중 하나입니다. 조직 배양 플라스틱에 대한 체외 연구는 더 쉽고 편리하며 높은 세포 생존력을 유지합니다. 1 이 접근법은 합리적인 출발점이지만, 임상 번역에 한계가 있는 결과를 보였다. 점점 더 많은 실험실에서 기존의 2차원 방법을 대체하기 위해 3차원 구조를 통합하고 있습니다. 생물학적 지지체에서 고분자 지지체에 이르기까지 다양한 3차원 환경에 대한 검토를 사용할 수 있습니다. 2,3 호
생물학적 프레임워크는 네이티브 매트릭스의 많은 단백질 및 글리코사미노글리칸 구성 요소를 포함하고 세포가 부착하고 인식할 수 있는 친숙한 결합 부위를 제공하기 때문에 생체 내 환경의 특성을 모방할 수 있습니다. 세포외 기질(ECM) 유래 물질은 세포 부착 및 증식을 위한 유능한 골격으로 나타났습니다. 4 ECM 하이드로겔 플랫폼의 적용을 제한하는 한 가지 문제는 겔화 후 본질적으로 약한 기계적 특성에서 비롯됩니다. 천연 조직은 종종 하이드로겔보다 훨씬 높은 기계적 특성을 가지고 있습니다. 무독성 가교제는 하이드로겔의 기계적 특성을 증가시켜 천연 조직 환경을 더 잘 모방할 수 있습니다. Genipin은 치자나무 식물에서 유래한 무독성 천연 교차결합제(natural crosslinker)로, 제니핀 농도의 변화에 따라 ECM의 기계적 특성을 밀접하게 조정할 수 있는 능력을 가지고 있습니다5,6. 
신체의 거의 모든 세포는 ECM에 존재하며 ECM에서 조직하여 생산하거나 유지합니다. 모든 장기 또는 시스템의 조직, 상태 및 기능에서 ECM의 보편적 중요성에 대한 새로운 초점은 체외 조사를 위한 매트릭스 기반 플랫폼의 생산을 촉발했습니다. 돼지 소장 점막하(Porcine Small intestine submucosa)는 가장 광범위하게 연구된 자연 유래 골격으로, 힘줄, 인대, 골격근4, 심지어 뼈7를 재생하는 데 사용되어 왔습니다. 다른 장기와 기증자 종의 매트릭스도 우수한 조직 재생 잠재력을 보여주었습니다. 외부 ECM 구성 요소를 사용하면 면역 조절과 관련된 문제가 최소화됩니다. 숙주 세포 물질이 제거된 후, 나머지 ECM은 다른 모든 포유류 종과 아미노산 함량 및 조직이 유사할 것입니다8. 체외에서 세포-ECM 상호 작용을 검사하는 가장 좋은 방법은 장기 특이적 ECM 골격을 활용하는 것이라는 생각이 점점 더 커지고 있습니다. 각 기관은 단백질과 프로테오글리칸의 고유한 구성을 제공하여 세포 틈새를 만듭니다. 틈새(nicech)는 생물물리학적 신호전달에 기여하는 세포외 기질의 구조적, 기능적, 심지어 효소적 분해를 제공합니다. 생체 내 미세환경과 가장 유사한 시험관 내 미세환경을 얻기 위해 조직 특이적 ECM을 사용하면 연구를 위한 세포 틈새를 최적화할 수 있습니다. 
이 프로토콜의 목표는 폐 ECM에 고유한 하이드로겔 골격을 확립하는 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 폐 세포와 ECM 상호 작용에 대한 체외 연구를 위한 플랫폼을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>트리톤 X-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>눈 보호구와 장갑을 낀 채 흄 후드에 사용하십시오.</td></tr><tr><td>소듐 데옥시콜레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>D6750-100g</td><td>후드에 보안경과 장갑과 함께 사용하세요.</td></tr><tr><td>마그네슘 황산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500g</td><td>없음</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-500g</td><td>없음</td></tr><tr><td></td><td>DNase Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td>없음</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td>보안경과 장갑과 함께 사용하십시오.</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td>보안경과 장갑이 있는 흄 후드에 사용하십시오.</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td>보안경 및 장갑과 함께 사용하십시오.</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Wako Chemicals</td><td>078-03021</td><td>눈 보호구 및 장갑과 함께 흄 후드에 사용하십시오.</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>품질 생물학</td><td>119-069-151</td><td>없음</td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-448</td><td>없음</td></tr><tr><td>여과지</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>N/A</td></tr><tr><td>핸드 펌프</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-239-1</td><td>N/A</td></tr><tr><td>대학원 비커</td><td>VitLab</td><td>445941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>크라이오밀</td><td>SPEX</td><td>6700</td><td>크라이오글러브와 눈 사용 보호.</td></tr><tr><td>동결 건조기</td><td>FTS FlexiDry</td><td></td><td>장갑을 사용합니다.</td></tr><tr><td>Rheometer</td><td>Discovery</td><td>HR-2</td><td>장갑과 보안경을 착용하십시오.</td></tr></tbody></table>

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

여기에서는 시험 관내 폐 세포 배양 여러 컴포넌트 세포 배양 하이드로 겔을 형성하기위한 방법을 제시한다. 돼지, 쥐, 또는 마우스에서 블록의 폐 조직 엔 건강을 시작으로, 조직은 관류 및 세포 파편을 제거하기 위해 후속 화학 세제에 잠겨있다. 처리 전후의 조직 학적 비교는 이중 가닥 DNA 및 알파 갈 락토시다 제 염색을 95 % 이상 제거하는 것을 확인 세포 파편의 대부분이 제거되어 나왔다. 탈세 포화 후, 조직을 동결 건조 후 분말로 cryomilled이다. 매트릭스 분말 산성 펩신 소화 용액에 48 시간 동안 절단 한 후, 프리 겔 용액을 형성하기 위해 중화된다. 프레 겔 용액의 겔화 37 ° C에서 배양하여 유도 할 수 있고, 곧바로 다음 중화 사용 또는 최대 2 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. 코팅은 C에 대한 비 처리 판의 프리 겔 용액을 사용하여 형성 될 수있다엘 첨부. 세포는 세포 골격을 통해 이전 또는 코팅에 도금 할 수있는 형성된 겔의 표면 상에 도금 된 3 차원 배양을 달성하기 위해 자기 조립 전에 프레 겔에 현탁 될 수있다. 전략에 변화가 겔화 온도, 강도, 또는 단백질 단편의 크기에 영향을 미칠 수 있습니다 발표했다. 하이드로 겔 형성 외에도 하이드로 겔 강성 genipin을 사용하여 증가 될 수있다.

이 방법을 사용하여, 우리는 정상 돼지, 래트, 마우스 폐 (도 1)로부터의 하이드로 겔을 제조 하였다. 폐 처리는 각각 5 ㎎, 40 ㎎, 및 ECM 분말 10g을 추정 제공한다. 공정의 개요는도 2에 도시되어있다. 과정에서 주요 시각화은 다음과 같습니다 : 데 옥시 콜레이트 세척 후 폐의 흰색 외관; 프레 겔을 형성 한 후에, 용액을 은폐되어야하고 4 ℃에서 저장하는 경우, 용액을 균질 개월 표시한다. 우리는 과정 (표 2)를 통해 오류의 원인을 파악하는 데 도움이되는 기본적인 문제 해결 테이블을 포함하고있다. 겔화 후, 수화겔 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 저장된다. 레올 로지 시험 겔의 90 % 이상은 37 ° C (도 3)에 도달 한 후 제 분에 발생하는 것을 확인한다. 형성된 하이드로 겔은 긴 PBS의 기간 있지만, 세포 부착 및 ...

이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

맞춤형 하이드로젤을 제작하는 이 방법의 전반적인 목표는 폐 세포외 기질의 복잡성을 재현하는 세포 및 배양 조건을 연구하는 것입니다. 이 방법은 폐 세포가 건강한 상태와 병리적 상태에서 ECM과 어떻게 상호작용하는지와 같은 폐 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 폐 ECM 하이드로젤을 2D 또는 3D 배양의 응용 목적에 맞게 맞춤 조절할 수 있다는 점입니다.일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 탈세포화 기술의 복잡성으로 인해 어려움을 겪을 수 있으며, 생존 가능한 조직의 양을 최적화하기 위해 때로는 여러 명의 인원과 세심한 주의가 필요합니다. 본 프로토콜을 위해 탈세포화 준비가 된 돼지 폐를 준비하십시오. 준비 과정에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다.폐 준비가 완료되면, 폐동맥에 맞게 캐뉼라가 장착된 핸드 펌프를 사용하십시오. 먼저 약 1L의 물을 혈관계로 관류시키고, 이어서 1.5L의 물을 기관으로 관류시킵니다. 세포 잔해물이 제거됨에 따라 관류하는 물의 양을 늘려가며 이 과정을 세 번 반복하십시오.다음으로, 수동 펌프를 사용하여 Triton X-100으로 조직을 관류합니다. 그런 다음, 4°C의 Triton X-100 용액 욕조에 조직을 24시간 동안 담가 둡니다. 24시간 후, 혈관과 기관을 증류수로 세 번 헹굽니다.세척 후, 핸드 펌프를 사용하여 조직에 deoxycholate를 관류합니다. 그런 다음 조직을 4°C에서 24시간 동안 deoxycholate에 담가 둡니다. 다음 날, 이전과 동일하게 증류수로 조직을 세 번 세척합니다.세척 후, 핸드 펌프를 사용하여 여과된 염화나트륨으로 조직을 관류합니다. 그런 다음 여과된 염화나트륨에 조직을 담가 4°C에서 1시간 동안 보관합니다. 배스 처리가 끝나면, 증류수로 혈관과 기관을 세 번 관류하여 세척합니다.세척 후, 조직에 DNase 용액을 관류하고 4°C에서 1시간 동안 DNase 용액에 침지합니다. 1시간 후, 물이 아닌 PBS를 사용하여 혈관과 기관을 5회 관류합니다. 이제 불투명한 흰색 조직만을 사용하여, 직경이 2 mm 이상인 모든 세뇨관을 절제하여 제거합니다.이들은 주로 폐의 폐문 및 내측 부분에서 발견됩니다. 대부분 주변부에 위치한 호흡대는 그대로 둡니다. 세관을 제거한 후, 조직을 1인치 이하의 크기로 절개하십시오.이 블록들의 방향은 중요하지 않습니다. 조직 블록의 액체를 모두 제거한 후, 50 milliliter 원심 분리 튜브로 옮겨 80 °C에서 냉동하십시오. 세포와 잔해물의 제거 여부를 확인하기 위해 몇 개의 블록은 조직학적 분석용으로 따로 보관할 수 있습니다.폐 조직을 탈세포화 분말로 처리하려면, 냉동 조직 튜브의 덮개를 여과지로 교체하고 고무줄로 고정하십시오. 그런 다음, 제조사의 지침에 따라 동결 건조기를 사용하여 모든 과잉 액체가 제거될 때까지 조직을 동결 건조하십시오. 그 후, 분쇄가 가능할 때까지 조직을 80 °C에서 보관하십시오.밀(mill)을 준비하려면, 먼저 밀 튜브가 들어갈 공간을 남겨두고 액체 질소를 채웁니다. 그다지 밀 튜브에서 자성 밀 바(magnetic mill bar)를 제거하고 튜브 바닥을 조직으로 덮습니다. 그런 다음, 밀 바를 다시 넣고 튜브를 채울 수 있도록 조직을 더 느슨하게 채워 넣습니다.그다음, 밀 튜브를 닫고 냉동기/밀에 넣은 후, 액체 질소를 최대 용량까지 채웁니다. 이제 약 600회/분의 충격률로 약 5분 동안 밀을 가동합니다. 그 후, 탈세포화된 분말을 필요할 때까지 -80 °C에서 보관합니다.프리겔(pre-gel) 재료를 만들기 위해, 원추형 튜브에 탈세포화 조직 분말과 펩신을 넣습니다. 그 다음, 탈세포화 조직 분말의 최종 농도가 1%이고 펩신의 최종 농도가 0.01%가 되도록 0.01 molar 염산을 튜브에 첨가합니다. 조직을 소화시키기 위해 이 용액을 실온에서 48시간 동안 지속적으로 교반하며 유지합니다.48시간 후, 용액을 얼음에 5분 동안 둡니다. 이제 차가운 0.1 molar 수산화나트륨을 사용하여 용액의 pH를 7.4로 조절하고, 10X PBS를 추가하여 용액의 PBS 농도를 1X로 맞춥니다. 저희는 프리겔(pre-gel)의 시간과 pH를 변경해 본 경험이 있습니다.사용 가능한 범위에는 어느 정도 유연성이 있으나, 절차를 조금만 변경해도 특성이 크게 변할 수 있습니다. 이 용액은 프리젤(pre-gel) 상태로 간주되지 않으며, 처리되지 않은 플레이트를 코팅하여 세포를 배양할 하이드로젤을 형성하거나, 세포가 내부에 포함된 하이드로젤을 형성하는 데 사용할 수 있으며, 또는 하이드로젤 형성 전에 추가로 변형하여 하이드로젤의 강성을 높일 수 있습니다. 2차원 미세 다공성 젤 코팅 위에 세포를 배양하려면, 처리되지 않은 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 프리젤 용액 20 µL를 첨가하십시오.그 다음, 단백질이 플레이트에 흡착되도록 4°C에서 플레이트를 하룻밤 동안 냉장 보관합니다. 다음 날, pre-gel 용액을 흡입하여 제거하고 PBS로 웰을 세척합니다. 그런 다음, 각 웰에 3,200개의 세포를 분주하고 각 웰의 배지 부피를 100 µL까지 채웁니다.그 후 플레이트를 배양할 수 있습니다. 미세 다공성 겔 내부에 세포가 포함된 3차원 세포 배양을 위해, 목적 세포를 프리겔 용액에서 mL당 100만 개가 되도록 재현탁하십시오. 그런 다음, 세포 현탁액 16 µL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 빠르게 분주하여 두께가 약 500 µm인 3D 세포 배양물을 형성합니다.37°C에서 배양하면 30분 후에 겔이 형성됩니다. 겔이 형성된 후, 웰에 배지를 100 µL 표시선까지 추가하십시오. 미세 다공성 겔 위에 세포가 위치하는 3차원 세포 배양을 위해서는, 처리되지 않은 96-웰 플레이트의 웰에 프리겔(pre-gel) 용액 100 µL를 추가하십시오.그런 다음, 겔화를 위해 플레이트를 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 겔이 형성되면, 하이드로겔 위에 100 µL 배지에 포함된 3,200개의 세포를 첨가하고 플레이트를 배양합니다. 하이드로겔은 앞서 설명한 방법을 사용하여 정상 돼지, 쥐 및 생쥐의 폐로부터 제작되었습니다.유변학적 테스트 결과, 37 °C에 도달한 후 처음 몇 분 이내에 겔화의 90% 이상이 일어나는 것으로 확인되었습니다. 형성된 하이드로젤은 PBS 내에서 장기간 안정적이었으나, 세포 부착 및 증식은 시간에 따라 변할 수 있습니다. 세포 부착을 개선하기 위해 프리겔(pre-gel) 용액을 코팅제로 테스트하였습니다.MTTSA를 사용하여 인간 제대정맥 내피세포의 부착 및 증식을 측정하였습니다. 웰을 ECM으로 코팅했을 때 개선 효과가 관찰되었습니다. 3D 겔을 제작할 때 Genipin을 첨가하면 하이드로겔의 가교 결합이 증가하였습니다.레오미터(rheometer)를 이용한 주파수 소인(frequency sweep) 결과, 하이드로젤의 강도는 Genipin 농도와 직접적인 상관관계가 있었으며, 중앙값 및 가장 적절한 농도는 0.01%였습니다. 더 단단한 젤을 테스트한 결과, 가교 결합이 증가한 젤에서 MTTSA를 통해 측정된 세포 증식률이 더 높게 나타났습니다. 숙련된 경우, 탈세포화 과정은 4일 동안 하루 8시간씩 수행할 수 있습니다. 젤 전구체 용액은 2일 동안 하루 1시간 내에 제조할 수 있으며, 젤 형성은 2일 동안 하루 2시간 내에 완료될 수 있습니다.이 절차 이후에 AFM, 웨스턴 블롯, 염색 및 면역조직화학법과 같은 다른 방법들을 수행하여 탄성 계수, 단백질 구성 및 재료에 대한 세포 반응과 같은 추가적인 의문점들을 해결할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

간단한 기법은 일반적인 세​​포 배양 기판에 동적 마스크 프로젝션 리소그래피를위한 디지털 micromirror 장치를 사용하여 microfabricated 신경 문화 시스템의 급속한 생산 설명되어 있습니다. 이러한 문화 시스템은 천연 생물 학적 구조가 더 대표 수 있으며, 설명된 기술은 다양한 어플 리케이션에 맞게 수 있습니다.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

우리는 독립형 형태로 조립 및 조작할 수 있는 간단한 프로세스를 사용하여 미세 패턴화된 하이드로겔 시트의 제작을 설명합니다. 이러한 모듈식 하이드로겔 시트를 사용하면 제어된 세포 미세환경으로 간단한 매크로 스케일 3D 세포 배양 시스템을 생성할 수 있습니다.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 촬상 실시간 세포 생물학 연구를위한 강력한 도구이다. 여기서, 종래의 표면 형광 현미경을 사용하여 생리적 3 차원 히드로 겔 미세 환경에서 FRET 촬상 세포위한 방법이 제시된다. 활성 범위에 걸쳐 선형 비율을 산출 비율 적 FRET 프로브에 대한 분석을 설명한다.

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

현재 bilayer 문화 모델 vivo에서 microenvironments 모방 기능 생체 외에서 연구에 대 한 허용 하지 않습니다. 폴 리 에틸렌 글리콜과 산화 아연 템플릿 메서드를 사용 하 여이 프로토콜에 설명 합니다 ultrathin biomimetic 지하실 막의 개발을 가변 강성, 다공성와 밀접 하 게 비보에 모방 하는 생 화 확 적인 구성 세포 외 매트릭스입니다.

듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin Porated 탄성 Hydrogels 세포 배양

그들은 완전 한 tunability 폴리머 백본 및 따라서 셀 microenvironment의 허용으로 재조합 단백질 엔지니어링 hydrogels는 3D 세포 배양에 대 한 유리한 있습니다. 여기, 우리 재조합 엘라 스 틴 같은 단백질 정화의 과정 및 3 차원 하이드로 겔 셀 캡슐화에의 응용을 설명합니다.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

우리 불멸 하 게 종양 및 섬유 세포 bioprintable alginate/젤라틴 bioink에 포함 된 구성 된 이기종 유 방 암 모델 개발. 모델이 비보에 종양 microenvironment tumorigenesis 운전 메커니즘에 대 한 통찰력을 양보 하는 다세포 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다.

셀 회전 타원 체 형성을 유발 하는 모델 시스템에 3D 생체 외에서 Bioprintable Alginate/젤라틴 하이드로 겔

제시된 방법은 실리콘 고무에 내장된 3D 소프트 하이드로겔의 단종 스트레칭을 포함하면서 살아있는 공초점 현미경 검사를 허용합니다. 섬유 정렬뿐만 아니라 외부 및 내부 하이드로겔 균주의 특성화가 입증된다. 개발된 장치 및 프로토콜은 다양한 변형 정권에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있다.

라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형

본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.

하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.

이 기사에서는 세포외 기질 경화 및 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 광조정 가능 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다.

섬유아세포 활성화를 연구하기 위한 3D 바이오프린팅 광조정 가능 하이드로겔

배우세요 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔을 제작하여 3차원 세포 배양을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 폐 세포와 ECM의 상호작용을 건강 및 병리 상태에서 연구하는 데 활용됩니다.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

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