생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석
2016년 12월 28일
여기에서는 생리학적 산소 상태에서 mRNA의 5' 캡을 결합하는 번역 시작 인자를 분석하기 위한 인간 세포 배양 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 아가로스 연결 m7GTP 캡 아날로그를 사용하며 캡 결합 인자 및 이들의 상호 작용 파트너를 조사하는 데 적합합니다.
이 실험의 전반적인 목표는 산소가 적은 조건에서 캡 결합 단백질을 포착하는 것입니다. 이 방법은 아가로스로 연결된 7개의 메틸-구아노신 캡 유사체를 사용하여 캡 결합 인자와 이들의 상호 작용 파트너를 조사합니다. 이 방법은 캡 의존성 번역과 관련된 새로운 산소 조절 인자 식별과 같은 단백질 합성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다.
이 기술의 주요 장점은 세포가 용해 시점까지 저산소증 워크스테이션에 보관된다는 것입니다. 이 기술의 의미는 암 치료로 확장되는데, 이는 종양 내의 암세포가 매우 낮은 수준의 산소에 노출되고 번역 조절이 종양 진행에 중요한 역할을 하기 때문입니다. 우리는 코로나의 동료들이 최근 발표한 논문에서 조직 산소화가 실제로 세포가 일상적으로 배양되는 노멀시아(normaxia)보다는 저산소증(hypoxia)에 더 가깝다고 보고한 논문을 읽었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.
이 절차를 시작하면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양이 이루어집니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수한 후 15밀리리터의 완전한 배지를 포함하는 150mm 배양 접시를 공급하여 제곱센티미터당 2500 - 5000개의 세포 밀도를 얻습니다. 각 캡 결합 분석에 대해 두 개의 150mm 접시를 사용합니다.
파종된 배양 접시를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소 대기의 인큐베이터에 놓습니다. 세포가 최소 24시간 동안 배양된 후 원하는 시간 동안 세포를 저산소증 워크스테이션에 놓습니다. 그런 다음 워크스테이션을 적절한 physioxia로 설정합니다.
1개의 X 인산염 완충 식염수(PBS)와 트립신을 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 예열합니다. 980마이크로리터의 용해 완충액을 1.5마이크로리터 원심분리기 튜브에 분취하여 각 캡 결합 분석을 수행합니다. 100X 프로테아제 억제제 칵테일 10마이크로리터와 4-벤젠설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드 10마이크로리터를 얼음 위의 980마이크로리터 용해 완충액에 주입합니다.
각 150mm 접시의 매체를 저산소증 워크스테이션 내의 쓰레기통에 버리십시오. 그런 다음 3-4 밀리리터의 따뜻한 1 X PBS로 세포를 씻고 액체를 버립니다. 각 접시에 따뜻한 05% 트립신 EDTA 1ml를 넣고 접시를 2분 동안 또는 세포가 더 이상 접시에 달라붙지 않을 때까지 그대로 두십시오.
피펫을 사용하여 한 플레이트의 셀을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 필요에 따라 반복하여 각 세포 플레이트가 별도의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 이동하도록 합니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 6000회 g에서 90초 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
원심분리 후 펠릿을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 트립신을 흡입합니다. 펠릿 바로 위의 튜브에 PBS 200마이크로리터를 부드럽게 피펫으로 넣어 따뜻한 One X PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 PBS를 흡입합니다.
다음으로, 1 밀리리터에서 500 마이크로 리터를 피펫으로 준비한 용해 완충 용액을 첫 번째 세포 펠릿에 투입합니다. 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 완전히 다시 매달아 놓습니다. 다시 부유한 셀을 두 번째 세포 펠릿과 결합하고 위아래로 피펫팅하여 두 번째 펠릿을 다시 현탁합니다.
모든 펠릿이 결합되고 각 샘플에 대해 다시 현탁될 때까지 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 1.5리터 마이크로 원심분리기 튜브에 용해물을 나머지 500마이크로리터의 용해 완충액과 결합합니다. 저산소증 워크스테이션에서 샘플을 제거합니다.
샘플을 섭씨 4도에서 1.5-2시간 동안 회전시켜 부드러운 교반을 사용하여 세포를 용해합니다. 배양 후 용해된 세포를 섭씨 4도에서 15분 동안 1200배 g으로 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 용해물을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.
웨스턴 블롯 분석을 위한 전체 세포 용해물 입력 제어로 사용할 상등액의 일부를 예약합니다. 캡 결합 분석을 준비하려면 가위를 사용하여 피펫 끝을 제거하여 비드 슬러리를 쉽게 수집할 수 있습니다. 각 샘플에 대해 50마이크로리터의 블랭크 아가로스 비드 제어 슬러리와 50마이크로리터의 m7GTP 아가로스 C10 연결 비드 슬러리를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 분리합니다.
그런 다음 슬러리를 500배 g에서 30초 동안 원심분리하여 비드를 펠릿화합니다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 500마이크로리터의 TBS에 비드를 다시 현탁시킵니다. 이 단계를 반복한 후 500배 g에서 30초 동안 비드를 펠릿화하고 상층액을 제거합니다.
다음으로, 용해물을 포함하는 상등액을 빈 아가로스 비드가 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 부드럽게 저어 배양합니다. 10분 후, 500배 g에서 30초 동안 원심분리하여 빈 아가로스 비드를 펠렛
화합니다.원심분리 후 비드에 결합하지 않는 용해물을 m7GTP 아가로스 C10 연결 비드가 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 500마이크로리터의 용해 완충액에 비드를 다시 현탁시키고, 500시간 g에서 30초 동안 원심분리하여 비드를 펠릿화한 후 상등액을 버려 빈 아가로스 비드를 세척합니다. 이것을 네 번 반복하여 총 5회 세탁합니다.
빈 아가로스 비드를 하나의 X SDS-PAGE 샘플 버퍼에 다시 현탁합니다. 그리고 구슬을 섭씨 95도에서 90초 동안 끓입니다. 향후 웨스턴 블롯 분석을 위해 샘플을 섭씨 20도에서 보관하여 관심 단백질이 비드에 비특이적으로 결합하는 날씨를 관찰합니다.
m7GTP 아가로스 C10 연결 비드로 용해물을 섭씨 4도에서 1시간 동안 부드럽게 교반하여 캡슐화하여 캡 결합 단백질을 포착합니다. 교반 후 m7GTP 아가로스 C10 연결 비드를 500배 g에서 30초 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 상층액을 버린 후 m7GTP 아가로스 C10 연결 비드를 이전과 같이 세척합니다.
600마이크로리터의 용해 완충액에 비드를 다시 현탁시키고 GTP를 최종 농도인 1밀리몰에 추가합니다. m7GTP 아가로스 C10 연결 비드와 1밀리몰 GTP를 섭씨 4도에서 1시간 동안 부드럽게 교반하여 배양합니다. 이것은 m7GTP와 비특이적으로 상호 작용하는 단백질을 해리시킵니다.
m7GTP 아가로스 C10 연결 비드를 500 시간 g에서 30초 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 상층액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 200마이크로리터의 4개의 S SDS-PAGE 샘플 버퍼를 추가합니다. 이전과 같이 비드를 세척한 후 하나의 X SDS-PAGE 샘플 버퍼에 비드를 다시 매달고 섭씨 95도에서 90초 동안 끓입니다.
여기에 표시된 것은 일차 인간 신장 근위세뇨관 상피 세포의 산소 변동에 반응하여 두 가지 주요 캡 결합 단백질의 전형적인 m7GTP 친화성 정제의 대표적인 웨스턴 블롯입니다. 세포 용해물은 24시간 동안 8%, 5%, 3% 또는 1%의 산소에 노출되었습니다. 레인에는 전체 세포 용해물의 10%가 입력으로 포함되고, m7GTP에 대한 특이성을 측정하기 위해 세척된 GTP, GTP 세척 후 m7GTP 비드에 결합된 단백질이 포함됩니다.
적어도 3개의 독립적인 실험에서 얻은 데이터를 이미지 J로 정량화하고 전체 세포 용해물의 10% 입력에 대한 상대 밀도 단위로 표현했습니다. 결과는 생리학적 산소 하에서 배양된 인간 세포가 두 개의 캡 결합 단백질을 사용하여 번역을 위해 별개의 mRNA를 모집한다는 것을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 저산소 조건에서 캡 결합 단백질을 포획하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 절차를 시도하는 동안 산소가 이러한 번역 시작 인자의 생화학적 특성을 빠르게 변화시킬 수 있으므로 용해 시점까지 세포를 저산소증 워크스테이션에 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 폴리솜 분획과 같은 다른 방법을 수행하여 저산소 조건에서 어떤 캡 결합 단백질이 활성 번역과 연관되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.
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개요
이 기사는 저산소 조건에서 mRNA의 5' 캡에 결합하는 번역 개시 인자를 분석하는 방법을 제시합니다. 아가로스 연결 m7 GTP 캡 아날로그를 이용하여 이 기술은 캡 의존적 번역에 관여하는 새로운 산소 조절 인자를 식별하는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 단백질 합성
배경
- 캡 결합 단백질은 번역 개시에서 중요한 역할을 합니다.
- 종양 내 세포는 종종 저산소 조건을 경험합니다.
- 저산소 조건에서의 번역을 이해하는 것은 암 치료에 유익할 수 있습니다.
- 최근 연구에 따르면 조직의 산소화는 정상 산소화보다 저산소에 더 가깝다는 것을 시사합니다.
연구 목적
- 저산소 조건에서 캡 결합 단백질을 포획합니다.
- 캡 결합 인자와 그 파트너의 상호작용을 조사합니다.
- 저산소 조건에서 번역을 조절하는 새로운 인자를 식별합니다.
사용된 방법
- 아가로스 연결 m7 GTP 캡 아날로그의 사용.
- 세포 분열까지 저산소 작업대에서 세포 배양.
- 통제된 산소 수준에서의 단백질 상호작용 분석.
- 암 세포에서의 번역 조절 연구에 방법을 적용합니다.
주요 결과
- 저산소 조건에서 캡 결합 단백질의 성공적인 포획.
- 번역에 관여하는 새로운 산소 조절 인자의 식별.
- 종양 진행에서 번역 조절의 역할에 대한 통찰.
- 단백질 합성 연구에 대한 방법의 효과성 검증.
결론
- 이 방법은 번역 개시 인자를 연구하는 새로운 접근법을 제공합니다.
- 연구 결과는 암 생물학 이해에 영향을 미칠 수 있습니다.
- 추가 연구는 저산소 종양을 타겟팅하는 치료 전략을 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Understanding oxygen-dependent regulation of translation initiation is critical for de-risking oncology targets, as tumor microenvironments exhibit physiological oxygen levels that alter cap-dependent protein synthesis. This method enables identification of oxygen-sensitive cap-binding proteins, supporting mechanistic validation of translation factors in disease-relevant systems. By preserving native oxygen conditions during sample preparation, the approach enhances predictive confidence in target validation and assay development for hypoxic disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating cap-binding proteins under physioxia conditions that mimic human tissue oxygenation.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for validating oxygen-regulated translation factors as potential drug targets in cancer biology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative binding data for cap-dependent translation factors across oxygen gradients, enabling assay standardization for target engagement studies.
- Operational Value: Supports development of oxygen-controlled biochemical assays to screen modulators of translation initiation in physiologically relevant conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking oxygen-sensitive cap-binding proteins to translational control in disease-relevant primary human cells.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by maintaining hypoxic conditions throughout sample processing, reducing artifactual target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing oxygen-regulated biochemical readouts that inform target selection and lead identification in oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of oxygen-dependent translation initiation by capturing cap-binding proteins under controlled physioxia.
- Screening: Enables assay readiness through standardized capture and elution of m7GTP-binding proteins under low oxygen conditions.
- Analytics: Generates quantitative western blot outputs to compare cap-binding protein abundance across oxygen levels, aiding comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using primary human renal proximal tubule epithelial cells as a disease-relevant system for oxygen-regulated translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying oxygen-sensitive RNA-binding proteins across multiple target classes beyond translation factors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in oxygen-sensitive translation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization by requiring hypoxia workstation use for cell culture, lysis, and biochemical steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets whose activity is confounded by standard normoxic culture conditions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets in hypoxic disease areas through oxygen-controlled biochemical validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hypoxic cell culture and biochemical assay execution within controlled atmosphere workstations.
- Dependent on access to hypoxia workstations for maintaining physioxia during cell handling and sample preparation.
- Necessitates standardization of oxygen levels and equilibration times across laboratories for reproducible cap-binding protein recovery.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-adherent or primary cell types with varying oxygen sensitivity.
- Limited by potential loss of cap interactors that require second-base interactions or m7GTP hydrolysis, as noted in the protocol.
