마우스에 유산소 운동에 의해 자식 작용을 활성화

자식 작용의 활성화는 질병의 숫자의 예방에 유용하다. 생리 학적 접근 방법 중 하나는 생체 내에서 자식 작용은 운동이다 유도한다. 여기에서 우리는 유산소 운동으로 자식 작용을 활성화하고 마우스에서 자식 작용의 수준을 측정하는 방법을 보여줍니다.

이 실험의 전반적인 목표는 강제 또는 자발적 달리기를 통해 생쥐의 자가포식을 생리학적으로 활성화한 다음 특정 조직에서 자가포식 수준을 측정하는 것입니다. 이 방법은 자가포식에 대한 주요 질문, 특히 자가포식과 작용이 유산소 운동에 의해 매개되는 유익한 효과에 어떻게 기여하는지에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신체 운동이 마우스를 사용하여 생체 내에서 자가포식 사이에 빠른 유산소 동요라는 것입니다.

이 실험에서는 생후 8주에서 12주 된 C57 블랙 식스 마우스로 시작하여, GFP-LC3로 알려진 생체 내에서 운동 유도 자가포식을 감지하기 위해 트랜스 유전자를 보유하고 있습니다. 마우스 트레드밀 사용에 대한 자세한 내용은 다음 JoVE 간행물을 참조하십시오. 트레드밀의 전기 자극을 낮은 강도로 설정하십시오.

처음 두 세션에서 쥐를 10도 오르막길의 열린 러닝머신에 적응시킵니다. 첫째 날에는 러닝머신이 분당 8미터로 달리는 동안 5분 동안 쥐를 운동시킵니다. 둘째 날에는 처음에는 분당 8미터로 10분 동안 마우스를 달리고 5분 후에는 분당 10미터로 속도를 높입니다.

셋째 날에는 90분 동안 쥐를 작동시킵니다. 분당 10미터의 속도로 러닝머신을 시작하고 반복되는 발 충격을 피하기 위해 부드러운 넛지를 사용하여 쥐가 달리도록 격려합니다. 90분 동안 달리는 동안 너무 많은 전기 충격을 받지 않도록 쥐를 관찰하고 조작하는 것이 중요합니다.

달리는 동안 손가락을 사용하여 쥐가 러닝머신에 머물도록 격려합니다. 40분 후 6분당 1미터씩 속도를 높입니다. 50분 후 다시 분당 1미터씩 속도를 높입니다.

60분 후 분당 1미터씩 속도를 높입니다. 70분이 지나면 5분마다 속도를 높여 90분 달리기의 마지막 5분이 분당 17미터가 되도록 합니다. 임상시험이 끝난 후, 원하는 경우 조직 채취를 위해 마우스를 즉시 안락사시킵니다.

이 테스트의 경우 마우스를 개별적으로 수용합니다. 앞에서 설명한 것과 동일한 변형률을 사용합니다. 자전거 주행 거리계가 부착된 직경 11.4cm의 마우스 러닝 휠을 준비합니다.

각 회전은 358mm의 이동 거리를 측정해야 합니다. 바퀴가 들어있는 케이지로 마우스를 옮기고 2 주 동안 자유롭게 사용하게하십시오. 24시간마다 주행 거리계에서 마우스가 주행한 거리를 기록하십시오.

2주 후, 필요에 따라 분석을 위해 조직을 채취합니다. 자가포식 플럭스를 측정하려면 생쥐에게 자가포식 억제제인 클로로퀸을 3일 동안 투여합니다. 클로로퀸을 PBS에 밀리리터당 5밀리그램으로 용해시키고 그램당 50마이크로그램의 용량으로 복강내 마우스에 주입합니다.

생쥐에게 3일 연속 매일 한 번 주사하고 마지막 주사 후 3시간 후에 조직을 채취합니다. 트레드밀 운동을 한 마우스의 경우, 3일째에 주사 후 90분 후에 90분 달리기를 시작하여 주사 후 3시간 후에 달리기가 끝나도록 합니다. 그런 다음 쥐를 안락사시키고 즉시 조직을 적출합니다.

고정액을 준비하여 운동 후 90분 이내에 동물을 풍성하게 할 준비를 합니다. 30ml 주사기에 15-20ml의 갓 만든 4% 파라포름알데히드를 넣고 주사기를 20게이지 카테터 바늘로 연결합니다. 장전된 주사기 펌프를 부착하고 연속 유량의 시간당 90밀리리터로 설정합니다.

동물을 깨끗한 작업 표면에 놓고 누운 자세로 횡격막을 통해 흉강을 잘라 심장을 노출시킵니다. 이제 카테터 바늘을 우심실에 삽입합니다. 다음으로 간을 작게 절개하여 혈액을 배출하고 펌프를 시작합니다.

폐와 간이 완전히 창백해질 때까지 고정제를 주입합니다. 일반적으로 15ml의 정착액으로 충분합니다. 풍성한 후에는 바늘을 제거하고 관심 조직을 채취하십시오.

골격근을 수집하려면 광대 외측근을 절개하십시오. 다리 피부를 짧게 뒤로 당겨 근육을 노출시키고 대퇴사두근을 국소화합니다. 그런 다음 대퇴골의 상부에 부착된 외부 근육인 광대 외측근을 해부합니다.

추가 고정 및 탈수를 위해 수확된 조직을 4% 파라포름알데히드에 섭씨 4도에서 24시간 동안 놓습니다. 다음날, 조직을 15% 자당 PBS로 옮기고 하룻밤 동안 또는 용액에 침전될 때까지 섭씨 4도에서 담가둡니다. 그런 다음 조직을 섭씨 4도에서 30% 자당 PBS로 하룻밤 또는 그 이상 옮깁니다.

목욕하는 동안 티슈는 가능한 한 어두운 곳에 보관하십시오. 그런 다음 OCT와 같은 포매 매체에 조직을 놓고 필요한 경우 더 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 작은 페트리 접시에서 몇 분 동안 적응시키십시오.

그 후, 커버하기에 충분한 OCT가 있는 cryomolds로 옮깁니다. 금형에서 단면 표면이 바닥을 향하도록 하고 기포가 형성되지 않도록 합니다. 그런 다음 OCT가 하얗게 변할 때까지 드라이 아이스로 채워진 덮개가 있는 폼 쿨러에서 샘플을 얼립니다.

이제 개별 샘플을 라벨이 붙은 호일로 싸서 비닐 봉지에 밀봉한 다음 처리할 수 있을 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. GFP에 태그된 LC3를 리포터 시스템으로 사용하여, 기술된 바와 같이 운동한 마우스에서 자가포식 유도가 관찰되었습니다. 자가포식 자극 후, LC3는 단점 구조에서 세포질에서 자가포식솜으로 전위되었습니다.

운동한 쥐는 휴지 상태 쥐에 비해 골격근과 대뇌 피질 모두에서 더 많은 GFP-LC3 반점을 가지고 있었습니다. LC3 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석은 운동이 지질 접합체 LC3-II의 생성을 유의하게 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 세포질 LC3-I의 LC3-II로의 전환이 증가했음을 시사합니다. 다음으로, 자가포식 화물 수용체(autophagic cargo receptor, p62)의 분해를 측정하였다.

90분의 러닝머신 활동은 휴식 상태보다 골격근의 p62 저하를 더 높게 일으켰습니다. 이 효과는 운동 전에 클로로퀸 주사로 구제되었습니다. 클로로퀸은 리소좀 분해를 억제하기 때문에 이러한 데이터는 관찰된 현상이 자가포식솜 분해의 차단이 아니라 상승된 자가포식액 플럭스(autophogagic flux)에 기인함을 나타냅니다.

개발 후,이 기술은 신진 대사 및 동물 행동의 저하에서 운동 메커니즘에 미치는 영향을 탐구하기 위해자가 포식 분야의 선구자가있었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 마우스가 실행되는 동안 모니터링하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따르는 것은 전기 현미경 검사와 같은 방법입니다.

미토파지(mitophagy) 및 지방파지(lipophagy)와 같은 일부 자가포식 경로에서 운동과 같은 추가 질문에 답하기 위해 동물 현미경 검사를 수행할 수 있습니다.