마우스에 유산소 운동에 의해 자식 작용을 활성화

본 실험의 전반적인 목표는 강제 또는 자발적 달리기를 통해 마우스의 자가포식을 생리학적으로 활성화한 후, 특정 조직 내의 자가포식 수준을 측정하는 것입니다. 이 방법은 자가포식에 관한 핵심 질문, 특히 자가포식과 신체 활동이 유산소 운동에 의해 매개되는 유익한 효과에 어떻게 기여하는지를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신체 운동이 마우스를 이용한 인비보(in vivo) 자가포식을 빠르게 유도할 수 있는 유산소적 수단이라는 점입니다.

본 실험에서는 생체 내(in vivo)에서 운동 유도 자가포식을 감지하기 위해 GFP-LC3라는 트랜스 유전자를 보유한 8~12주령의 C57 black six 마우스를 사용합니다. 마우스 트레드밀 사용에 관한 자세한 내용은 다음 JoVE 출판물을 참조하십시오. 트레드밀의 전기 자극 강도를 낮게 설정합니다.

처음 두 번의 세션 동안, 마우스를 10도 경사의 상향 개방형 트레드밀에 적응시킵니다. 첫째 날에는 트레드밀을 8 m/min의 속도로 작동시켜 마우스를 5분 동안 운동시킵니다. 둘째 날에는 마우스를 10분 동안 달리게 하며, 초기에는 8 m/min으로 시작하고 5분 후에 속도를 10 m/min으로 높입니다.

셋째 날에는 마우스를 90분 동안 완전히 달리게 합니다. 트레드밀을 분당 10미터의 속도로 시작하고, 반복적인 전기 충격을 피하기 위해 가볍게 밀어주어 마우스가 달리도록 유도하십시오. 90분간의 주행 동안 마우스가 너무 많은 전기 충격을 받지 않도록 세심하게 관찰하고 조절하는 것이 중요합니다.

실행하는 동안 손가락을 사용하여 마우스가 트레드밀 위에 머물 수 있도록 유도하십시오. 40분 후에는 속도를 1 m/min 더 높입니다. 50분 후에는 다시 속도를 1 m/min 더 높입니다.

60분 후, 속도를 분당 1m 더 높입니다. 70분 후부터는 5분마다 속도를 높여 90분 주행의 마지막 5분 동안은 속도가 17 m/min이 되도록 합니다. 시험이 종료된 후, 필요에 따라 조직 수집을 위해 마우스를 즉시 안락사시킵니다.

본 테스트를 위해 마우스는 개별 사육하십시오. 앞서 설명한 것과 동일한 계통을 사용하십시오. 자전거 속도계가 부착된 직경 11.4 centimeter의 마우스 러닝 휠을 준비하십시오.

각 회전당 이동 거리는 358 millimeters여야 합니다. 휠이 들어 있는 케이지에 마우스를 넣고 2주 동안 자유롭게 사용하게 합니다. 24시간마다 적산 거리계에서 마우스가 달린 거리를 기록하십시오.

2주 후, 필요에 따라 분석을 위한 조직을 수확합니다. 자가포식 흐름(autophagic flux)을 측정하기 위해 3일 동안 자가포식 억제제인 chloroquine을 마우스에 처리합니다. chloroquine을 PBS에 5 mg/mL 농도로 용해하여 50 µg/g 용량으로 마우스의 복강 내에 주사합니다.

마우스에게 3일 연속으로 매일 1회씩 주사하고, 마지막 주사 3시간 후에 조직을 수확합니다. 트레드밀 운동을 하는 마우스의 경우, 3일째 주사 90분 후에 90분간의 달리기를 시작하여 달리기가 주사 후 3시간에 종료되도록 합니다. 그 후 마우스를 안락사시키고 즉시 조직을 수확합니다.

고정액을 준비하여 동물이 운동한 후 90분 이내에 관류할 수 있도록 준비합니다. 30 mL 주사기에 갓 제조한 4% 파라포름알데히드 15~20 mL를 채우고, 20 gauge 카테터 바늘을 주사기에 연결합니다. 충전된 주사기를 펌프에 장착하고 연속 유속을 90 mL/h로 설정합니다.

동물을 깨끗한 작업대 위에 배와 윗면이 위로 향하도록 눕힌 상태에서, 횡격막을 통해 흉강을 절개하여 심장을 노출시킵니다. 그 다음, 카테터 바늘을 우심실에 삽입합니다. 이어서 간에 작은 절개를 가해 혈액을 배출시키고 펌프를 작동시킵니다.

폐와 간이 완전히 창백해질 때까지 고정액을 주입하십시오. 보통 15 milliliters의 고정액이면 충분합니다. 관류 후, 바늘을 제거하고 원하는 조직을 수집하십시오.

골격근을 수집하려면 외측광근을 박리하십시오. 다리의 피부를 뒤쪽으로 살짝 당겨 근육을 노출시키고 대퇴사두근의 위치를 확인합니다. 그런 다음 대퇴골 상단에 부착된 외측 근육인 외측광근을 박리하여 분리합니다.

추가 고정 및 탈수를 위해, 수확한 조직을 4% 파라포름알데히드에 넣고 4°C에서 24시간 동안 보관하십시오. 다음 날, 조직을 15% sucrose PBS로 옮겨 4°C에서 하룻밤 동안 또는 용액 속에 완전히 가라앉을 때까지 담가 두십시오. 그 후, 조직을 30% sucrose PBS로 옮겨 4°C에서 하룻밤 이상 보관하십시오.

이 세척 과정 동안 조직을 가능한 한 어두운 상태로 유지하십시오. 다음으로, 조직을 OCT와 같은 매립제에 넣고 필요한 경우 더 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음, 작은 페트리 접시에서 몇 분 동안 적응하도록 둡니다.

그 후, 샘플을 덮을 수 있을 만큼 충분한 양의 OCT가 들어있는 cryomold로 옮깁니다. 몰드 내에서 절단면이 바닥을 향하도록 배치하고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 그런 다음, OCT가 하얗게 변할 때까지 드라이아이스로 채운 덮개가 있는 스티로폼 쿨러에서 샘플을 동결시킵니다.

이제 개별 샘플을 라벨이 부착된 호일로 감싸고 플라스틱 백에 넣어 밀봉한 뒤, 처리할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오. GFP 태그된 LC3를 리포터 시스템으로 사용하여, 기술된 방식대로 운동을 수행한 마우스에서 오토파지 유도를 관찰하였습니다. 오토파지 자극 후, LC3는 세포질에서 오토파고좀으로 전위되어 점상 구조를 형성하였습니다.

운동을 한 마우스는 휴식 상태의 마우스에 비해 골격근과 대뇌 피질 모두에서 훨씬 더 많은 GFP-LC3 puncta를 나타냈습니다. LC3 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석 결과, 운동이 지질 결합형 LC3-II의 생성을 유의미하게 유도하였으며, 이는 세포질의 LC3-I가 LC3-II로 전환되는 과정이 증가했음을 시사합니다. 다음으로, 오토파지 화물 수용체인 p62의 분해 정도를 측정하였습니다.

90분간의 트레드밀 활동은 휴식 상태보다 골격근 내 p62의 분해를 더 많이 유도했습니다. 이러한 효과는 운동 전 클로로퀸(chloroquine)을 주입함으로써 회복되었습니다. 클로로퀸은 리소좀 분해 억제제이므로, 이러한 데이터는 관찰된 현상이 오토파고좀 분해의 차단이 아니라 증가된 오토파지 flux로 인한 것임을 나타냅니다.

본 기술의 개발 이후, 대사 분해 및 동물 행동에 미치는 운동 기전의 영향을 탐구하기 위해 오토파지(autophagy) 분야에서 선행 연구들이 진행되었습니다. 이 절차를 수행할 때는 생쥐가 달리는 동안 세심하게 모니터링하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 전자 현미경과 같은 분석 방법이 뒤따릅니다.

mitophagy 및 lipophagy와 같은 선택적 자가포식 경로에서 운동의 역할과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 동물 현미경 관찰을 수행할 수 있습니다.