실험 성 대장염 동안 장내 상피 장벽 기능에 영양 보조 식품의 유익한 효과 분석

이 프로토콜의 전반적인 목표는 덱스트란 황산염 나트륨에 의해 유발된 대장염의 쥐 모델에서 보충 영양소의 효과를 평가하는 것입니다. 이 방법은 대장염 모델 실험의 방향 전반에 걸쳐 임상 과학의 발전에 대한 장 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비용이 저렴하고 정교한 장비가 필요하지 않으며 전체 결장의 형태에 대한 명확한 분석을 제공한다는 것입니다.

이 방법은 과도한 호중구 동원의 결과로 인한 결장의 산화 스트레스를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. gavage에 의한 영양 보충제 투여의 경우, 먼저 목덜미로 마우스를 수동으로 제지하고 꼬리를 세 번째 손가락과 엄지 손가락 바닥 사이에 놓습니다. 그런 다음 마우스를 똑바로 세우고 동물의 입 왼쪽에 위 바늘을 삽입하고 조심스럽게 입천장을 따라 식도를 찾습니다.

저항이 없으면 바늘을 위 쪽으로 전진시킵니다. 전체 보충제를 천천히 전달한 다음 주사기를 조심스럽게 제거하고 동물의 체중을 측정합니다. 체중 감량 비율에 따라 0에서 4까지의 점수를 할당한 다음 새로운 대변 샘플을 수집하고 제공된 애플리케이터를 사용하여 구아이악 대변 잠혈 검사 키트의 슬라이드에 샘플을 얇게 바르십시오.

키트 앞면의 덮개를 닫고 뒤쪽 창을 열어 현상액 용액을 시료 위치 뒷면에 두 방울 떨어뜨립니다. 30초 후에 결과를 읽고 신호 강도에 따라 0에서 4의 점수를 할당합니다. 그런 다음 두 번째 새로운 대변 샘플을 관찰하여 대변 일관성을 평가하고 적절하게 0에서 4의 점수를 할당합니다.

in vivo에서 장 상피 투과성을 측정하려면 마취된 동물을 누운 자세로 놓고 정중선을 절개하여 장을 노출시킵니다. 맹장을 찾아 결장 상원의 근위부를 작게 절개합니다. 그런 다음 22 게이지 공급 바늘을 삽입하고 일반적인 실크 실 합자로 바늘을 고정합니다.

바늘을 통해 충분한 양의 PBS를 조심스럽게 씻어내어 결장에서 모든 대변을 헹군 다음 염료가 항문에 도달할 때까지 Evans 블루 용액을 설치합니다. 15분 후, 항문 주위 세척이 깨끗해질 때까지 과도한 양의 PBS로 튜브를 세척합니다. 그런 다음 결장을 절제하고 PBS로 조직을 더 헹군 다음 6밀리몰 N-아세틸시스테인 1밀리리터를 투여하여 결장 점액에 달라붙는 염료를 제거합니다.

이제 결장을 세로로 자르고 PBS와 N-아세틸시스테인으로 조직을 한 번 더 헹군 다음 결장의 무게와 길이를 기록하고 조직을 실온에서 2밀리리터의 N, N-디메틸포름아미드에 넣고 잔여 염료를 추출하고 다음날 아침 610나노미터에서 분광 광도계로 염료 농도를 측정합니다. 덱스트란 황산염 나트륨 또는 DSS에 의한 대장염을 7일 동안 투여한 후 결장 전체를 절개하고 길이를 기록합니다. 스위스 롤의 경우 결장을 세로로 열고 대변을 조심스럽게 제거한 다음 얇고 둥근 나무 막대기나 끝이 가는 집게를 사용하여 점막이 안쪽을 향하도록 조직을 굴립니다.

그런 다음 조직을 임베딩 카세트 내부에 조심스럽게 넣은 다음 실온에서 5ml의 10% 포름알데히드로 고정합니다. 조직 절편 중 문제를 피하기 위해 결장을 접히지 않고 단단히 말아 올리는 것이 중요하며, 이는 임상 조직 손상과 대장염 관련 손상으로 잘못 해석될 수 있습니다. 48시간 후 수돗물로 샘플을 18시간 동안 세척한 다음 에탄올 시리즈로 탈수합니다.

마지막 절대 에탄올 침지 후 자일렌에서 1시간 배양 4회를 통해 조직을 처리합니다. 마지막으로 자일렌을 담근 후, 샘플을 50ml의 액체 파라핀에 넣어 17시간 및 3시간 배양 1회를 합니다. 3시간의 배양이 끝나면 샘플을 22입방밀리미터 정사각형 플라스틱 틀에 8-10밀리리터의 신선한 액체 파라핀에 24시간 동안 담급니다.

파라핀이 응고되면 마이크로톰을 사용하여 5미크론 두께의 조직 절편을 얻은 다음 0.3%젤라틴이 함유된 1리터 수조에 단면을 잠시 담그고 H&E 염색을 위해 폴리리신으로 처리된 유리 슬라이드에 샘플을 즉시 장착합니다. 산화 응력 분석을 위해서는 먼저 소수성 펜을 사용하여 조직 주위에 장벽을 만듭니다. 다음으로, 어둠 속에서 섭씨 37도에서 30분 동안 물에 용해된 5마이크로몰 DHE에서 8미크론 조직 극저온 단면을 배양합니다.

배양 후 실온에서 부드럽게 교반하면서 PBS에서 15분씩 3회 세척합니다. 샘플을 자연 건조시키고 형광을 보호하기 위해 장착 매체 한 방울을 추가합니다. 그런 다음 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 40배 배율로 산화된 에티듐 형광을 관찰합니다.

DSS 치료는 예상대로 질병 활성 지수를 지속적으로 증가시켜 유도 후 7일째에 최대 점수에 도달합니다. 항염증 식단 보충제는 대장염의 조기 발병을 지연시키는 반면, 나중에는 보호 효과가 미미합니다. 식이 중재는 또한 DSS로 인한 장 상피 투과성 증가와 결장 길이 단축을 예방할 수 있습니다.

파라핀이 함유된 원위 결장 조직에 대한 헤마톡실린 및 에오신 염색 결과, 대조군 샘플은 정상적인 형태를 보이는 반면, DSS를 투여받은 동물은 전형적인 대장염 징후를 보이는 것으로 나타났습니다. 주목할 점은 식이 보충제와 병행 치료는 대조군과 유사한 전반적인 형태로 대장염으로 인한 형태학적 변화를 분명히 완화한다는 것입니다. 원위 결장 조직의 면역형광 염색은 또한 DSS로 인한 대장염 동안 밀착 inadherens 접합 분자가 내재화되고 이러한 단백질의 공동 국소화가 crypt 상피 세포 접촉에서 부분적으로 손실됨을 나타냅니다.

중요한 것은 DSS를 투여한 쥐가 항염증 및 항산화 다이어트 보충제를 섭취할 때 이러한 내재화가 감소한다는 것입니다. 또한, DSS에 의한 대장염에 대한 반응으로 결장으로의 강력한 호중구 동원은 식이 보충제에 의해 중화되어 호중구 유발 산화 스트레스가 동시에 개선되고 염증성 사이토카인 생성이 약간 감소합니다. 이 절차에 따라 결장 상피 장벽의 전기 저항을 분석하기 위해 진물 챔버 측정과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 대장염 연구 분야의 연구자들을 위한 길을 열었고 재현 가능한 마우스 모델에서 궤양성 대장염 발병의 분자 메커니즘을 탐구했습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 대장염의 발병을 분석하는 방법과 영양 보충제가 장 상피 장벽 기능에 미치는 유익한 효과를 잘 이해하게 될 것입니다. 살아있는 동물과 함께 일하려면 불필요한 고통을 피하기 위해 높은 윤리적 기준을 준수해야 한다는 것을 잊지 마십시오.