칼슘 염료를 개구부 신경 절편에 삽입하기 : 신경 개구부를 통해 개구리 신경 근육 계통에서 칼슘 과도 등록

여기에서는 칼슘에 민감한 염료를 개구리 신경 그루터기를 통해 신경 종말로 삽입하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 말초 신경 말단에서 빠른 칼슘 과도 현상의 기록과 분석을위한 프로토콜을 제시합니다.

안녕하세요, 제 이름은 디미트리 사미굴린입니다 저는 러시아 과학 아카데미 인 카잔 생화학 및 생물 물리학 연구소의 시냅스 과정 생물 물리학 실험실에서 일하고 있습니다. 저희 실험실에서는 신경근 접합부(Neuromuscular Junction)에서 칼슘 신호전달(calcium signalization)의 광범위한 방법을 연구합니다. 칼슘의 시냅스 수치를 측정하는 가장 접근하기 쉬운 방법 중 하나는 광학 기록입니다.

여기에서는 개구리 신경 종말에 신경 그루터기를 통해 칼슘에 민감한 염료를 적재하는 방법을 설명합니다. 또한 개구리 말단에서 광대한 칼슘 과도 현상을 측정하고 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 시냅스 활동 중 칼슘의 시냅스전 수준에 대한 활성 약물의 영향을 연구할 수 있습니다.

염료 로딩 용액의 제조. Fluorescein의 칼슘 염료 Oregon Green BAPTA는 소량 500마이크로그램의 분말을 통해 500마이크로리터로 제공됩니다. HEPES를 함유 한 용액 14 마이크로 리터를 분말에 첨가하십시오.

Vortex 로딩 용액을 넣고 스핀 다운하여 철저히 혼합합니다. 빛에 노출되지 않도록 호일로 적재 용액이 포함된 바이알을 감쌉니다. 로딩 용액은 섭씨 영하 20도의 냉동실에 보관하십시오.

염료 로딩 절차. 동물의 피부 가슴근을 절개합니다. 해부된 조직을 은색 안감이 있는 페트리 접시에 장착합니다.

가는 스테인리스 스틸 핀으로 조직을 늘립니다. 페트리 접시에 Ringer의 용액을 추가합니다. 면도날을 사용하여 얇은 끝에서 10 마이크로 리터 피펫 튜브의 약 2 밀리미터의 작은 조각을 자릅니다.

페트리 접시에 충전 피펫을 고정하기 위해 플라스틱 조각을 준비합니다. 주입 피펫을 실리콘 튜브와 피펫 튜브로 만든 어댑터를 통해 플라스틱 주사기로 연결합니다. 플라스틱 피펫으로 페트리 접시에서 임시 Ringer's solution을 제거합니다.

주사기로 건조시킵니다. 그러면 충전 피펫에서 용액이 흡입되는 것을 방지할 수 있습니다. 냉동실에서 적재액이 담긴 바이알을 꺼내 어두운 곳에서 실온으로 해동합니다.

미세한 핀셋과 가위로, 육안 조절하에, 멸균 현미경으로, 근육에 가까운 신경을 잘라낸다. 약 2mm의 신경 그루터기를 남겨 둡니다. 튜브와 주사기로 충전 피펫을 플라스틱을 사용하여 페트리 접시에 고정합니다.

신경 분지 가까이로 이동합니다. 충전 피펫의 신경 그루터기를 부드럽게 흡인합니다. 충전 피펫의 뭉툭한 끝에서 흡입 튜브를 제거합니다.

주사기로 충전 피펫에서 신경 그루터기를 건조시킵니다. 신경 그루터기가 있는 주입 피펫을 위로 이동합니다. 바셀린으로 신경 그루터기를 바깥쪽에서 분리하십시오.

한 번 더 주사기로 충전 피펫의 신경 그루터기를 건조시킵니다. 긴 피펫 팁이 있는 피펫을 사용하여 영점 5마이크로리터의 로딩 용액을 그립니다. 로딩 용액이 있는 피펫 팁을 충전 피펫에 부드럽게 삽입합니다.

혼합물을 신경 그루터기로 직접 배출하십시오. 충전 피펫의 열린 끝을 바셀린으로 밀봉합니다. 페트리 접시에 소량의 용액을 추가합니다.

어둡고 습한 장소에서 실온에서 5시간 동안 제제를 배양합니다. 배양 절차가 끝나면 제제를 복용하고 로딩 용액이 함유 된 충전 피펫을 제거하십시오. 제제를 욕조에 넣고 Ringer의 용액으로 씻어냅니다.

준비물과 함께 목욕을 섭씨 8도의 냉장고에서 밤새 보관하십시오. 현미경 검사를 위해 조직을 준비합니다. 목욕에서 준비물을 가져 가십시오.

은색으로 안감을 댄 챔버에 준비제를 장착하고 조직을 약간 늘립니다. 새 Ringer's 용액으로 조직을 헹굽니다. 흡입 자극 전극을 취하십시오.

자극 흡입 전극을 팁이 신경의 절단된 끝 부분에 가깝게 챔버에 놓습니다. 신경을 전극으로 끌어당깁니다. 전극의 구성은 Khazokoff의 기사에 설명되어 있으며, 기사에 대한 링크는 재료에 있습니다.

현미경 스테이지에 준비 챔버를 고정합니다. 온도 프로브를 놓습니다. 준비 챔버의 Peltier 소자용 전원 코드에 유입 튜브를 연결합니다.

배출 튜브를 준비 챔버에 놓습니다. 관류 펌프를 켭니다. 컨트롤러 장치라는 용어를 켭니다.

컨트롤러 장치의 온도를 섭씨 20도에 도달하도록 설정합니다. 자외선 차단 실드를 설치하십시오. 자극기의 지연 시간과 기간을 설정합니다.

흡입 전극의 와이어를 자극기에 연결합니다. 전원을 켭니다. 저배율 목표에서 자극을 켜서 근육 수축을 확인합니다.

낮은 칼슘과 높은 마그네슘을 함유한 Ringer's solution으로 관류 시스템을 채웁니다. 분당 약 2밀리리터의 관류 속도를 설정합니다. 대물렌즈를 교체하여 40배 확대합니다.

Polychrome V.Select 발광 파장과 연속 모드 조명을 켭니다. 셔터를 엽니다. 배율 대물렌즈의 40배 미만에서 형광 모드 조명은 터미널이 로드되었는지 확인합니다.

터미널을 찾아 집중하십시오. 부하가 많은 신경과 부하가 잘 된 운동 신경 터미널이 그림에 표시되어 있습니다. Red-Short Neuro CCD 카메라로 비디오 캡처.

Turbo-SM 소프트웨어를 실행합니다. 설정 변경을 선택합니다. 입력 프레임 수는 500입니다.

실험 이름을 입력합니다. 기본 구성은 초당 1000프레임입니다. 80 x 80.

외부 트리거를 선택합니다. 사전 트리거 시간을 입력합니다. 마이너스 10밀리초.

반복 횟수, 20을 입력합니다. Polychrome 소프트웨어에서 외부 트리거 조명 모드를 선택합니다. Clampex 소프트웨어를 실행합니다.

하중 자극 프로토콜. 이 프로토콜은 Kazan Federal University 웹사이트의 랩 페이지에서 다운로드할 수 있습니다. 녹화하기 전에 Turbo-SM 소프트웨어에서 어두운 프레임을 캡처하십시오.

삼안 큐브에서 광 경로 교환 수준을 선택합니다.카메라의 경우 100%. 자극 프로토콜을 실행합니다.

관심 영역을 선택하고 신호를 확인합니다. 신경 자극에 대한 반응으로 칼슘이 신경 말단으로 들어가는 것을 반영하는 형광 강도의 변화를 기록합니다. 데이터 분석.

Turbo-SM 소프트웨어에서 파일을 선택합니다. 그런 다음 평균 파일을 선택합니다. 파일을 선택합니다.

평균 파일의 이름을 입력하고 평균을 구합니다. 평균 파일을 fit 파일로 저장합니다. 선택, 맞춤 파일로 저장.

파일 이름을 입력하고 저장합니다. 이미지 J를 실행하고 아래 기기를 엽니다. 분석, 도구, ROI 관리자.

fit 형식으로 저장된 평균 파일을 찾습니다. 이미지로 드래그 앤 드롭: 더 잘 볼 수 있도록 창을 확대/축소합니다. 배경이라고 생각되는 것에 대해 관심 있는 사각형 영역을 선택합니다.

ROI 관리자에 추가합니다. ROI 관리자에서 더보기를 선택합니다. 다중 측정. 로드 다운 의미.

데이터를 복사하고 Excel로 내보냅니다. Excel에서 average 함수를 사용하여 비율에 대한 배경의 평균 값을 계산합니다. Excel을 닫지 않고 이미지로 돌아갑니다 J.저장하지 않고 배경 계산으로 창을 닫습니다.

ROI 관리자를 사용하여 직사각형 배경 그리기를 삭제합니다. 악기 프로세스, 수학, 빼기를 엽니다. Excel에서 계산 된 임계 값 평균 값을 입력하고 스택에서 지반을 뺍니다.

신경 말단 주위의 직사각형 관심 영역을 선택합니다. ROI Manager에 추가합니다. ROI Manager에서 more, Multi-measure, load down, mean을 선택합니다.

복사하여 Excel 창에 붙여넣습니다. Excel 계기 플롯 그래프를 사용합니다. 신호를 시작하기 전에 평평한 영역을 선택하십시오.

나머지에 있는 형광의 첫 번째 값부터 신호의 시작 부분까지 세부 정보를 그래프에 로드합니다. 그런 다음 평균 나머지 형광 값에 대한 점의 수를 결정합니다. 이 값의 평균을 구한 다음 나머지에서 형광의 평균 수를 찾으십시오.

나머지에서 신호를 형광으로 나눕니다. 1을 빼고 100%를 곱합니다. 신호를 플로팅하고 칼슘 과도 상태의 진폭을 계산합니다.

형광 신호의 시간 매개변수는 칼슘-염료-복합체 형성의 순방향 및 역방향 반응 속도에 따라 달라집니다. 칼슘 신호의 상승 시간은 칼슘 투입의 역학을 나타냅니다. 그것은 말단의 확산과 염료와의 칼슘 상호 작용입니다.

칼슘 일시성의 붕괴는 염료 친화력과 칼슘 완충 속도 및 그 철회에 따라 달라집니다. 칼슘 과도 진폭 분석은 신경전달물질 방출에 참여하는 칼슘 유입에 대한 다양한 활성 물질의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 loading 기술은 세포체 칼슘의 변화를 이미징하는 데 매우 적합합니다.

형광등 지시자와 단일 신경 자극 및 리드미컬한 시냅스 활동으로 구성됩니다. 칼슘 과도 진폭 분석은 신경전달물질 방출에 참여하는 칼슘 진입에 대한 다양한 물질의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리가 주의해야 할 몇 가지 중요한 점이 있습니다.

배양 절차에는 두 단계가 포함됩니다. 실온에서 배양하고 냉장고에서 배양합니다. 실온에서 염료로 배양 시간을 제어하는 것이 중요합니다.

신경 그루터기의 길이, 염료 및 실내 온도에 따라 배양 시간이 달라질 수 있습니다. 수술 전 말단과 신경 그루터기에 가까운 근위 부분에 과부하가 걸릴 수 있습니다. 냉장고에서 오랫동안 배양하기 때문에 염료는 신경 말단을 따라 고르게 분포되어 있습니다.

절단 후 몇 분 이내에 염료 로딩 용액에 신경을 넣어 염료가 신경으로 들어갈 수 있도록 하는 것이 중요한데, 시간 간격이 길어지면 닫힌 신경을 받기 때문에 비효율적인 로딩이 발생하기 때문일 수 있습니다. 염료 구획화를 줄이기 위해 염료의 확장된 형태를 사용할 수 있습니다. 조직의 긴 형광 조명은 생존에 영향을 미치기 때문에 조직의 긴 형광 조명을 방지하는 것이 매우 중요합니다.

우리는 가시광선 채널에서 Nomarski 광학 장치를 사용하여 터미널을 검색합니다. 녹음하는 동안 다이어프램에 의해 조명이 켜진 시야를 제한합니다. 장시간의 로딩 과정은 신경의 셔터 스탬프를 사용하여 줄일 수 있습니다.

이 경우 유리 마이크로 바이패스를 사용할 수 있습니다.