Name: 제노없는 조건에서 3-D 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (MSC) 타원체 뇌관 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 학습하세요 중간엽 줄기세포(MSCs) 타원체를 제노프리 조건에서 생성하고 투여하는 방법을. 이 기법은 세포 보존률과 기능 향상을 통해 재생의학 치료 효과를 높입니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 보조금 P40RR17447와 텍사스 암 예방 및 연구소(Cancer Prevention and Research Institute of Texas)의 RP150637 지원으로 일부 자금을 지원받았습니다. 이 프로젝트에 대한 지원에 대해 Darwin J. Prockop 박사에게 감사드립니다.

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<li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+cultured+as+spheroids+are+self-activated+to+produce+prostaglandin+E2+that+directs+stimulated+macrophages+into+an+anti-inflammatory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype.</a> Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).</li>
<li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+characteristics+of+human+mesenchymal+stromal%2Fprogenitor+cells+pre-activated+in+3-dimensional+cultures+under+different+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions.</a> Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).</li>
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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

일부 연구 및 임상 응용에 사용하기위한 최적의 MSC는 그들의 높은 이득을 최대화하기 위해 작동하고, 우선적으로 이러한 FBS 배지와 같은 이종 성분의 잠재적 인 항원의 전달을 최소화하기 위하여 화학적 XF 조건 하에서 제조한다. 여기에 설명 된 프로토콜에서, 우리는 1) 방법을 도시 한 타원체를 형성하여 3D 배양에서 중간 엽 줄기 세포를 활성화 2) XF 조건에서 중간 엽 줄기 세포의 3D 활성화를 달성 3) 그들의 항에 관해서 타원체 엽 줄기 세포의 활성화 수준을 평가 염증, 면역 조절 성 및 항암 전위, 4) 마우스에 그대로 타원체로 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 제공한다. 중간 엽 줄기 세포는 골수, 지방 조직 등 다양한 성인 조직으로부터 플라스틱 접착을 통해 분리 할 수있다 다 능성 줄기 세포이다. 중간 엽 줄기 세포는 쉽게 표면 마커의 고유 한 집합을 표현 (~ 20 %) FBS 농도가 상대적으로 높은에서 조직 배양 플라스틱에 전파하고있다지방 세포, 골 세포, ...

중간 엽 줄기 / 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 다양한 재생 의학 접근 방식에 대한 큰 잠재력을 보여 주었다. 중간 엽 줄기 세포는 초기 골수 간질 성분으로서 단리되었지만 사람의 지방 조직의 1, 2, 3을 포함하여 다수의 다른 성인 조직으로부터 수득 하였다. 흥미롭게도, 메인 분리 방법은 중간 엽 줄기 세포의 현저한 재산권 소 태아 혈청 (FBS)의 존재하에 조직 배양 플라스틱에 단단히 부착 품은. 전통적인 분리 기술은 2 차원 배양의 MSC 쉽고 신속한 팽창을 허용하는 동안, 그것은 오도 매우 인위적인 중요한 세포 특성이 (4)의 전위 손실로 이어지는 기본 3 차원 환경의 중요성을 무시 6. 따라서, 3D 문화에서 중간 엽 줄기 세포의 연구하는전통적인 2D 문화보다 더 생리있다 &quot;손실 / 감소&quot;MSC 특성에 대한 검색에 등장했다. 또한, 관심 임상 응용 프로그램에 대한 세포가 더 순종하게하여 MSC 문화 활성화를 위해 이종없는 (XF) 화학적으로 정의 된 조건을 식별하고 상승했다. 많은 연구는 생체 재료 및 구형 집합체 또는 회전 타원체로 모두 중간 엽 줄기 세포의 3 차원 배양을 보여주는 발표되었다. 중간 엽 줄기 세포의 타원체 배양 전임상 또는 임상 시험에서의 치료를위한 세포의 투여 후 생체 내에서 MSC 동작을 이해하는 방법으로 보였다 반면 생체 재료의 중간 엽 줄기 세포는 초기 셀 시드 지지체에 손상된 조직을 대체하는 조직 공학 방법을 위해 설계된 4, 5, 7. 흥미롭게도, 중간 엽 줄기 세포의 형태 타원체는 자발적으로 조직 배양 플라스틱에 부착이 허용되지 않는 경우8, 9, 10. 전통적으로, 세포 응집은 스피너 플라스크 방법 또는 액체 오버레이 기술, 종양 미세 환경을 모방하려고 노력 암 생물학에서 처음 사용 된 방법에 의해 촉진되었다. 최근 추가 방법은 배양 접시에서 세포 응집 세포 간 접착 수지 4, 5, 6을 방지하기 위해 특정 화학 물질로 미리 코팅 된 표면이 보여왔다. MSC의 타원체를 생성하는 가장 간단하고 경제적 인 방법 중 하나는 종종 배아 줄기 세포로부터 배아 체를 생성하기 위해 사용 된 기법에 매달려 방울 배양 그들이다. 드롭 배양 기술을 걸려, 조직 배양 플라스틱에 대한 세포 부착은 세포 aggreg을 용이하게하기 위해 중력을 조직 배양 접시 뚜껑의 밑면에 중간 방울에 세포를 현탁하고시킴으로써 방지드롭의 정점에 ATION. 회전 타원체 크기 용이 세포 농도 또는 액적 부피 변화를 제어하는 ​​것이 특히 용이 매달려 드롭 배양함으로써 조작 될 수있다. 중간 엽 줄기 세포의 3 차원 배양에 대한 초기 연구는 2D 대응 6, 8, 9에 비해 3 차원 셀의 특성 라디칼 차이를 보였다. 동시에, 보고서는 생체 내에서 중간 엽 줄기 세포의 유익한 효과는, 응답, 마이크로 환경 단서에 의해 활성화 될 항염증제 및 면역 11 요인을 생성하는 능력에 의존하고 있음을 보여 주었다. 흥미롭게도, 예컨대 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 종양 괴사 인자 - 자극 된 유전자 6 (TSG6), 및 간세포 성장 인자 (HGF) 등이 요인의 많은위한 방법을 포장 전통적인 2D 엽 줄기 세포보다 MSC의 타원체에 의해 훨씬 더 많은 양으로 생산되었다 아이디어세포를 8, 12, 13를 활성화 차원 배양을 사용. 또한, 3D 배양에서 유전자 활성화는 마우스 (12)에 주입 한 후 세포 활성의 적어도 일부분 메커니즘 요점을 되풀이 나타났다. 생체 내에서 전통적인 MSC 효과는 종종 과도 지연 및 &quot;뺑소니&quot;로 설명 될 수있다 같은 실험들은 사용 전에 중간 엽 줄기 세포를 활성화시킴으로써, 세포의 장기간 효과는보다 두드러 수있다. 지난 몇 년 동안, MSC의 타원체를 사용하는 중요한 기능 연구는 염증 반응을 억제하며 타원체를 준비하는 중간 엽 줄기 세포 (2)의 매력적인 양식을 대 식세포, 수지상 세포, 호중구 및 T 세포와 같은 효과기 세포 영향에 의해 생체 내에서 면역성을 조절할 수 있음을 입증 3. 또한, int와 같은 항암 분자의 제조erleukin-24 (IL-24) 및 종양 괴사 인자 관련 세포 사멸 유도 리간드 (TRAIL)는, 중간 엽 줄기 세포를 단일 층에 중간 엽 줄기 세포의 상대 3D 문화에 표적 암 치료 8, 10, 14 악용 될 수있는 현상을 증가한다. 기존의 MSC 문화 조직 배양 플라스틱뿐만 아니라 FBS의 사용뿐만 아니라 필요에 따라 임상 극복 할 수 있었다위한 또 다른 장애물은 MSC의 회전 타원체보다 의무 확인합니다. 이 장애물을 해결하기 위해 최근에 특정 화학적 XF 조건 MSC의 구 상체의 형성을 보였다 얻어진 MSC의 구 상체는 FBS (14)의 조건에서 발생되는 회전 타원체와 같은 항염증제 및 항암 성 분자를 생성하기 위해 활성화되었는지 세웠다. 여기서, 이러한 결과는 XF를 이용하여 3 차원 배양에 미리 활성화 된 중간 엽 줄기 세포의 생성을 보여주는 몇 가지 상세한 프로토콜에 제시미디어. 또한, 프로토콜은 함께 마우스에 그대로 타원체를 전달하는 실제적인 방법으로 그들의 항 염증, 면역 조절 및 항암 효과에 관해서는 상기 중간 엽 줄기 세포의 활성화 수준을 평가하기위한 효과적인 방법을 설명이 제시된다.

<table><tbody><tr><td>MEM-&알파; (최소 필수 미디엄 알파)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>12561049; 12561056; 12561072</td><td>MSC 성장 배지(CCM)</td></tr><tr><td>FBS(소 태아 혈청) 준비를 위한 최소 필수 배지, 프리미엄 셀렉트</td><td>애틀랜타 생물학</td><td>S11595; S11510; S11550; S11595-24</td><td>모든 유형의 세포에 대한 완전한 배양 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>ThermoFisher / Gibco</td><td>25030081; 25030149;</td><td>모든 유형의 세포에 대한 완전한 배양 배지의 25030164 구성</td></tr><tr><td>요소 페니실린 / 스트렙토 마이신</td><td>ThermoFisher / Gibco</td><td>15070063</td><td>모든 유형의 세포에 대한 완전한 배양 배지의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>살균 필터 장치, 0.22 &마이크로; m PES 멤브레인</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE</td><td>미디어 살균</td></tr><tr><td>150 mm 세포 배양 접시</td><td>Nunc</td><td>D8554&nbsp; SIGMA</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>Thermo Forma 방수 CO2 가습 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model 3110</td><td>배양 세포 조기</td></tr><tr><td>배양 조기 통로 MCSs</td><td>Center for the preparation and Distribution of adult stem cells at The Texas A& M 건강 과학 센터 의과 대학 Scott & Scott의 재생 의학 연구소 </td><td></td> MSC 수조 VWR 89501-468 온난화 매체<td>의 2D 및 3D 배양의</td>백색 NA 준비</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>37 °C; C</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf</td><td>492000904</td><td>수동 액체 처리</td></tr><tr><td>Pipete-Aid</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-300</td><td>취급 혈청학적 피펫</td></tr><tr><td>Costar 멸균 혈청학적 피펫(5, 10, 25 및 50 ml)</td><td>Corning</td><td>4487; 4101; 4251; 4490</td><td>액체 처리</td></tr><tr><td>PBS(인산염 완충 식염수), pH 7.4</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10010023; 10010072; 10010031; 10010049</td><td>세포 배양 처리</td></tr><tr><td>0.25% 트립신/EDTA 용액</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25200056; 25200072; 25200114</td><td>리프팅 부착 세포 및 분산 세포 응집</td></tr>체 <tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>Corning/BD Falcon</td><td>352097</td>세포 <td>원심분리</td></tr><tr><td>50ml 코</td><td>닝/BD Falcon</td><td>352098</td>세포 <td>원심분리</td></tr><tr><td>Eppendor 냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf/Fisher Scientific</td><td>모델 5810R</td><td>세포 원심분리</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Fisher Scientific</td><td>26716</td><td>세포 계수</td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154 SIGMA</td><td>혈구계에서 세포 계수 중 사세포 배제</td></tr><tr><td>Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>A1067501</td><td>인간 중간엽 줄기세포의 성장과 확장을 위해 특별히 공식화된 Xeno-free 미디어</td></tr><tr><td>정의 xenofree MSC medium-2 (XFM-2)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5420</td><td>정의, 인간 중간엽 줄기세포용 xeno-free 배지</td></tr><tr><td>HSA (Human serum albumin)</td><td>Gemini</td><td>800-120</td><td>Xeno-free MSC 매체</td></tr><tr><td>rHSA (재조합 Human serum albumin)</td>의 구성 요소<td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731&nbsp; </td><td>SIGMA 이종-무료 MSC 매체의 구성</td></tr><tr><td>요소 총 RNA 분리 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>총 RNA 추출</td></tr><tr><td>Qiashredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>총 RNA 추출 전 샘플 균질화</td></tr><tr><td>RNAse-free DNase Set&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>총 RNA 추출 중 온컬럼 DNA 제거</td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>M6250&nbsp; RLT</td><td>완충액에서 RNAs의</td>ALDRICH 억제</tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td>혼합 샘플</td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Biorad</td><td>NA</td><td>RNA 농도 및 품질</td></tr><tr><td>고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>총 RNA를 cDNA로 전사</td></tr><tr><td>유전자 발현 분석</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td></td><td>Real-Time PCR을 위한 다양한 프라이머/프로브 조합</td></tr><tr><td>Fast Universal PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4352042; 4364103; 4366073;</td><td>Real-Time PCR 반응을 위한 4367846 Master Mix</td></tr><tr><td>Real-Time PCR 시스템(ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)</td><td>ABI Prizm</td><td>NA</td><td>Real-Time PCR</td></tr><tr><td>1.5 ml centrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>세포 원심분리, 시료 채취 및 보관</td></tr><tr><td>(-80 &deg; C) 냉동고</td><td>Thermo Fisher</td><td>모델 Thermo Forma 8695</td><td>시료 보관</td></tr><tr><td>PGE2(프로스타글란딘 E2) ELISA 키트</td><td>R& D Systems</td><td>KGE004B</td><td>샘플</td></tr><tr><td>DMEM(Dulbecco' ThermoFisher</td><td>/Gibco</td><td>10566-016; 10566-024; 10566-032</td><td>대식세포 배양 배지</td></tr><tr><td>J774 마우스 대식세포</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>마우스 대식세포 세포주</td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>in vitro 대식세포 자극</td></tr><tr><td>LPS(지질다당류)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4130</td><td>체외 대식세포 자극</td></tr><tr><td>마우스 TNF-a ELISA 키트</td><td>R& D Systems</td><td>MTA00B</td><td>시료 내 사이토카인 농도 추정</td></tr><tr><td>마우스 IL-10(인터루킨 10) ELISA 키트</td><td>R& D Systems</td><td>M1000B</td><td>샘플의 사이토카인 농도 추정</td></tr><tr><td>RPMI-1640 배지</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>11875-085</td><td>비장세포 배양 배지</td></tr><tr><td>BALB/c 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>651</td><td>in vivo 스페로이드 전달; 비장세포 제제</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>in vitro 비장 세포 자극</td></tr><tr><td>70 &mu; M 스트레이너&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>플레녹사이트 준비</td></tr><tr><td>적혈구 용해 용액 (1x)</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>00-4333</td><td>플레녹사이트 분리 중 적혈구 제거</td></tr><tr><td>마우스 IFN-&#947; (인터페론 감마) ELISA 키트</td><td>R& D Systems</td><td>MIF 00</td> 샘플 LNCaP 전립선암 세포 <td>내 사이토카인 농도 추정</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>연구 암 세포주에 대한 3D MSC의 효과 in vitro</td></tr><tr><td>DNA 기반 세포 증식 분석 키트</td><td>DNA 함량을 기반으로</td>한 <td>ThermoFisher</td><td>C7026</td> 세포 수 측정</tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>용해 시약</td></tr><tr><td>EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)</td><td>ThermoFisher</td><td>FERR1021</td><td>칼슘 킬레이터, 용해 시약의 구성 요소</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>DNA 측정을 위한 RNA 분해</td></tr><tr><td>필터 기반 다중 모드 마이크로플레이트 리더</td><td>BMG 기술</td><td>NA</td><td>마이크로플레이트 분석(ELISA, 세포 정량화, 등)</td></tr><tr><td>HBSS(행크스 평형 염 용액), 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드</td><td>없음 ThermoFisher/Gibco</td><td>14175079</td><td>in vivo 주사 전 MSC 스페로이드의 재흡수</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>MWI Vet <</td><td>em>in vivo 주사를 위한 마취</td><td>502017</td>산소</tr><tr><td>, 압축 가스</td><td>Praxair</td><td>NA</td><td>이소플루란과 함께 사용</td></tr><tr><td>Thermo Forma BSL-2 캐비닛</td><td>Thermo Fisher</td><td>모델 1385</td><td>멸균 세포 배양</td></tr><tr><td>안전 I.V. 카테터/바늘 스틸레토, 20 g , 1 inch</td><td>Terumo</td><td>SR*FNP2025</td><td>복막강으로 슈페로이드 전달</td></tr><tr><td>Sterile micropipette 팁</td><td>Eppendorf</td>는 <td>액체/세포</td>를 <td>다양하게</td> 처리합니다</tr></tbody></table>.

제노없는 조건에서 3-d 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (msc) 타원체 뇌관

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

중간 엽 줄기 / 간질 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 생명 공학 및 재생 의학에 큰 약속을 개최합니다. 중간 엽 줄기 세포는 조직 배양 플라스틱에 강한 접착을 통해 다수의 성인 조직으로부터 분리 한 후, 추가 가장 일반적으로 소 태아 혈청 (FBS)을 사용하여, 시험 관내에서 확장 될 수있다. FBS는 중간 엽 줄기 세포는 면역 원성가 발생할 수 있기 때문에, MSC 문화에서의 존재는 세포의 모두 임상 및 실험 응용 프로그램을 제한합니다. MSC 문화에 대한 따라서 연구는 화학적으로 채용하는 이종없는 (XF) 미디어는 매우 가치가있다. 중간 엽 줄기 세포의 많은 이로운 효과는 종양 괴사 인자 - 자극 된 유전자 6 (TSG6) 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2)로 주로 면역 인자의 분비를 통해 염증 및 면역 조절 능력에 기인하고있다. 그러나, 중간 엽 줄기 세포는 이러한 요소를 생성하도록 활성화를 요구하고 중간 엽 줄기 세포의 효과는 종종 일시적이므로, 큰 관심은 세포 프리 오 미리 활성화시키는 방법을 발견하는 등장자신의 사용에 대한 연구, 따라서 생체 내에서 활성화에 대한 지연 시간을 제거. 여기에서 우리는 3 차원 (3D) 문화에서 효율적으로 작동하는 프로토콜이나 주요 중간 엽 줄기 세포를 제시 화학적으로 XF 조건 및 생체 내에서 이러한 사전 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 관리하는. 특히, 우리는 먼저 XF 매체를 이용하여 구형 MSC 마이크로 조직이나 매달려 방울의 &#39;타원체&#39;를 생성하고 분야와 에어컨 매체 (CM)는 다양한 애플리케이션에 수확 할 수있는 방법을 보여주기 위해 방법을 설명합니다. 둘째, 유전자 발현 화면 설명 및 시험 관내 기능 분석을 신속하게 세포의 항 염증 및 항암 가능성을 강조 타원체 MSC의 활성화 수준을 평가. 셋째, 생체 내 효능을 시험하기위한 마우스 복강 내로 그대로 MSC의 구 상체를 분사하기위한 신규 한 방법을 설명한다. 전반적으로, 프로토콜은 여기에 화학적으로 XF 콘에서 미리 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 얻는 주요 문제를 극복ditions 및 치료에 대한 MSC의 타원체를 관리 할 수있는 유연한 시스템을 제공합니다.

현재 작업에 매달려 드롭 문화는 소형 구형 마이크로 조직 또는 XF 조건에서 활성화 된 중간 엽 줄기 세포의 &#39;타원체&#39;을 생성하기 위해 사용되었다. 그림 1의 임상 로드맵은 중간 엽 줄기 세포는 자기 조립에 권장되는 타원체, 또는 CM은 구 유래의 치료 요인로드 한 후 72 시간에 대한 방울 매달려에 현탁 때 타원체로 수집 될 수 있으며, 잠재적으로 모두 사용되는 것으로 묘사 연구 및 임상 응용 프로그램. 구 생산에 필요한 세포의 다수 cm 2 당 일반적으로 저밀도 100-200 세포를 중간 엽 줄기 세포를 시딩하고 약 80 % 합류 (도 2까지 6-7일 위해 세포를 확대하여 일주일 이내에 취득 할 수있다 ). 세포 성장 동역학은 매일 생존 세포를 계수함으로써 결정 강력한 확장 단계 (3-7 일) 1~2일 간략한 유도기 (도 2c를 &lt;다음 ...

중간엽 줄기세포/기질세포(MSC)의 치료 가능성은 잘 문서화되어 있지만, 환자를 위해 세포를 준비하는 가장 좋은 방법은 여전히 논란의 여지가 있습니다. 여기에서는 실험 및 임상 적용을 위해 이종이 없는 조건에서 프라이밍된 MSC의 치료용 구형 응집체 또는 '스페로이드'를 효율적으로 생성하고 관리하기 위한 프로토콜을 전달합니다.

제노없는 조건에서 3-D 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (MSC) 타원체 뇌관

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

이 실험들의 전반적인 목표는 실험 및 임상 적용을 위해 제노-프리(xeno-free) 조건에서 프라이밍된 중간엽 줄기/기질 세포(mesenchymal stem/stromal cells, MSCs)의 치료용 구형 응집체, 즉 스페로이드(spheroids)를 효율적으로 생성하고 주입하는 것입니다. 이러한 방법들은 분산된 세포를 이식한 후 흔히 나타나는 낮은 세포 유지율, 생존율 및 기능성 저하, 그리고 조직 손상과 관련된 열악한 환경과 같은 MSC 치료 분야의 주요 장벽을 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다.이러한 절차의 주요 장점은 FBS와 같이 현재 세포의 일부 임상 적용을 제한하고 일부 전임상 데이터의 해석을 혼란스럽게 할 수 있는 면역원성 동물성 제품 없이 MSC 스페로이드를 준비, 프라이밍 및 주입할 수 있다는 점입니다. 이 메커니즘은 MSC 기반 효능을 매개하는 데 잠재적으로 매우 유익할 뿐만 아니라, MSC 매개 조직 수복을 이해하고 다른 배지 조성이 치료적 유전자 효과를 어떻게 변화시키는지 이해하는 데에도 활용될 수 있습니다. 이러한 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 Josh Beaver와 Bret Clough가 진행하겠습니다.텍스트 프로토콜에 따라 중간엽 줄기세포를 파종 및 배양한 후, trypsin과 EDTA를 사용하여 세포를 회수하십시오. 회수한 세포를 450 ×g에서 원심분리한 다음, 모든 세포를 적절한 배지가 담긴 단일 원추형 튜브에 합칩니다. 세포를 원심분리하고 펠렛을 소량의 배지에 재현탁하십시오. 그 다음 세포 수를 측정하여, 약 25,000개의 세포로 구성된 스페로이드를 생성하려면 회수한 MSC를 다음 배지 중 하나에 µL당 714개의 세포 농도로 희석하십시오.다음으로, 세포 35 µL 방울들을 150 mm 도립 배양 접시 뚜껑의 안쪽 면에 분주합니다. 실온의 PBS 20 mL를 접시 바닥면에 옮겨 담고, 방울의 꼭짓점이 아래를 향하도록 방울이 맺힌 뚜껑을 한 번의 연속적이고 안정적인 동작으로 뒤집습니다. 그런 다음 뚜껑을 배양 접시 바닥면에 조심스럽게 놓습니다.적절한 구체 형성이 이루어질 수 있도록 배양 접시를 인큐베이터로 옮겨 3일 동안 건드리지 않고 배양합니다. 배양이 끝난 후, 덮개를 조심스럽게 제거하고 방울이 다시 위를 향하도록 뒤집어 스페로이드 수집을 시작합니다. 그런 다음 덮개를 약 10~20도 각도로 기울이고 셀 리프터를 사용하여 스페로이드가 포함된 방울을 플레이트 가

production-administration-therapeutic-mesenchymal-stemstromal-cell

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

자가 혈청 인간 중간 엽 기질 세포 (중배엽 줄기 세포)를 배양, 이종 재료 및 기타 부정적인 영향에 의한 거부 반응의 위험을 줄일 수 있습니다. 또한 신선한 중배엽 줄기 세포를 제공 할 수 중배엽 전구 세포의 부분 집합의 복구 할 수 있습니다. 자가 섬유소 응고에 중배엽 줄기 세포를 포함하면 취급이 용이하고 효과적인 수술 주입을 할 수 있습니다.

중간 엽 기질자가 조건에서 세포 배양 배송 : 정형 외과 응용 프로그램에 대한 스마트 접근

여기에서, 우리는 키토산 필름에 의하여 인간 치주 인대 (PDL) 세포 스페로이드를 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 3차원(3D) 세포 스페로이드의 배양은 기존의 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 배양 시스템에 대한 대안을 제공한다.

키토산 필름에 인간 치주 인대 세포 스페로이드의 형성

여기에서는 3D 바이오리액터를 이용하여 활액 중간엽 줄기세포로부터 다수의 GMP급 엑소좀을 생산하는 프로토콜을 제시합니다.

3D 생물반응기 배양에 의한 활액 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀의 대규모 제조

여기에서는 세포 현탁액을 시드하기 위해 자동화 된 피펫팅 시스템을 사용하여 지방 유래 기질 / 줄기 세포 (ASC) 구상체의 대규모 생산을 설명하므로 스페로이드 크기와 모양의 균질성을 보장합니다. 이 ASC 구상체는 3D 바이오 프린팅 접근법의 빌딩 블록으로 사용할 수 있습니다.

3D 바이오프린팅을 위한 지방유래 줄기세포 구상체의 대규모, 자동화 생산

여기에서는 역류 원심분리 시스템을 사용하여 폐쇄형 반자동 방식으로 다층 플라스크에서 부착 세포를 수확하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 기존 단계를 거의 수정하지 않고 다른 세포 확장 플랫폼에서 부착 세포와 현탁 세포를 모두 수확하는 데 적용할 수 있습니다.

폐쇄형 반자동 워크플로우를 사용한 임상 적용을 위한 인간 중간엽 줄기 세포 처리

세포 치료제 준비/조작 단계에 도입된 이종(화학적 또는 동물 유래) 제품은 숙주 환자에서 면역 반응성 및 병원성 전파의 위험 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 인간 지방유래 줄기세포의 분리 및 시험관내 확장을 위한 완전한 이종발생학적 무함유 방법이 기재되어 있다.

인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 배양 (Isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative Xenogeneic-free method for human therapy)

고정 의존 세포의 마이크로캐리어-미생물반응기 생성에 관한 프로토콜이 잠재적인 세포 기반 치료법으로 설명되어 있습니다. 급성 호흡곤란 증후군의 사용 사례를 목표로 하며, 플라스크 기반 공정 조건에 비해 유사한 세포 수율과 유리한 유전자 발현을 보여줍니다. 이 프로토콜은 다른 앵커리지 의존성 세포 및 표적 적응증에도 확장 가능합니다.

급성 호흡곤란 증후군에 준비된 앵커리지 의존 중간엽 기질 세포의 미생물반응기 기반 생성

여기에서 우리는 고립과이 조직에서 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)의 확장 다음에 인간의 장기 태반에서 태아와 모체 조직의 절개 방법을 설명합니다.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

무균 및 무균 조건에서 초파리 melanogaster의를 양육하는 방법이 제공된다. 플라이 배아는, 차아 염소산 나트륨에 dechorionated 멸균 다이어트에 무균 적으로 전송하고, 밀폐 용기에 양육된다. 박테리아와식이 요법과 배아를 접종은 무균 협회에 이르게하고, 세균의 존재는 전신 초파리 균질 도금에 의해 확인된다.

과일 비행을 양육<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 무균 및 무균 조건에서

학습하세요 중간엽 줄기세포(MSCs) 타원체를 제노프리 조건에서 생성하고 투여하는 방법을. 이 기법은 세포 보존률과 기능 향상을 통해 재생의학 치료 효과를 높입니다.

제노없는 조건에서 3-D 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (MSC) 타원체 뇌관

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