제노없는 조건에서 3-D 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (MSC) 타원체 뇌관

이 실험들의 전반적인 목표는 실험 및 임상 적용을 위해 제노-프리(xeno-free) 조건에서 프라이밍된 중간엽 줄기/기질 세포(mesenchymal stem/stromal cells, MSCs)의 치료용 구형 응집체, 즉 스페로이드(spheroids)를 효율적으로 생성하고 주입하는 것입니다. 이러한 방법들은 분산된 세포를 이식한 후 흔히 나타나는 낮은 세포 유지율, 생존율 및 기능성 저하, 그리고 조직 손상과 관련된 열악한 환경과 같은 MSC 치료 분야의 주요 장벽을 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이러한 절차의 주요 장점은 FBS와 같이 현재 세포의 일부 임상 적용을 제한하고 일부 전임상 데이터의 해석을 혼란스럽게 할 수 있는 면역원성 동물성 제품 없이 MSC 스페로이드를 준비, 프라이밍 및 주입할 수 있다는 점입니다. 이 메커니즘은 MSC 기반 효능을 매개하는 데 잠재적으로 매우 유익할 뿐만 아니라, MSC 매개 조직 수복을 이해하고 다른 배지 조성이 치료적 유전자 효과를 어떻게 변화시키는지 이해하는 데에도 활용될 수 있습니다. 이러한 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 Josh Beaver와 Bret Clough가 진행하겠습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 중간엽 줄기세포를 파종 및 배양한 후, trypsin과 EDTA를 사용하여 세포를 회수하십시오. 회수한 세포를 450 ×g에서 원심분리한 다음, 모든 세포를 적절한 배지가 담긴 단일 원추형 튜브에 합칩니다. 세포를 원심분리하고 펠렛을 소량의 배지에 재현탁하십시오. 그 다음 세포 수를 측정하여, 약 25,000개의 세포로 구성된 스페로이드를 생성하려면 회수한 MSC를 다음 배지 중 하나에 µL당 714개의 세포 농도로 희석하십시오.

다음으로, 세포 35 µL 방울들을 150 mm 도립 배양 접시 뚜껑의 안쪽 면에 분주합니다. 실온의 PBS 20 mL를 접시 바닥면에 옮겨 담고, 방울의 꼭짓점이 아래를 향하도록 방울이 맺힌 뚜껑을 한 번의 연속적이고 안정적인 동작으로 뒤집습니다. 그런 다음 뚜껑을 배양 접시 바닥면에 조심스럽게 놓습니다.

적절한 구체 형성이 이루어질 수 있도록 배양 접시를 인큐베이터로 옮겨 3일 동안 건드리지 않고 배양합니다. 배양이 끝난 후, 덮개를 조심스럽게 제거하고 방울이 다시 위를 향하도록 뒤집어 스페로이드 수집을 시작합니다. 그런 다음 덮개를 약 10~20도 각도로 기울이고 셀 리프터를 사용하여 스페로이드가 포함된 방울을 플레이트 가장자리로 밉니다.

1 mL 피펫을 사용하여 구체 말단 배지를 15 mL 원추형 튜브로 옮기고, 상온의 PBS와 동일한 피펫 팁을 사용하여 플레이트를 세척함으로써 스페로이드를 최대한 회수합니다. 실시간 PCR 분석의 경우, 구체 현탁액을 상온에서 450 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다. 그 다음 상층액을 흡입하여 제거합니다.

PBS로 스페로이드를 세척하고 원심분리와 흡입 단계를 모두 반복합니다. 동물 모델에 투여하려면 원심분리를 하지 않고 구체가 튜브 바닥에 가라앉도록 둡니다. 면역 조절 및 항암 잠재력 분석을 위한 조건 배지(CM)를 수집하려면, 방금 시연한 것과 같이 셀 리프터와 피펫을 사용하여 스페로이드와 CM 배지를 15 milliliter 원추형 튜브에 회수합니다.

단, 뚜껑은 PBS로 세척하지 마십시오. 450 ×g에서 5~10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 상층액을 10,000 ×g, 실온에서 5~10분 동안 원심분리합니다.

그 다음, 피펫을 사용하여 정제된 CM을 새 1.5밀리리터 튜브에 조심스럽게 수집하여 영하 80도로 보관하십시오. 이 영상에서 보여드린 대로 스페로이드를 준비하고, 스페로이드가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 3~4분 동안 기다린 후, 상층액을 흡입하고 xeno-free 조건을 유지하기 위해 0.2~0.5% HSA가 첨가된 HBSS를 넣어 스페로이드를 세척하십시오. 그다음, 상층액을 흡입하십시오.

스페로이드 위에 100~200 µL의 멸균된 HBSS/HSA를 덮고 튜브를 얼음 위에 둡니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취한 후, 동물을 BSL-2 캐비닛 안에 등 쪽이 아래로 향하게 배치하고 70% ethanol을 사용하여 마우스 하복부를 소독합니다. 20-gauge 정맥 카테터의 캡을 제거하고, 한 손으로 마우스의 피부를 잡은 상태에서 굽힌 무릎 관절과 생식기 영역을 잇는 가상선의 중앙을 찾습니다. 카테터 스타일렛 어셈블리의 바늘 끝이 정중선을 향하도록 하여 다른 한 손으로 복강 내 주사를 실시합니다.

카테터 스타일렛 어셈블리에서 금속 스타일렛 바늘을 조심스럽게 제거합니다. 스타일렛에 혈액, 소변 또는 분변이 묻어 있는지 확인한 후 폐기합니다. 100 µL의 멸균 HBSS/HSA가 담긴 100 내지 200 µL 피펫 팁을 카테터 주사기 어댑터에 삽입하여 밀폐시킨 후, 플라스틱 카테터가 적절하게 배치되었는지 확인합니다.

그 다음, 액체를 복강 내로 천천히 주입합니다. 100~200 µL 피펫 팁을 사용하여 MSA 스페로이드와 HBSS/HSA를 수집하고, 방금 시연한 것처럼 카테터를 통해 전체 부피를 복강 내로 옮깁니다. 이어서, 100 µL의 HBSS/HSA로 스페로이드가 들어있는 튜브를 세척하고 스페로이드의 전체 부피를 복강 내로 옮깁니다.

소독제에 적신 거즈 패드를 카테터 위에 덮고, 복강에서 카테터를 천천히 제거하여 폐기합니다. 카테터에 남아 있는 스페로이드가 있는지 확인합니다. 그런 다음 손가락으로 복강을 부드럽게 마사지하여 스페로이드가 고르게 분포되도록 합니다.

마우스에 스페로이드를 주입한 직후, 주입용으로 준비된 스페로이드의 활성화 수준을 평가하기 위해 40~120개의 스페로이드를 2% FBS 및 1X penicillin streptomycin이 첨가된 Alpha MEM 1~2mL가 들어 있는 12 또는 6웰 플레이트의 카테터로 옮깁니다. 6시간 후, 웰의 배지를 1.5 또는 15mL 튜브로 옮기고 실온에서 450 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 마지막으로, 상등액(CM)을 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 상용 ELISA 키트를 사용하여 설명서의 프로토콜에 따라 PGE-2 농도를 분석합니다.

여기서 볼 수 있듯이, 약 25,000개의 MSC를 35 µL의 CCM 방울 속에 부유시키면, 세포들이 먼저 작은 응집체를 형성한 후 최종적으로 72시간 후에 방울의 정점에서 하나의 조밀한 구체를 형성하며 융합됩니다. 이 그림은 단일 조밀 구체 및 XFM-1의 형성을 위해 13 mg/mL HSA 보충이 필요하며, 이 농도는 CCM의 추정 총 단백질 함량을 반영한다는 것을 보여줍니다. 구체 조립 과정 동안 MSC의 표현형은 급격히 변화하며, 적절하게 화학적으로 정의된 xeno-free 배지 내에서 PGE2 및 TSG6를 포함한 수많은 항염증 인자의 발현이 상향 조절됩니다.

그러나 HSA가 없는 XFM-2 또는 XFM-1에서 구체(sphere) 형태로 배양된 MSC에서는 TSG6 및 PGE2의 생성이 눈에 띄게 증가하지 않습니다. 마지막으로, in vitro 효과와 유사하게, LPS를 정맥 주사하여 전신 염증을 유도한 직후 생쥐의 복강 내에 XFM-1 HSA 구체를 주입한 결과, 복강 내 PGE2 및 IL-10 수치는 증가한 반면 염증 유발 인자인 TNF alpha는 감소했습니다. 숙련되면 행잉 드롭(hanging drop) 플레이트 한 장을 1~2분 이내에 준비할 수 있습니다.

적절하게 수행될 경우, 온전한 스페로이드의 복강 내 투여는 동물당 5분에서 10분 이내에 완료할 수 있습니다. 현수적법(hanging drop technique)을 사용하여 MSC 스페로이드를 제작할 때는, 서로 다른 xeno-free 배지 조성들이 구체 형성 및 치료 유전자의 발현 증진 측면에서 동일한 효율을 보이지 않는다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후, 공초점 현미경과 같은 다른 방법을 통해 스페로이드 내 MSC의 조직 구성과 스페로이드의 서로 다른 부위에 있는 MSC에서 활성화될 수 있는 추가적인 신호 전달 경로를 파악할 수 있습니다.

이러한 발전을 통해 MSC 연구원들은 다른 3D 배양 조건과 그것이 MSC 프라이밍 및 치료 유전자 발현에 미치는 영향을 연구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 hanging drop 기법을 사용하여 MSC를 스페로이드 형태로 프라이밍하는 방법, in vitro에서 이들의 치료 효능을 평가하는 방법, 그리고 in vivo 효능 테스트를 위해 손상되지 않은 스페로이드를 마우스에 효과적으로 전달하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한 성인 인간 줄기세포를 다루는 데는 특수 장비와 교육이 필요하며, 세포를 적절하게 취급하지 않을 경우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

성인 인간 줄기세포를 취급할 때는 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다.