사이토 반응성 및 확산에서 체 외에 허 혈 성 같은 조건 모니터링

다음 프로토콜은 산소 포도당 결핍 또는 OGD를 수행하기 위해 새끼 쥐의 뇌에서 1차 성상세포를 분리하는 것을 보여주기 위한 것입니다. 정제된 성상세포를 산소포도당이 부족한 환경에 노출시키는 것은 허혈성 뇌졸중에서 발견되는 일부 조건에 대한 반응을 테스트할 수 있는 모듈입니다. 산소에 노출된 후 포도당 결핍을 관찰하고 GFAP와 같은 선택적 성상세포 마커를 사용하여 측정할 수 있습니다.

요약하면, 허혈성 유사 조건에 노출된 이러한 고립된 세포는 저산소성 상태에서 활성화되는 새로운 부분 및 허혈성 뇌졸중을 예방하는 기타 약물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜의 이 부분에서 성상세포는 새끼 쥐 피질에서 분리됩니다. 이 절차의 목적은 산소 포도당 결핍 실험을 수행하기 위한 1차 성상세포 배양을 얻는 것입니다.

이 절차를 위한 재료는 다음과 같습니다.이 절차에서 사용하기 전에 모든 재료를 오토클레이브합니다. 그리고 프로토콜을 시작하기 전에 후드를 최소 20분 동안 자외선에 노출시키십시오. 이 절차를 시작하려면 각 플레이트에 3-5ml의 완전한 DME 매체를 피펫팅합니다.

다음과 같이 나뉘며, 각 쥐의 뇌에 대해 하나, 모든 피질에 대해 두 개, 수막이 없는 모든 피질에 대해 세 개가 될 것입니다. 70% 에탄올로 소독한 후 강아지의 목을 베십시오. 머리 뒤에서 코 쪽으로 절개합니다.

구부러진 집게로 두개골을 제거하고 피질을 노출시키는 소뇌를 부드럽게 긁어냅니다. 핀셋으로 노출된 뇌를 제거하고 미디어가 있는 첫 번째 페트리 접시에 뇌를 놓습니다. 다른 모든 강아지에 대해 이 단계를 반복합니다.

마이크로 절개 겸자의 날카로운 끝으로 정중선 균열을 따라 부드럽게 나누어 대뇌 반구를 분리합니다. 핀셋을 꼬집는 동작으로 백질과 해마를 제거하여 피질을 벗기고 남겨 둡니다. 껍질 피질을 숫자 2라고 표시된 페트리 접시로 옮깁니다.

페트리 접시에서 절개된 모든 피질을 결합하는 모든 뇌에 대해 절차를 반복합니다. 접시를 부드럽게 흔들어 모든 피질 사이에 배지를 균등하게 분배합니다. 박리 현미경을 사용하여 벗겨진 피질을 감싸고 있는 수막을 확인합니다.

수막은 조직을 둘러싼 작은 빨간색 모세혈관을 검색하여 식별할 수 있는 매우 얇고 투명한 층입니다. 피질을 감싸고 있는 수막을 주의 깊게 검사하고 제거한 다음 각 피질의 양쪽에 있는 미세한 핀셋을 사용하여 개별 피질 엽에서 부드럽게 떼어냅니다. 깨끗한 피질을 숫자 3이라고 표시된 새 페트리 접시에 넣습니다.

위 또는 블렌더 방법을 사용한 조직 해리를 위해 깨끗하고 껍질을 벗긴 피질과 페트리 접시의 배지를 멸균 블렌더 백에 붓습니다. 그리고 가방의 총 부피를 5밀리리터로 끌어올리기에 충분한 매체를 추가합니다. 가방을 stomacher 80에 넣고 닫힌 문 위로 가방의 약 2cm를 보이게 합니다.

이 기기의 세포 해리는 고속으로 2.5분 후에 수행됩니다. 또는 멸균 백을 닫고 조직 입자가 미세한 현탁액이 될 때까지 후드에 있는 비커로 조직을 부드럽게 두드려 조직 해리를 할 수 있습니다. 마찰 및 가방 파손을 방지하기 위해 가방과 비커 사이에 천을 사용하십시오.

셀 현탁액을 메쉬 번호 60으로 슬리브 중앙에 붓습니다. 필터링된 셀을 메쉬 번호 100의 중간에 부어 중력에 의해 필터링되도록 합니다. 여과된 세포 현탁액을 원뿔형 15ml 튜브에 붓습니다.

센터 퓨지, 200배 G로 셀 서스펜션을 센터 퓨지에서 5분 동안 스윙 버킷 라우터를 사용하는 것이 바람직합니다. 상등액을 제거하고 비커에 버립니다. 셀 팔레트에 완전히 새로운 미디어를 추가합니다.

혈청학적 피펫을 사용하여 최대 5ml의 배지에서 세포 팔레트를 재현탁 및 해리합니다. 플라스크에 원하는 양의 세포 현탁액을 추가하고 배지로 완성합니다. 다시 suspended 팔레트를 medium으로 플라스크에 추가합니다.

플라스크 전체에 세포를 고르게 분포시키고 이산화탄소 5%가 함유된 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 3일마다 미디어를 교체하는 것을 잊지 마십시오. 다음 방법론은 통제된 환경에서 세포의 산소와 포도당을 박탈하기 위한 것입니다.

이 모델의 목적은 허혈성 유사 뇌졸중 상태에서 성상세포의 반응을 연구하는 것입니다. 이 절차에 사용되는 재료는 가스 시스템에 연결된 혈청학적 피펫을 삽입하여 포도당이 없는 매체를 퍼지하는 것입니다. 분당 10-15 리터의 흐름으로 10 분 동안 가스 혼합물로 용액을 거품을 일으

10분이 지나면 OGD 매체의 pH를 7.4로 조정합니다. 50 밀리리터 튜브 필터 시스템을 사용하여 퍼지된 포도당이 없는 매체를 여과합니다. 모든 실험에 대해 항상 새로운 OGD 배지를 만드는 것이 중요합니다.

이렇게 하면 매체에서 산소가 제거됩니다. 성상세포 배지를 제거하고 세포 PBS로 2회 세척하여 세포에서 포도당을 제거합니다. 웰에 OGD 매체를 추가합니다.

뚜껑을 연 상태로 멀티 웰 접시를 저산소증 챔버 내부에 놓습니다. 가스 혼합물을 입구 밸브에 연결하고 출구 밸브를 열어 두십시오. 가스 혼합물로 챔버를 분당 10-15 리터로 5-7 분 동안 세척합니다.

가스 흐름을 중지하고 먼저 출구 밸브의 클램프를 닫습니다. 그런 다음 가스 입구 밸브 튜브의 클램프를 닫습니다. 저산소 챔버를 OGD에서 원하는 시간 동안 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다.

배양 시간이 끝난 후 OGD 배지를 흡인하고 정상 산소 상태를 위해 세포에 완전한 DMEM을 조심스럽게 첨가합니다. 세포를 배양 인큐베이터로 되돌려 놓고 0, 24시간 및 48시간 동안 정상 산소 조건을 유지합니다. 이 프로토콜은 신생아 쥐 피질에서 성상 세포를 분리하는 방법을 설명합니다.

1차 배양물의 순도를 검증한 후 OGD 실험을 수행했습니다. 이 허혈성 유사 모델에서는 포도당 및 산소 결핍이 보다 많은 병학적 변화를 유도했으며, GFAP와 같은 성상세포 마커 또는 PCNA와 같은 증식 마커를 사용하여 면역 형광으로 모니터링했습니다. 이 모델의 장점 중 하나는 특정 세포 유형 반응을 연구할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 한계는 성상세포의 격리로 인해 세포 간 상호 작용이 부족하다는 것입니다. 이러한 한계를 극복할 수 있는 가능한 방법 중 하나는 성상세포를 다른 세포 유형 또는 공동 배양에서 컨디셔닝 배지에 노출시키는 것입니다. 요약하면, 고립된 세포 시스템에서의 산소 포도당 결핍 방법을 사용하면 다양한 신경 보호 또는 신경독성 분자의 영향을 직접 테스트할 수 있습니다.

또한 성상세포 생물학을 연구하는 데 유효한 도구입니다. 마지막으로, 이 모델은 생체 내 모델을 사용하여 실험 조건에서 개발 약물을 연구하기 위한 강력한 기반을 설정합니다.