Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

이 프로토콜 셀 전용 형광 마커를 표현 하는 유전자 변형 생쥐의 intravital 영상을 설명 합니다. Intravital 이미징 생체 삽입형 윈도 통해 프로세스의 미세한 시각화는 가능한를 사용 하 여 고해상도 관측에 대 한 비-침략 적 방법을 제공 한다. 이 방법은 경도 과정 공부에 특히 유용 합니다.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 고급 등쪽 피부주름 챔버를 사용하여 마우스 모델에서 종양 관련 혈관 구조의 발달을 자세히 검사하는 것입니다. 이 방법은 치료 개선 및 종양 진행 이해와 같은 암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 프로세스가 올바른 맥락에서, 실제 삶에서 연구되고 이러한 프로세스가 시간이 지남에 따라 연구될 수 있다는 것입니다.

이 절차는 제 연구실의 선임 연구원인 Ann Seynhaeve 박사가 시연할 것입니다. 비형질전환 공여자 마우스에서 10mm 직경의 비괴사성 종양 조각을 채취하여 수혜자 마우스의 등쪽 창실에 이식합니다. syngeneic tumor의 경우 일반 마우스 기증자를 사용하거나 이종 이식편의 경우 면역 결핍 마우스 기증자를 사용합니다.

수혜 마우스는 생후 12주 이상이어야 하며 체중이 20g 이상이어야 합니다. 무균 상태에서 모든 수술 절차를 수행합니다. 예를 들어, 수술 기구 및 챔버 재료를 오토클레이브합니다.

수혜 마우스를 진정시킨 후 전기 트리머를 사용하여 등쪽 전체의 털을 제거한 다음 제모 젤을 사용합니다. 피부를 깨끗이 헹구고 말리십시오. 마지막으로 제모된 피부를 에탄올로 깨끗이 문지릅니다.

이제 척추를 따라 수평 중심선을 표시합니다. 그런 다음 보기 창을 선에서 최소 2mm 아래에 배치하고 창에 창 둘레를 피부에 표시합니다. 그런 다음 메스와 가위를 사용하여 기저 근막을 손상시키지 않고 둘레 라인 내의 피부를 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 스킨폴드를 위로 당기고 이어 펀처를 사용하여 창을 제자리에 고정하는 볼트를 위해 창 영역의 양쪽에 1mm 구멍을 삽입합니다. 마우스에 후면 프레임을 놓고 볼트에 너트를 끼워 프레임을 고정합니다. 그런 다음 피부를 프레임 위로 2-3mm 당겨 맞는지 확인합니다.

그렇다면 프레임 상단에 있는 두 개의 봉합사 구멍을 통해 23게이지 바늘을 찔러넣습니다. 너트를 조여 프레임을 고정하고 클램핑 바늘 홀더로 너트를 과도하게 조이지 말고 피부가 볼트 주위를 도는 것을 방지하십시오. 그런 다음 바늘을 봉합사로 교체하여 프레임을 피부에 고정합니다.

이제 마우스를 옆으로 돌립니다. 이 각도에서 두꺼운 필러 유리 조각과 표준 12mm 커버 유리를 소개합니다. 근막이 유리에 단단히 밀착되도록 고정 링으로 둘 다 고정합니다.

다음 단계는 0.9% 염화나트륨을 사용하여 창에 수분을 공급하는 것입니다. 몇 방울을 보기 영역에 떨어뜨리고 초과분을 흡수하십시오. 이제 창문 바로 아래에서 90도 구부러진 25게이지 바늘을 사용하여 근막에 1입방 밀리미터의 종양 조직을 담을 수 있는 깊은 주머니를 만듭니다.

그런 다음 종양 조직을 주머니에 삽입합니다. 마지막으로 표준 12mm 커버 유리와 고정 링을 사용하여 창 보기 영역을 닫습니다. 모든 기포는 한 시간 이내에 소멸됩니다.

마우스를 진정시키기 전에 맞춤형 온도 조절 플랫폼을 섭씨 37도까지 예열하십시오. 마우스를 진정시킨 후 예열된 플랫폼에 놓습니다. 노즈콘을 부착하여 이소플루란을 전달하고 평가가 5분 이상 걸릴 경우 안과 예약을 신청합니다.

이제 창의 볼트를 사용하여 챔버를 맞춤형 홀더에 볼트로 고정하고 홀더를 플랫폼에 고정합니다. 그런 다음 유리창을 물과 솜으로 청소하십시오. 이제 현미경에서 10배 대물렌즈를 사용하여 명시야와 형광등 아래에서 종양의 혈관 발달을 확인합니다.

전체 검사 후 컨포칼 레이저를 켭니다. 현미경 제어판을 회전당 100볼트의 스마트 게인으로 설정합니다. 턴당 10%의 스마트 오프셋, 중간 줌 중간 X 및 Y 위치 및 턴당 100미크론의 Z 위치.

획득 모드를 XYZ 또는 XYZT로 설정합니다. 해상도를 선택합니다. 2 또는 400 헤르츠의 획득 속도를 선택하십시오.

핀홀을 통풍이 잘되는 하나의 장치로 설정합니다. 그리고 양방향 X 옵션을 선택합니다. 스펙트럼 범위가 겹칠 수 있는 여러 형광단을 평가할 때 블리드스루를 방지하고 올바른 빔 경로를 설정하기 위해 프레임 간 순차 스캔을 선택합니다.

라인 평균을 4로 설정하고 마지막으로 실험에 대한 새 데이터 세트를 선택합니다. 이제 관심 있는 조직에 초점을 맞추려면 개구수가 더 높은 건식 렌즈를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 다음으로, 고속 라이브 스캔을 사용하여 게인과 오프셋을 과다 노출이 없는 위치로 조정하여 최상의 신호 대 잡음비를 얻습니다.

이제 획득 탭에서 Z 스택을 선택합니다.빠른 Z 스캔을 만듭니다. 빠른 스캔에서 전체 스캔의 시작 및 끝 위치를 결정합니다.

그런 다음 핀홀 크기에 따라 Z 단계 크기를 설정하고 전체 스캔을 진행합니다. 형광 표지를 발현하는 숙주 마우스는 설명된 프로토콜을 사용하여 종양 이식 후 이미지화되었습니다. eNOStag-GFP 라벨은 골지체와 내피 세포의 세포막에서 발현합니다.

ROSAmT/mG label은 적색 형광을 편재(ubiquitious)로 발현하고 Cre Recombinase(세포를 발현)에서 녹색 형광을 발현합니다. 이 기술의 한 가지 응용 분야는 종양에서 모든 단계를 볼 수 있는 혈관 발달 연구를 위한 것입니다. 예를 들어, 내피 전방(endothelial fronts)이 혈관이 없는 영역으로 싹을 틔우는 것을 볼 수 있습니다.

종양은 또한 혈관을 손상시키고 성숙한 분지 혈관을 가진 혈관층을 형성합니다. 또 다른 응용 분야는 형광을 발하는 나노 입자와 같은 라벨을 혈액에 적용하여 루멘 형성, 혈류 및 유출을 연구하는 것입니다. 따라서 혈류는 혈관의 내강과 내피 끝 세포 가까이에서 관찰될 수 있습니다.

팁 세포에서 스톡이 루멘 형성을 관찰 할 수 있습니다. 생체 내 현미경 검사는 화학 요법제의 효과를 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, eNOStag-GFP 동물에 나노 입자를 주입한 후 24시간 후에 나노 입자는 종양 간질로의 유출을 최소화하면서 혈관 구조에 남아 있었습니다.

그러나, 나노입자를 TNF와 함께 투여했을 때, 종양 간질(tumor interstitium)로의 유출이 관찰되었습니다. 이는 종양간 약물 전달이 증가하고 있다는 증거입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 등쪽 피부주름 창 챔버를 설치하는 방법과 컨포칼 현미경을 사용하여 종양 관련 과정을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.