Name: 생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 학습하세요 저산소 조건에서 캡 결합 단백질을 포착하는 방법을. 아가로스 연결 m7GTP 캡 아날로그를 사용하여 번역 개시 인자와 상호작용 파트너를 분석하고, 암 세포의 번역 조절 메커니즘을 규명합니다.

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이 작업은 캐나다 자연과학 및 공학 위원회(Natural Sciences and Engineering Council of Canada)와 온타리오 연구 혁신부(Ontario Ministry of Research and Innovation)의 지원을 받았습니다.

세포 배양 1. 준비 <ol><li> 인간 세포의 시판 주식을 구입합니다. 참고 :이 프로토콜은 HCT116의 대장 암 및 기본 인간의 신장 근위 관 상피 세포 (HRPTEC)를 사용합니다. </li><li> 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) 7.5 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)로 보충 / 높은 포도당 매체 HCT116의 문화를 500 ml의 배지를 확인합니다. </li><li> 5 % FBS, 1 % 상피 세포 성장 보충제로 보충 상피 세포 매체와 1 % P / S : 500 ml의 HRPTEC의 문화 매체합니다. </li><li> 140 mM의 NaCl을, 3 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 15 mM의 KH 2 PO 4 : 1 배 인산염 완충 식염수 (PBS)의 500 ml의를 준비합니다. 7.4으로 산도를 조정하고 121 ℃에서 40 분간 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li></ol> 세포 배양 2. 개시 <ol><li> 조심스럽게 t을 방해하지 않고 80-90% 합류 요리에서 매체를 대기음그는 세포. </li><li> 배양 접시 당 1X PBS의 나누어지는 3 ~ 5 ㎖를 부드럽게 코팅 접시의 표면적을 각 플라스크 바위, 조심스럽게 1X PBS를 대기음. 두 번째 1X PBS 세척을 반복합니다. </li><li> (3) 각각의 배양 접시에 0.05 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)의 용액 부드럽게 고르게 코팅 트립신 EDTA로 세포를 록 나누어. 2 ~ 3 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 90 초 동안 4,000 XG에 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기로 분리 된 세포를 전송합니다. </li><li> 완전 DMEM 1 ㎖에 재현 탁 된 세포 펠렛. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 2 cm 당 약 2,500-5,000 세포의 초기 접종 농도를 달성하기 위해 요구되는 개수 비 발열 폴리스티렌 100mm 세포 배양 접시 계산한다. </li><li> 단계 30-45 분 동안 37 ° C의 수조에서 1.2 또는 1.3으로 만든 전 따뜻한 전체 세포 배양 배지. </li><li> 70 % 에탄올로 세포 배지 병 및 바이알의 오염을 제거. 앞으로 모든이 시점에서조작은 무균 적으로 수행해야합니다. </li><li> 분취 단계 2.6에서 언급 파종 밀도에서 냉동 된 세포의 전체 볼륨을 사용하기 위해 필요한만큼 100mm 세포 배양 접시에 완전 DMEM 6 용액. </li><li> 100 밀리미터 문화 요리의 각 단계 2.6에서 계산 된 세포 현탁액의 볼륨을 전송합니다. 균일 판의 표면 위에 세포를 분산 수동 각 플레이트 락. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터에서 시드 100mm 세포 배양 접시를 놓습니다. 세포가 다음 단계 전에 적어도 24 시간을 배양 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 계대 배양 <ol><li> 세포 생장의 비율 (접시의 면적 % 셀)을 결정하기 위해 현미경 각 세포 배양 접시보기. 인큐베이터 및 사전 따뜻한 전체 매체와 1X PBS로 세포를 돌려줍니다. 세포가 80-100% 합류하는 경우 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 조심스럽게을 방해하지 않고 보낸 매체를 대기음각각의 배양 접시에 세포. </li><li> 배양 접시 당 1X PBS의 나누어지는 3 ~ 5 ㎖를 부드럽게 코팅 접시의 표면적을 각 플라스크 바위, 조심스럽게 1X PBS를 대기음. 두 번째 1X PBS 세척을 반복합니다. </li><li> 나누어지는 3 각 배양 접시에 0.05 % 트립신 EDTA ml의 부드럽게는 바위 고르게 코트 트립신 EDTA로 세포에. 2 ~ 3 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 이 인큐베이션 동안 분취 많은 배양 접시에 완전 배지 10 ㎖를 2 cm 당 2,500-5,000 세포의 세포 밀도를 얻기 위해 요구된다. </li><li> 세포를 플레이트로부터 분리되면 빠르게 정의 1X 트립신 억제제 3를 가하여 가볍게 트립신 EDTA 전부가 중화되었는지 확인 1 분 동안 요리 소용돌이 친다. </li><li> 멸균 15 ㎖의 원심 분리 관으로 분리 된 세포를 전송하고 따로 설정합니다. 남아있는 세포를 수집, 같은 15ml의 원심 분리기 튜브에 그것을 전송 접시에 PBS 1X 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 150 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠렛5 분. </li><li> 뜨는을 대기음 및 전체 매체의 3 ml의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 혈구 계를 사용하여 세포를 세어 2 cm 당 2,500-5,000 세포의 세포 밀도를 얻을 완전 배지 15ml를 함유 150mm 배양 접시 시드. 각각의 캡 결합 분석을 위해 두 개의 150mm를 사용합니다. 참고 : 액체 매체를 통해 세포에 산소 확산 볼륨 (36)에 따라 달라집니다. 서스펜션 부착 세포 또는 세포가 사용되는지 여부를 실험과 일치하는 미디어의 볼륨을 유지하도록 권장한다. 미디어 확산에 이러한 가변성을 피하기 위해 (토론에서 논의 된 바와 같이 24 시간 동안 워크 스테이션에서 배양) 미리 조절 될 수있다. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터에서 시드 배양 접시를 놓습니다. 세포가 다음 단계로 진행하기 전에 적어도 24 시간을 배양 할 수 있습니다. </li></ol> 4. Physioxic 노출 <ol><li> 현미경으로 세포를 볼 수 있습니다. 포브스t 결과, 세포는 24 시간 노출 70-80 %의 합류, 48 시간 노출 50 ~ 60 %의 합류 및 72 시간 노출에 대한 40~50% 합류를되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 원하는 시간 (24, 48, 또는 실험에 따라 72 시간)에 대한 저산소증 워크 스테이션에 세포를 놓습니다. </li><li> 해당 physioxia에 워크 스테이션을 설정합니다. 참고 : 예를 들어, 3 % O 2 설정이 5 % CO 2 및 92 % N이 수반 될 것이다. 참고 : 동적 범위 내에서 산소 변동이 악기로 특정 타임 라인, 프로그램 일정을 통해 원하는 또는 수동으로 원하는 간격으로 산소 설정을 조정하는 경우. </li><li> 60 %의 습도를 설정합니다. 워크 스테이션의 분위기는 그럼에도 불구하고 매우 건조하고, 미디어는 눈에 띄게 긴 실험 (&gt; 48 시간) 동안 증발됩니다. (미디어 스테이션 분위기로 평형화되도록) 세포 배양 DIS에 용지를 보충하기 위해 워크 스테이션 내에서 세포 배양 플라스크 내의 미디어 보유 유지HES. 참고 : 용존 산소가 대기 중 산소 36 평형을하도록 (예 : PBS와 트립신 EDTA)를 용해하기 전에 세포와 상호 작용하는 모든 솔루션은 저산소증 워크 스테이션에서 사용하기 전에 24 시간 동안 미리 조절해야합니다. </li><li> 용해 될 때까지 워크 스테이션 내에서 세포를 유지합니다. </li></ol> 캡 결합 분석 5. 준비 버퍼 <ol><li> 1X TBS 버퍼 (TBS)을 준비합니다. <ol><li> DH 2 O의 800 ㎖에, 8.76 g의 NaCl 및 6.05 g 트리스베이스를 해산. </li><li> 1 M 염산을 사용하여 7.4의 최종 pH의 용액을 준비한다. </li><li> DH 2 O를 사용하여 1 L로 최종 볼륨을 가져와 </li></ol></li><li> 비 변성 용해 버퍼를 준비한다. 캡 결합 분석의 일을 버퍼에 용해 준비합니다. 빈 아가로 오스 비즈와 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬 (7.9 및 7.13 단계) 씻어 추가 용해 버퍼를 확인합니다. <ol><li> DH 2 O 7 ㎖에 160 ㎕의 5 M NAC를 추가L, 160 ㎕의 1 M 트리스 -HCl pH 7.4의 40 ㎕의 200 mM의 NaF로부터 40 ㎕를 1 M의 MgCl 2, 40 ㎕의 1 mM의 나트륨 오르토 바나 데이트. </li><li> 7 ml의 용액에이게 팔의 40 μl를 추가합니다. 그것은 매우 점성으로이게 팔을 검색 할 수 있도록 피펫의 끝을 잘라. </li><li> 이게 팔이 모두 용해 될 때까지 최대 피펫 아래로, 또는 소용돌이에 의해 7 ml의 솔루션을 섞는다. </li><li> (8) 용액에 용액의 최종 부피를 올리고 얼음에 보관. </li></ol></li><li> 배 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) -page 샘플 버퍼를 준비합니다. <ol><li> 비이커에서 16 ml의 1 M 트리스 - 염산의 pH 6.8, 12.64 ml의 글리세롤, 8 ml의 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 결합합니다. </li><li> SDS 3.2 g 및 브로 모 페놀 블루의 0.16 g을 추가합니다. 분말이 완전히 자기 교반 막대와 혼합하여 용해 할 수 있습니다. </li><li> -20 ° C에서 1.5 ml의의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는 및 저장. </li></ol></li></ol> 6. 세포 용해 <ol><li> 비 변성 용해 버퍼를 준비하고 얼음에 일의 일을 계속전자의 캡 결합 분석을. </li><li> 30 분 동안 37 ° C를 물을 욕조에 1X PBS 사전 따뜻하고 트립신. </li><li> 각각의 캡 결합 분석을위한 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 용해 버퍼의 나누어지는 980 μl를 수행된다. </li><li> 용해 완충액 980 μL에 4- (2- 아미노 에틸) 벤젠 설 포닐 플루오 라이드 하이드로 클로라이드 10 μL 및 100X 프로테아제 저해제 칵테일의 10 μL를 추가한다. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 저산소증 워크 스테이션 내에서 폐기물 용기에 각각 150mm 접시에서 미디어를 폐기하십시오. </li><li> 따뜻한 1X PBS의 3-4 ml의 세포를 세척하고 액체를 모두 폐기합니다. </li><li> 각각의 접시에 따뜻한 0.05 % 트립신 EDTA 1 ㎖를 추가하고 2 분 동안 또는 세포가 더 이상 판에 부착 될 때까지 앉아 보자. </li><li> 피펫을 사용하여, 1.5 ml의 microcentrifuge 관 한 판의 세포를 전송합니다. 세포의 각 플레이트는 별도의 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전송되도록 필요에 따라 반복합니다. </li><li> 90 초 t 6,000 XG에 1.5 ml의의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리기오 세포 펠렛. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 트립신을 대기음. 펠렛은 90 초 동안 6,000 XG에서 다시 원심 분리기 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 방해합니다. </li><li> 부드럽게 단지 펠렛 위의 튜브에 PBS 200 μl를 피펫 팅하여 따뜻한 1X PBS로 세포를 씻으십시오. 다시 원심 분리기 펠렛을 방해합니다. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 PBS를 대기음. </li><li> 1 ml의 피펫으로부터 500 μL가 첫번째 세포 펠렛에 용해 완충 용액을 준비했다. 로 pipetting 아래로 완전히 펠렛을 재현 탁. </li><li> 두 번째 세포 펠렛으로 재현 탁 세포를 결합하고로 pipetting 아래로 두 번째 펠렛을 재현 탁. 모든 펠릿이 결합 된 각각의 샘플에 대한 재현 탁 될 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 용해 버퍼의 나머지 500 μL와 해물을 결합한다. </li><li> 저산소증 워크 스테이션에서 샘플을 제거합니다. 주 : 용해 완충액을 첨가 후,LL 후속 단계는 저산소증 워크 스테이션은 37 ° C로 설정하고, 다음 단계 냉 (4 ℃ 또는 빙상에서) 수행 될 수있는 바와 같이 대기에서 수행되어야한다. </li><li> 를 Lyse 1.5-2 시간 동안 39 ° C에서 샘플들을 회전시킴으로써 교반과를 이용하여 세포. </li><li> 세포 파편을 제거하기 위해 4 ° C에서 15 분 동안 12,000 XG에서 분해 된 세포를 원심 분리기. </li><li> 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 해물을 전송하고 펠렛을 폐기합니다. </li><li> 상층 액의 일부 (~ 10 %)가 미래 웨스턴 블롯 분석을 위해 전체 세포 용 해물 입력 제어로서 사용되는 예비. </li></ol> 7. 캡 결합 분석 <ol><li> 각 샘플에 대해, 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브를 블랭크 아가 로스 비드 제어 슬러리의 50 μL와 γ 아미노 - m 7 GTP 아가 C10 결합 비드 슬러리의 50 μl를 옮긴다. 비드 슬러리의 수집을 용이하게하기 위해 피펫의 팁을 제거하기 위해 가위를 사용합니다. </li><li> 구슬의 B 펠렛Y는 30 초 동안 500 XG에 슬러리를 원심. </li><li> 조심스럽게 상층 액을 제거하고 TBS의 500 μL의 비드를 재현 탁. </li><li> 반복 7.2 및 7.3 단계를 반복합니다. 30 초 동안 500 XG에 구슬을 펠렛과 뜨는을 제거합니다. </li><li> 빈 아가 로스 비드를 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 6.19 단계에서 용 해물을 포함하는 상등액을 전송. 주 : 빈 아가 로스 비드 비특이적 비드와 상호 작용 해물로부터 단백질을 제거하기 전 지우기 단계로서 작용한다. </li><li> 부드러운 교반과 함께 4 ° C에서 10 분 동안 품어. </li><li> 30 초 동안 500 XG에 원심 분리하여 빈 아가 로스 비드 펠렛. </li><li> γ 아미노 - m 7 GTP 아가 C10 결합 된 비드를 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 해물을 전송. </li><li> , 용해 완충액 500 μL의 비드를 재현 탁 30 초 동안 500 XG에 원심 분리하여 구슬을 펠렛 및 superna을 버리고 빈 아가로 오스 구슬을 씻으십시오중대장. 오 세척 총이 네 번 반복합니다. </li><li> 1X SDS-PAGE 샘플 버퍼에 빈 아가 로스 비드를 재현 탁하고, 95 ℃에서 90 초 동안 비드를 끓인다. 미래의 웨스턴 블롯 분석을 위해 -20 ° C에서 보관 관심의 단백질이 구슬 비 - 특이 적으로 결합 여부를 관찰합니다. </li><li> 캡 - 결합 단백질을 캡처 4 ° C에서 1 시간 동안 교반과 함께 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬과 해물을 품어. </li><li> 30 초 동안 500 XG에 원심 분리하여 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬 펠렛. 상층 액을 버린다. </li><li> 단계 7.9을 반복하여 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬을 씻으십시오. </li><li> 용해 완충액 600 μL의 비드를 재현 탁. </li><li> 최종 농도 1 mM GTP에 추가. </li><li> 4 ℃에서 1 시간 동안 교반과 함께 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬 + 1 ㎜ GTP를 품어. 참고 :이를비특이적 m 7 GTP와 상호 작용하는 단백질을 해제한다 (즉,도 비 메틸화 GTP와 상호 작용). </li><li> 30 초 동안 500 XG에 원심 분리하여 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬 펠렛. </li><li> 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 상청을 전송 및 4X SDS-PAGE 샘플 완충액 (50 mM Tris-HCl, 100 mM의 DTT, 2 % SDS, 블루 0.1 % 브로 모 페놀 및 10 % 글리세롤) 200 μL를 추가한다. 미래의 웨스턴 블롯 분석 37 -20 ° C에서 GTP 제어 샘플을 저장합니다. 단계 7.9를 반복하여 구슬을 씻으십시오. </li><li> 90 초 동안 95 ℃에서 1X SDS-PAGE 샘플 완충액 (50 mM Tris-HCl, 100 mM의 DTT, 2 % SDS, 블루 0.1 % 브로 모 페놀 및 10 % 글리세롤) 및 종기에 비드를 재현 탁. 미래의 웨스턴 블롯 분석 37 -20 ° C에서 m 7 GTP 결합 된 부분을 저장합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포 캡 결합 단백질의 분석은 신규 산소 조절 번역 개시 인자의 확인을 허용 할 수있다. mRNA의 캡 또는 다른 관련 단백질의 5 &#39;캡 이러한 요소의 선호도가 7 m 그들의 관계의 강도에 의해 측정 될 수 아가 로스 비드 GTP 결합. 이 기술의 한 가지주의는 단백질 분해 이후의 캡 결합 전위를 측정하지만,이 단백질 - 단백질 상호 작용과 번역 후 변형 (PTMS)을 유지하는 비 - 변성 조건 하에서 수행된다는 것이다. 여러 단백질 - 단백질 상호 작용는 5 &#39;캡에 eIF4E를 가족의 결합을 중재. 4E-BP는 결합 및 eIF4G과의 상호 작용을 차단하고 38 복잡한 사전 개시 43S의 채용을 방지하여의 eIF4E을 억압. 의 eIF4E / 4E-BP 단지는 성적 증명서에서 모든 개시를 차단, 5 &#39;mRNA의 캡에 결합 남아 있고, 수m 7 GTP 친 화성 컬럼에서의 eIF4E 억제 마커로 사용 될 수있다. 반대로...

번역 컨트롤은 특히 세포 스트레스 일의 기간 동안, 유전자 발현의 전사 조절에 동등하게 중요한 단계로 부상하고있다. 번역 제어의 초점은 단백질 합성의 첫 번째 단계는 7 methylguanosine에 진핵 개시 인자 4E (eIF4E에)의 결합을 포함 개시의 속도 제한 단계 (m 7 GTP)의 mRNA 2의 5 &#39;캡에있다 . 의 eIF4E는 eIF4A, RNA 헬리 카제 및 eIF4G, 다른 번역 요인과 40S는 3 리보솜의 채용에 필요한 비계 단백질을 포함 eIF4F라는 이름의 삼량 체 복합체의 일부입니다. 정상적인 생리 조건에서의 mRNA의 대부분은 모자에 의존하는 메커니즘을 통해 번역되어 있지만, 세포 스트레스의 기간에 따라 인간의 mRNA의 약 10 %는 1,4 intiation 모자 독립적 인 번역을 허용 할 수있는 5 &#39;의 UTRs가 포함되어 있습니다. 모자 종속 번역은 역사적으로 동의어있다OU에 eIF4F으로, 그러나, eIF4F의 스트레스 별 변화는 추세 주제 5-8이되었다. 다양한 세포 응력의 eIF4E 활성이 라파 마이신 복합체 1 (mTORC1)의 포유 동물 표적을 통해 억압되도록. 이러한 키나아제의 목표 중 하나의 증가 된 활성을 초래 응력 하에서 손상되고, 제 (4E-BP) 단백질 4E는 바인딩. 비 인산화 4E-BP는의 eIF4E 및 블록 eIF4G 모자 종속 번역 9,10의 억압의 원인과 상호 작용하는 능력을 결합한다. 흥미롭게도, eIF4E2 (또는 4EHP)라는 이름의 eIF4E의 동족체는 아마도 스트레스 중재 억압을 회피 할 수 4E-BP (11)에 대한 훨씬 낮은 친 화성을 가지고있다. 사실, 처음으로 인해 eIF4G (12)과의 상호 작용의 부족에 번역의 리프레 특징, eIF4E2는 저산소 스트레스 6,13- 동안 그들의 3 &#39;UTR에서 RNA 저산소증 응답 요소를 포함 mRNA를 수백의 번역을 시작합니다. 이 활성화 난eIF4G3, RNA는 저산소 eIF4F 복합체, 또는 eIF4F H 6,13-을 구성하는 단백질 모티브 (4) 및 저산소증 유도 인자 (HIF) 2α 바인딩과의 상호 작용을 통해 달성 s의. 정상적인 조건에서 리프레으로 eIF4E2는 GIGYF2 및 ZNF598 (14)와 결합한다. 이 단지는 부분적으로 아가로 오스 연계 m 7 GTP 친 화성 수지를 통해 확인되었다. 이 고전적인 방법 (15)는 번역의 분야에서 표준과 최고의 가장 일반적으로 아래로 끌어 오기에 캡 결합 복합체를 분리하는 기술을 사용하고 체외에서 결합 분석 16-19입니다. 캡 - 의존적 번역 기계가 상호 변경 부 6-8,13와 같이 유연하고 적응력이 대두되고,이 방법은 급속 스트레스 반응에 관여하는 신규 한 캡 - 결합 단백질을 확인하기위한 강력한 도구이다. 여러 진핵 모델 시스템은 스트레스 반응 등을위한 eIF4E2의 동족체를 사용하여 나타나는 또한, eIF4F의 변화는 광범위한 영향을 미칠 수A. 장대 (20)로, S. Pombe 21 D. 22을 melanogaster의, 그리고 C. 23 엘레 간스. 증거 eIF4F 변동 엄격 조건을 강조하지만, 정상적인 생리 24에 관여 한정되지 않을 수 있음을 시사한다. (미소 전극을 통해 측정) (모세관 말단) 또는 조직 내에서 조직으로의 산소 공급은 뇌 25 2-6 %에서 다양 폐 26 3-12 %, 27 장, 4 %에서 3.5-6 %의 간 28 신장 29 7~12% 근육 30 4 %, 골수 31 6~7%. 세포와 미토콘드리아는 1.3 % 산소 32 이하를 포함한다. 이 값은 세포가 일상적으로 배양 주변 공기보다 저산소증에 훨씬 가깝다. 이것은 무엇을하는 것은 이전에 저산소증 특정 세포 과정은 생리 학적 환경에서 관련 될 수있는 것으로 생각하고 있음을 시사한다. 흥미롭게도, eIF4F 및 eIF4F H </suP&gt; 적극적으로 생리 학적 산소 또는 &quot;physioxia&quot;(24)에 노출 된 여러 가지 인간의 세포 라인에 독특한 풀 또는의 mRNA의 클래스의 번역 개시에 참여한다. 낮은 산소는 적절한 태아의 개발 (33)를 구동 세포는 일반적으로 높은 확산 속도, 긴 수명, 적은 DNA 손상과 physioxia (34) 덜 일반적인 스트레스 반응이 있습니다. 따라서, eIF4F H 가능성이 생리 학적 조건에서 선택 유전자의 발현에 중요한 요소이다. 여기, 우리는 고정 된 생리 학적 산소 조건에서 또는 조직의 미세 환경의 가능성이보다 잘 나타내는 동적 변동 범위 내에서 배양 세포에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법의 장점은 세포가 저산소 워크 스테이션 내에 용해된다는 것이다. 이 세포 용해에 저산소 세포 배양에서 전환 다른 프로토콜에서 수행되는 빈도를 명확하지 않다. 세포는 종종 첫 번째 작은 저산소증 인큐베이터에서 제거 할 수산소의 세포 응답 (하나 또는 두 개의 분) 35 빠른 같이 앞 용해,하지만 산소이 노출 생화학 적 경로에 영향을 미칠 수 있습니다. 특정 캡 - 결합 단백질은 제 2베이스와의 상호 작용을 필요로하거나, 따라서 일부 캡 인터랙는 정제 과정에서 누락 될 수 m 7 GTP를 가수 분해 할 수있다. 아가 로스 결합 된 효소 방수 캡 유사체로는이 프로토콜에서 치환 될 수있다. 여기에 설명 된 방법을 통해 활동과 eIF4F H 및 eIF4F의 다른 변형의 구성을 탐색하는 세포 생리 학적 조건 또는 스트레스 반응시 활용 복잡한 유전자 발현 기계에 빛을 흘릴 것입니다.

<table><tbody><tr><td>&감마;-아미노페닐-m7GTP 아가로스 C10 결합 비드</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>아가로스 연결 m7GTP</td></tr><tr><td>100mm 배양 접시</td><td>Corning</td><td>877222</td><td>10cm 배양 접시</td></tr><tr><td>150mm 배양 접시</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>15cm 배양 접시</td></tr><tr><td>AEBSF 염산염</td><td>ACROS 유기물</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>아가로스 비즈</td><td>Jena Bioscience&nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>아가로스 비드 제어</td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>피셔</td><td>BP112-25</td><td>SDS-PAGE 로딩 버퍼의 구성 요소</td></tr><tr><td>1.5ml 원심분리기 튜브</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>소량 원심분리기에 사용</td></tr><tr><td>15ml 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>1495970C</td><td>일차 세포 배양에 사용</td></tr><tr><td>정의된 트립신 억제제</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>상피 세포 배지 (전체 키트)</td> <td>ScienCell</td><td>4101</td><td>혈청 및 성장 인자 보충제 포함)</td></tr> <tr><td>글리세롤</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>SDS-PAGE 로딩 버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>100 mM 구아노신 5'- 트리포스페이트, 1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 결장직장 암종</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>인간 암 세포주</td></tr><tr><td>인간 신장 근위 세뇨관 상피 세포</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/High Glucose</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>인간 세포 배양을 위한 표준 배지</td></tr><tr><td>Hyclone 페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>DMEM</td></tr><tr>의 항생제 성분<td>H35 HypOxystation</td><td>최면</td><td>산소 N/A</td><td>저산소증 워크스테이션</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>2198596</td><td>용해 완충액의 세제 성분</td></tr><tr><td>인산일칼륨</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>불화나트륨</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF (lysis buffer의 phosphatase inhibitor component of lysis buffer)</td></tr><tr><td>Disodium phosphate</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Premium Grade Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 (100x)</td><td>세포 신호</td><td>58715</td><td>용해 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>도데실 황산나트륨</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>오르토바나데이트 나트륨</td><td>시그마</td><td>56508</td><td>Na3VO4</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>완충액</td></tr><tr>의 구성 요소<td>0.05% 트립신-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>트립신은 부착 세포를 분리하는 데 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

번역 조절은 특히 세포 스트레스 기간 동안 유전자 조절의 초점입니다. eIF4F 복합체를 통한 캡 의존적 번역은 진핵 세포에서 단백질 합성을 시작하는 가장 일반적인 경로이지만, 이 복합체의 스트레스 특이적 변이가 현재 나타나고 있습니다. 아가로스 연결 m7GTP(5' mRNA 캡 유사체)로 구성된 친화성 수지로 캡 결합 단백질을 정제하는 것은 번역 시작 조절과 관련된 요인을 식별하는 데 유용한 도구입니다. 저산소증(저산소)은 태아 발달 및 종양 진행 과정에서 발생하는 세포 스트레스로, 번역 조절에 크게 의존합니다. 또한, 최근에는 인간 성인 장기의 산소 함량이 낮아 세포가 일상적으로 배양되는 주변 공기보다 저산소증에 더 가까운 것으로 보고되었습니다. 저산소성 eIF4F 복합체(eIF4FH)의 특성화가 진행됨에 따라 5' mRNA 캡을 통한 산소 의존성 번역 시작을 이해하는 데 대한 관심이 높아지고 있습니다. 최근에는 산소 가용성에 의해 조절되는 캡 결합 단백질을 분석하기 위해 인간 세포 배양 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 산소에 대한 노출을 제거하기 위해 저산소증 워크스테이션에서 세포 배양 및 용해를 수행한다는 점을 강조합니다. 액체 매체가 워크스테이션 내의 대기와 평형을 이룰 수 있도록 세포를 최소 24시간 동안 배양해야 합니다. 이러한 제한을 피하기 위해 더 짧은 시간이 필요한 경우 사전 컨디셔닝된 배지(탈산소화)를 세포에 추가할 수 있습니다. 특정 캡 결합 단백질은 두 번째 염기와의 상호 작용이 필요하거나 m7GTP를 가수분해할 수 있으므로 정제 과정에서 일부 캡 상호 작용체가 누락될 수 있습니다. 효소 저항성 캡 유사체에 연결된 아가로스-연관성은 이 프로토콜에서 대체될 수 있다. 이 방법을 통해 사용자는 캡 의존성 번역과 관련된 새로운 산소 조절 번역 인자를 식별할 수 있습니다.

M이 7 GTP 선호도 열에서의 eIF4E 및 eIF4E2의 산소에 반응하여 캡 결합 능력 분석 1 및도 2는 두 사람의 세포주에서 산소 변동에 대한 응답으로 두 가지 주요 캡 - 결합 단백질의 전형적인 m 7 GTP 선호도 정화의 서양 말을 나타냅니다 F의 igure 1과 대장 암의 주요 인간 신장 근위 관 상피 세포 (HRPTEC () 그림 2에서 HCT116). 세포는 액체 매질에 용해 된 산소는 저산소증 스테이션 내의 공기로 평형화했다되도록 24 시간 동안 지시 된 산소 가용성 유지된다. 레인 입력 (IN)이 7 GTP 결합 된 아가 로스 비드 캡 - 결합 단백질을 포착하기 위해 ...

여기에서는 생리학적 산소 상태에서 mRNA의 5' 캡을 결합하는 번역 시작 인자를 분석하기 위한 인간 세포 배양 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 아가로스 연결 m7GTP 캡 아날로그를 사용하며 캡 결합 인자 및 이들의 상호 작용 파트너를 조사하는 데 적합합니다.

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

이 실험의 전반적인 목표는 산소가 적은 조건에서 캡 결합 단백질을 포착하는 것입니다. 이 방법은 아가로스로 연결된 7개의 메틸-구아노신 캡 유사체를 사용하여 캡 결합 인자와 이들의 상호 작용 파트너를 조사합니다. 이 방법은 캡 의존성 번역과 관련된 새로운 산소 조절 인자 식별과 같은 단백질 합성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다.이 기술의 주요 장점은 세포가 용해 시점까지 저산소증 워크스테이션에 보관된다는 것입니다. 이 기술의 의미는 암 치료로 확장되는데, 이는 종양 내의 암세포가 매우 낮은 수준의 산소에 노출되고 번역 조절이 종양 진행에 중요한 역할을 하기 때문입니다. 우리는 코로나의 동료들이 최근 발표한 논문에서 조직 산소화가 실제로 세포가 일상적으로 배양되는 노멀시아(normaxia)보다는 저산소증(hypoxia)에 더 가깝다고 보고한 논문을 읽었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.이 절차를 시작하면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양이 이루어집니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수한 후 15밀리리터의 완전한 배지를 포함하는 150mm 배양 접시를 공급하여 제곱센티미터당 2500 - 5000개의 세포 밀도를 얻습니다. 각 캡 결합 분석에 대해 두 개의 150mm 접시를 사용합니다.파종된 배양 접시를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소 대기의 인큐베이터에 놓습니다. 세포가 최소 24시간 동안 배양된 후 원하는 시간 동안 세포를 저산소증 워크스테이션에 놓습니다. 그런 다음 워크스테이션을 적절한 physioxia로 설정합니다.1개의 X 인산염 완충 식염수(PBS)와 트립신을 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 예열합니다. 980마이크로리터의 용해 완충액을 1.5마이크로리터 원심분리기 튜브에 분취하여 각 캡 결합 분석을 수행합니다. 100X 프로테아제 억제제 칵테일 10마이크로리터와 4-벤젠설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드 10마이크로리터를 얼음 위의 980마이크로리터 용해 완충액에 주입합니다.각 150mm 접시의 매체를 저산소증 워크스테이션 내의 쓰레기통에 버리십시오. 그런 다음 3-4 밀리리터의 따뜻한 1 X PBS로 세포를 씻고 액체를 버립니다. 각 접시에 따뜻한 05% 트립신 EDTA 1ml를 넣고 접시를 2분 동안 또는 세포가 더 이상 접시에 달라붙지 않을 때까지 그대로 두십시오.피펫을 사용하여 한 플레이트의 셀을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 필요에 따라 반복하여 각 세포 플레이트가 별도의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 이동하도록 합니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 6000회 g에서 90초 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.원심분리 후 펠릿을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 트립신을 흡입합니다. 펠릿 바로 위의 튜브에 PBS 200마이크로리터를 부드럽게 피펫으로 넣어 따뜻한 One X PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 PBS를 흡입합니다.다음으로, 1 밀리리터에서 500 마이크로 리터를 피펫으로 준비한 용해 완충 용액을 첫 번째 세포 펠릿에 투입합니다. 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 완전히 다시 매달아 놓습니다. 다시 부유한 셀을 두 번째 세포 펠릿과 결합하고 위아래로 피펫팅하여 두 번째 펠릿을 다시 현탁합니다.모든 펠릿이 결합되고 각 샘플에 대해 다시 현탁될 때까지 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 1.5리터 마이크로 원심분리기 튜브에 용해물을 나머지 500마이크로리터의 용해 완충액과 결합합니다. 저산소증 워크스테이션에서 샘플을 제거합니다.샘플을 섭씨 4도에서 1.5-2시간 동안 회전시켜 부드러운 교반을 사용하여 세포를 용해합니다. 배양 후 용해된 세포를 섭씨 4도에서 15분 동안 1200배 g으로 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 용해물을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.웨스턴 블롯 분석을 위한 전체 세포 용해물 입력 제어로 사용할 상등액의 일부를 예약합니다. 캡 결합 분석을 준비하려면 가위를 사용하여 피펫 끝을 제거하여 비드 슬러리를 쉽게 수집할 수 있습니다. 각 샘플에 대해 50마이크로리터의 블랭크 아가로스 비드 제어 슬러리와 50마이크로리터의 m7GTP 아가로스 C10 연결 비드 슬러리를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 분리합니다.그런 다음 슬러리를 500배 g에서 30초 동안 원심분리하여 비드를 펠릿화합니다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 500마이크로리터의 TBS에 비드를 다시 현탁시킵니다. 이 단계를 반복한 후 500배 g에서 30초 동안 비드를 펠릿화하고 상층액을 제거합니다.다음으로, 용해물을 포함하는 상등액을 빈 아가로스 비드가 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 부드럽게 저어 배양합니다. 10분 후, 500배 g에서 30초 동안 원심분리하여 빈 아가로스 비드를 펠렛화합니다.원심분리 후 비드에 결합하지 않는 용해물을 m7GTP 아가로스 C10 연결 비드가 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 500마이크로리터의 용해 완충액에 비드를 다시 현탁시키고, 500시간 g에서 30초 동안 원심분리하여 비드를 펠릿화한 후 상등액을 버려 빈 아가로스 비드를 세척합니다. 이것을 네 번 반복하여 총 5회 세탁합니다.빈 아가로스 비드를 하나의 X SDS-PAGE 샘플 버퍼에 다시 현탁합니다. 그리고 구슬을 섭씨 95도에서 90초 동안 끓입니다. 향후 웨스턴 블롯 분석을 위해 샘플을 섭씨 20도에서 보관하여 관심 단백질이 비드에 비특이적으로 결합하는 날씨를 관찰합니다.m7GTP 아가로스 C10 연결 비드로 용해물을 섭씨 4도에서 1시간 동안 부드럽게 교반하여 캡슐화하여 캡 결합 단백질을 포착합니다. 교반 후 m7GTP 아가로스 C10 연결 비드를 500배 g에서 30초 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 상층액을 버린 후 m7GTP 아가로스 C10 연결 비드를 이전과 같이 세척합니다.600마이크로리터의 용해 완충액에 비드를 다시 현탁시키고 GTP를 최종 농도인 1밀리몰에 추가합니다. m7GTP 아가로스 C10 연결 비드와 1밀리몰 GTP를 섭씨 4도에서 1시간 동안 부드럽게 교반하여 배양합니다. 이것은 m7GTP와 비특이적으로 상호 작용하는 단백질을 해리시킵니다.m7GTP 아가로스 C10 연결 비드를 500 시간 g에서 30초 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 상층액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 200마이크로리터의 4개의 S SDS-PAGE 샘플 버퍼를 추가합니다. 이전과 같이 비드를 세척한 후 하나의 X SDS-PAGE 샘플 버퍼에 비드를 다시 매달고 섭씨 95도에서 90초 동안 끓입니다.여기에 표시된 것은 일차 인간 신장 근위세뇨관 상피 세포의 산소 변동에 반응하여 두 가지 주요 캡 결합 단백질의 전형적인 m7GTP 친화성 정제의 대표적인 웨스턴 블롯입니다. 세포 용해물은 24시간 동안 8%, 5%, 3% 또는 1%의 산소에 노출되었습니다. 레인에는 전체 세포 용해물의 10%가 입력으로 포함되고, m7GTP에 대한 특이성을 측정하기 위해 세척된 GTP, GTP 세척 후 m7GTP 비드에 결합된 단백질이 포함됩니다.적어도 3개의 독립적인 실험에서 얻은 데이터를 이미지 J로 정량화하고 전체 세포 용해물의 10% 입력에 대한 상대 밀도 단위로 표현했습니다. 결과는 생리학적 산소 하에서 배양된 인간 세포가 두 개의 캡 결합 단백질을 사용하여 번역을 위해 별개의 mRNA를 모집한다는 것을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 저산소 조건에서 캡 결합 단백질을 포획하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 절차를 시도하는 동안 산소가 이러한 번역 시작 인자의 생화학적 특성을 빠르게 변화시킬 수 있으므로 용해 시점까지 세포를 저산소증 워크스테이션에 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 폴리솜 분획과 같은 다른 방법을 수행하여 저산소 조건에서 어떤 캡 결합 단백질이 활성 번역과 연관되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

respirometric 산화 인산화 분석과 함께 사포닌 - permeabilized 섬유 준비 mitochondrial 기능의 통합 평가를 제공합니다. 생리학 및 병리 학적 상태에서 Mitochondrial 호흡은 mitochondrial 상호 작용, 형태학 및 생화학 등 다양한 규제의 영향을 반영하실 수 있습니다.

사포닌 - permeabilized 심장 섬유에 Respirometric 산화 인산화 평가

여기서 우리는 문화의 hypoxic 상태를 평가하는 세포 문화와 간단한 테스트에 hypoxia를 유발하는 간단한 방법을 제안합니다.

세포 배양의 유도와 Hypoxia의 시험

근원:엘레트라 레오1, 루이자 H.D. 카르도소1, 사빈 슈미트1, 에리히 그나이거11오로보로스 악기이 비디오는 산소 플럭스가 살아있는 포유류 세포와 투과화된 포유류 세포에서 미토콘드리아 호흡을 평가하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. 다양한 호흡 상태를 특성화하기 위해 디지토닌, 대사 기질, ADP, 언커플러 및 억제제를 순차적으로 사용하는 방법을 보여줍니다. 생성된 산소 플럭스 프로파일은 정의된 조건에서 미토콘드리아 기능과 에너지 결합 효율을 나타냅니다.

살아있는 세포와 투과화된 세포에서 미토콘드리아 호흡을 평가하기 위한 산소 플럭스 측정

우리는 촬상을 사용 저산소증 글로벌 RNA 합성의 분석을위한 기술을 설명한다. RNA의 클​​릭 - 화학 라벨은 이전에 저산소증에서 수행하고 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA 변화의 시각화를 허용하지 않았습니다. 이 접근법은 해외 RNA 합성 세포 간 변화의 직접적인 시각화를 허용하며, 기존의 평균화 RNA 기술을 보완한다.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

여기는 hypoxic 조건 하에서 생 핵 단백질 사이의 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하는 공동-immunoprecipitation 프로토콜에 설명 합니다. 이 메서드는 hypoxia에서 transcriptional 공동 규제 및 녹음 방송 요인 사이 상호 작용의 데모에 적합 합니다.

Hypoxic 조건 하에서 경작 하는 세포에서 내 생 적인 핵 단백질을 사용 하 여 공동 immunoprecipitation 분석 결과

우리는 인간의 세포의 proteomic 서명을 macrophage 분극에 낮은 산소 환경 영향의 결정에이 적용 하는 프로토콜을 제시.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

여기에서 우리는 심혼에 있는 심실 광학 카테터를 심장 벽을 가로질러 흡광도 분광학을 능력을 발휘하기 위하여 공류된 심혼에 이용하는 방법을 소개합니다. 얻은 데이터는 조직 산소 장력뿐만 아니라 기질 활용 및 멤브레인 잠재력에 대한 강력한 정보를 이 유비쿼터스 제제에서 심장 성능 측정과 동시에 제공합니다.

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

여기에서 우리는 분자 산소를 소비하는 능력과 독립적으로 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 직접 측정하기 위한 분석 모음을 제시합니다.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

이 프로토콜은 산소 전달을 위해 설계된 계층적으로 다공성인 UiO-66 나노입자의 합성, 헤모글로빈 캡슐화, 표면 PEG질화를 상세히 설명합니다. 이 절차는 결함 공학과 변형 촉진 바이코치옹 커지먼트를 결합하여 생의학 응용에 적합한 투과율이 높고 생리학적으로 안정적인 운반체를 생성합니다.

산소 전달 응용을 위한 계층적 다공성 UiO-66 나노입자에서의 합성, 헤모글로빈 캡슐화 및 이교수 PEGylation

이 프로토콜은 효과적으로 격리 갓 인간 융모 cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 감염 microporation을 사용하여 이들 세포의 DNA 단백질 복합체를 식별하는 방법을 설명한다. 형질 감염된 세포는 웨스턴 블롯에 의해 모니터링 될 수 있고, EMSA는 4 일간의 배양 기간 동안 분석한다.

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

학습하세요 저산소 조건에서 캡 결합 단백질을 포착하는 방법을. 아가로스 연결 m7GTP 캡 아날로그를 사용하여 번역 개시 인자와 상호작용 파트너를 분석하고, 암 세포의 번역 조절 메커니즘을 규명합니다.

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

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