Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

본 프로토콜의 전반적인 목적은 고급 등쪽 피부 접힘 챔버(dorsal skinfold chamber)를 사용하여 마우스 모델에서 종양 관련 혈관의 발달을 상세히 조사하는 것입니다. 이 방법은 치료법의 개선 및 종양 진행의 이해와 같이 암 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내 실제 상황이라는 적절한 맥락에서 프로세스를 연구할 수 있으며, 이러한 프로세스를 시간에 따라 관찰할 수 있다는 점입니다.

이 절차는 저희 실험실의 선임 연구원인 Ann Seynhaeve 박사가 시연하겠습니다. 비형질전환 공여 마우스로부터 수혜 마우스의 등쪽 윈도우 챔버에 이식할 직경 10 mm의 비괴사성 종양 조각을 채취합니다. 동종 이식 종양의 경우 일반 마우스 공여자를, 이종 이식의 경우 면역결핍 마우스 공여자를 사용하십시오.

수혜 마우스는 최소 12주령이어야 하며 체중은 20g 이상이어야 합니다. 모든 수술 절차는 무균 상태에서 수행하십시오. 예를 들어, 수술 기구와 챔버 재료를 오토클레이브로 멸균하십시오.

수혜 마우스를 진정시킨 후, 전기 트리머를 사용하여 등 전체의 털을 제거하고 제모 젤을 사용합니다. 피부를 깨끗이 헹구고 건조시킵니다. 마지막으로, 제모된 피부를 에탄올로 깨끗이 닦아냅니다.

이제 척추를 따라 수평 중심선을 표시합니다. 그런 다음, 중심선에서 적어도 2 mm 아래에 관찰창을 배치하고 피부에 창의 둘레를 표시합니다. 다음으로, 메스와 가위를 사용하여 하부 근막이 손상되지 않도록 주의하며 표시한 둘레선 안쪽의 피부를 제거합니다.

그런 다음, 피부 주름을 들어 올리고 이어 펀처(ear puncher)를 사용하여 윈도우 영역 양쪽에 윈도우를 고정할 볼트용 1 mm 구멍을 뚫습니다. 마우스 위에 백 프레임을 배치하고 볼트에 너트를 끼워 프레임을 고정합니다. 다음으로, 프레임 위로 피부를 2~3 mm 정도 당겨 잘 맞는지 확인합니다.

그렇다면, 프레임 상단의 두 봉합 구멍을 통해 23게이지 바늘을 찌릅니다. 너트를 조여 프레임을 고정하고 클램핑 니들 홀더로 잡으십시오. 이때 너트를 너무 세게 조여 볼트 주변의 피부가 말려 들어가지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 바늘을 봉합사로 교체하여 프레임을 피부에 고정합니다.

이제 마우스를 측면으로 돌립니다. 이 각도에서 두꺼운 필러 글라스와 표준 12mm 커버 글라스를 삽입합니다. 근막이 유리에 밀착되도록 리테이닝 링으로 두 글라스를 고정합니다.

다음 단계는 0.9% sodium chloride를 사용하여 윈도우를 습윤시키는 것입니다. 관찰 영역에 몇 방울을 떨어뜨린 후 과잉분을 흡수시키십시오. 이제 윈도우 바로 아래에 90도로 굽은 25 gauge 바늘을 사용하여 1 cubic millimeter의 종양 조직을 수용할 수 있도록 근막에 깊은 포켓을 만듭니다.

그런 다음 종양 조직을 포켓에 넣습니다. 마지막으로, 표준 12 millimeter 커버 글라스와 고정 링을 사용하여 윈도우 관찰 구역을 닫습니다. 기포는 한 시간 이내에 사라집니다.

마우스를 진정시키기 전에, 맞춤 제작된 온도 조절 플랫폼을 37 °C로 가열합니다. 마우스를 진정시킨 후, 가열된 플랫폼 위에 배치합니다. isoflurane을 투여하기 위해 노즈콘을 장착하고, 평가 시간이 5분 이상 소요될 경우 안연고를 도포합니다.

이제 윈도우 볼트를 사용하여 챔버를 맞춤 제작된 홀더에 고정하고, 홀더를 플랫폼에 단단히 고정하십시오. 그런 다음, 물과 면솜을 사용하여 유리 윈도우를 세척하십시오. 이제 현미경에서 명시야 및 형광 조명 하에 10배 대물렌즈를 사용하여 종양 내 혈관 발달 상태를 확인하십시오.

육안 검사 후, 공초점 레이저를 켭니다. 현미경 제어 패널을 턴당 100V의 스마트 게인(smart gain), 턴당 10%의 스마트 오프셋(smart offset), 중간 배율의 X 및 Y 위치 조정, 그리고 턴당 100 microns의 Z 위치 조정으로 설정합니다.

획득 모드를 XYZ 또는 XYZT로 설정하십시오. 해상도를 선택하십시오. 획득 속도를 2 또는 400 Hertz로 선택하십시오.

핀홀을 1 airy unit으로 설정하십시오. 그리고 양방향 X(bidirectional X) 옵션을 선택하십시오. 스펙트럼 범위가 겹칠 가능성이 있는 여러 형광체를 평가할 때는, 블리드스루(bleedthrough)를 방지하기 위해 프레임 사이의 순차 스캔(sequential scan)을 선택하고 적절한 빔 경로를 설정하십시오.

라인 평균값을 4로 설정하고, 마지막으로 실험을 위한 새로운 데이터 세트를 선택하십시오. 이제 관심 조직에 초점을 맞추십시오. 이때 수치 구경(numerical aperture)이 더 높은 건식 렌즈를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 다음으로, 게인(gain)과 오프셋(offset)을 조정하여 과노출이 발생하지 않는 지점으로 설정함으로써 최적의 신호 대 잡음비를 얻기 위해 패스트 라이브 스캔(fast live scan)을 사용하십시오.

이제 획득(acquire) 탭에서 Z 스택을 선택하십시오. 빠른 Z 스캔을 수행합니다. 빠른 스캔 결과를 바탕으로 전체 스캔의 시작 및 종료 위치를 결정하십시오.

그다음, 핀홀 크기에 맞춰 Z 단계 크기를 설정하고 전체 스캔을 진행합니다. 형광 표지를 발현하는 호스트 마우스는 기술된 프로토콜을 사용하여 종양 이식 후 이미징하였습니다. eNOStag-GFP 표지는 혈관 내피세포의 골지체와 세포막에서 발현됩니다.

ROSAmT/mG 라벨은 어디서나 적색 형광을 발현하며, Cre 재조합효소(Cre Recombinase)를 발현하는 세포에서는 녹색 형광을 발현합니다. 이 기술의 한 가지 응용 분야는 종양 내에서 모든 단계를 관찰할 수 있으므로 혈관 발달을 연구하는 것입니다. 예를 들어, 혈관이 형성되지 않은 영역으로 내피 전단(endothelial fronts)이 싹트는 모습을 관찰할 수 있습니다.

종양은 또한 손상된 혈관과 성숙한 분지형 혈관이 형성된 혈관층을 가지고 있습니다. 또 다른 응용 방법은 형광 나노입자와 같이 혈액에 표지를 부착하여 내강 형성, 혈류 및 혈관 외 유출을 연구하는 것입니다. 이를 통해 혈관 튜브의 내강과 내피 팁 세포 근처에서 혈류를 관찰할 수 있습니다.

팁 세포에서 루멘(lumen)의 형성이 관찰됩니다. 생체 내 현미경 검사(Intra-vital microscopy)를 통해 화학요법제의 효과를 조사할 수도 있습니다. 예를 들어, eNOStag-GFP 동물에 나노입자를 주입하고 24시간이 지난 후, 나노입자는 종양 간질로의 유출이 최소화된 상태로 혈관계 내에 남아 있었습니다.

하지만 나노입자를 TNF와 병용 투여했을 때, 종양 간질로의 혈관 외 유출이 관찰되었습니다. 이는 종양 내 약물 전달이 증가했음을 보여주는 증거입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 등쪽 피부 주름 윈도우 챔버(dorsal skinfold window chamber)를 설치하는 방법과 공초점 현미경을 사용하여 종양 관련 과정을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.