니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

본 프로토콜의 전반적인 목표는 정제된 박테리아 히스티딘 키나아제의 자가인산화를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 2성분 신호 전달 분야의 핵심 질문, 예를 들어 단백질-단백질 상호작용에서 인지 자극이 히스티딘 키나아제의 자가인산화에 미치는 영향과 같은 의문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 고처리량 방법이라는 점이며, 형성된 피코몰 단위의 phosphohistidine을 정확하게 검출하고 histidine kinase의 동역학적 파라미터를 얻는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 박사후 연구원으로서 저는 단백질 결합 방사성 리간드를 정량화하기 위해 니트로셀룰로오스 막 여과법을 사용해 왔습니다. 따라서 세균성 histidine kinase의 histidine 인산화를 정량화하기 위해 이와 유사한 기술을 개발하는 것이 타당하다고 판단했습니다.

텍스트 프로토콜에 기술된 대로 시약과 재료를 준비하여 이 절차를 시작하십시오. 96-웰 도트-플롯 장치를 설정하려면, 8cm x 12cm 크기로 니트로셀룰로스 막을 자릅니다. 도트-플롯 장치 내에 니트로셀룰로스를 배치하십시오.

멤브레인이 장치에 잘 밀착되어 밀봉되고 모든 웰이 멤브레인으로 완전히 덮였는지 확인하십시오. 여과액을 수집하려면 장치를 보조 사이드암 플라스크에 연결하십시오. 밸브 스템에 적절한 튜브를 연결하여 보조 플라스크가 기울어지지 않고 장치를 편리하게 사용할 수 있도록 하십시오.

그런 다음, 보조 사이드암 플라스크를 아스피레이터 진공원에 연결합니다. 장치에 진공을 가하여 장치가 완전히 밀폐되었는지 테스트합니다. 장치가 올바르게 조립되었다면, 모든 웰에 강한 진공이 형성될 것입니다.

모든 튜브 연결 부위는 밀폐를 확실히 하기 위해 Parafilm 또는 Saran wrap으로 감쌀 수 있습니다. 시작 전, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 4가지 반응 성분을 모두 4X 스톡 용액으로 준비하십시오. 반응 버퍼, 히스티딘 키나아제 및 2중 증류수를 동일한 부피로 혼합하십시오.

이 반응 성분들이 실온에서 잠시 동안 평형을 이룰 수 있게 둡니다. 반응을 시작하려면 gamma-32 P ATP 용액 1부피를 첨가하고 피펫팅으로 섞어줍니다. 타이머로 반응 경과 시간을 측정하며 원하는 시간 동안 반응이 진행되도록 합니다.

반응을 정지시킵니다. 반응액의 일부를 325 millimolar 인산에 첨가합니다. 모든 반응이 정지될 때까지 정지시킨 반응액을 즉시 얼음에 둡니다.

미리 조립된 96-웰 닷-플롯 장치를 2차 용기에 넣습니다. 사용 후 장치와 멤브레인이 방사성 물질로 오염되므로, 이 용기는 장치를 내부에서 쉽게 분해할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 96-웰 닷-플롯 장치에 진공을 가합니다.

장치가 진공 상태가 되면, 켄칭된 반응물을 각 웰의 니트로셀룰로오스 막 위에 조심스럽게 피펫으로 분주합니다. 모든 반응물이 막에 로딩될 때까지 이 과정을 반복합니다. 니트로셀룰로오스의 결합 용량은 점적된 histidine kinase의 양보다 크기 때문에, 올바르게 로딩되었다면 kinase의 거의 전부가 막에 결합된다고 가정할 수 있습니다.

사용하는 장치에 따라 니트로셀룰로오스가 뚫리지 않도록 주의하십시오. 모든 반응액이 니트로셀룰로오스에 접촉했는지 확인하십시오. 반응액의 일부가 웰의 벽면에 달라붙기 쉽습니다.

100 µL의 얼음처럼 차가운 25 mM 인산으로 웰을 세척합니다. 이를 통해 웰에 갇혀 있을 수 있는 모든 반응 부피가 멤브레인에 도달하게 하여, 모든 반응물이 완전히 로딩되도록 합니다. 전체 부피가 멤브레인을 통해 모두 흘러내리도록 둡니다.

진공을 끄기 전에 장치를 조심스럽게 분해하십시오. 이때 장치와 니트로셀룰로오스 막 모두 방사능을 띠고 있음에 유의하십시오. 보조 용기에서 장치 구성 요소를 외부로 꺼내지 마십시오.

핀셋을 사용하여 니트로셀룰로스 막을 장치에서 약 200 milliliters의 25 millimolar 얼음처럼 차가운 인산 용액이 담긴 용기로 조심스럽게 옮깁니다. 세척 과정 중 방사성 물질이 발생하므로 용기에 뚜껑을 덮으십시오. 이때 진공 장치는 꺼도 됩니다.

세척 막이 들어 있는 용기를 로커(rocker) 위에 놓습니다. 막이 20분 동안 부드럽게 흔들리도록 둡니다. 20분 후, 사용한 세척액을 임시 폐기물 저장용 대형 버킷에 조심스럽게 따라 냅니다.

200 milliliters의 ice cold 25 millimolar 인산을 막에 첨가합니다. 막에서 배경 $\gamma$-32 P ATP 신호를 제거하기 위해 이 방식으로 막을 최소 3회 세척합니다. 3회 세척 후, 사용한 세척액을 가이거 계수기로 방사능 측정합니다.

세척액에 더 이상 신호가 나타나지 않을 때까지 막을 계속 세척하십시오. 막이 충분히 세척되면, 일반적으로 5분 이내로 소요되는 짧은 시간 동안 막을 자연 건조시키십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 니트로셀룰로오스를 phosphorus green에 노출시킨 후, Ponceau S 염색 및 탈색을 준비하십시오.

니트로셀룰로오스 막을 Ponceau S 염색액에 1~2분 동안 짧게 담급니다. 탈색 전 단계에서 막 전체가 염색액으로 충분히 적셔지도록 합니다. 그 후, 막에서 과잉의 Ponceau S 용액을 따라내어 제거합니다.

히스티딘 키나아제(histidine kinase)로 인한 반점만 염색되어 남을 때까지 이중 증류수로 멤브레인을 세척합니다. 이 과정은 모든 반점에 검출 가능한 양의 단백질이 포함되어 있을 때만 유효하다는 점에 유의하십시오. 가위를 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 상의 각 반점을 오려냅니다.

염색된 반점의 가장자리를 따라 완벽하게 절단할 필요는 없습니다. 멤브레인을 충분히 세척했다면, 절단된 반점의 크기가 일정하지 않더라도 그로 인한 배경 신호는 무시할 수 있는 수준입니다. 각 반응을 위해 반점 전체를 절단하는 것만이 중요합니다.

포셉을 사용하여 각 스팟을 신틸레이션 바이알로 조심스럽게 옮깁니다. phosphorus 32는 체렌코프 방사선으로 쉽게 검출되므로 신틸레이션 칵테일은 필요하지 않습니다. 다음으로, gamma-32 P ATP 용액의 여러 희석액을 1 cm x 1 cm 크기의 니트로셀룰로오스 사각형 위에 스팟합니다.

포셉을 사용하여 각 사각형 조각을 신틸레이션 칵테일이 들어있지 않은 신틸레이션 바이알로 조심스럽게 옮깁니다. 이 시료들은 ATP 용액의 피코몰당 분당 계수(counts per minute per picomole)를 결정하기 위한 표준 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. 여기서는 니트로셀룰로오스 막의 폰소(Ponceau) 염색 결과가 표시되어 있습니다.

모든 샘플에서 염색이 균일하게 나타나며, 이는 모든 샘플이 동일하게 로딩되었음을 나타냅니다. 니트로셀룰로오스 막의 플루오로그래피 결과는 각 스팟에 있는 방사성 표지 phosphohistidine의 상대적 수준을 보여줍니다. 네 번째와 여덟 번째 행은 과잉 ATP가 니트로셀룰로오스 막에서 세척되었음을 보여주는 음성 대조군입니다.

히스티딘 키나아제 자가인산화 정량 분석의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 이 데이터는 멤브레인에서 절단한 각 스팟의 신틸레이션 계수를 통해 생성되었습니다. 여기에 표시된 picomole의 ATP당 분당 계수(counts per minute) 표준 곡선 또한 신틸레이션 계수로 생성되었으며, 각 샘플에 존재하는 phosphohistidine의 picomole 양을 계산하는 데 사용됩니다.

본 절차 이후, 인지 자극을 도입하거나 키나아제(kinase) 활성을 조절할 것으로 가설이 세워진 단백질을 추가하는 등의 다른 방법을 실험에 접목하여, 이러한 첨가제가 키나아제 활성에 미치는 영향과 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 방사성 물질을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 유념하십시오. 본 절차를 수행하는 동안에는 적절한 방사선 안전 교육 이수, 개인 보호 장구 착용 및 차폐막 사용과 같은 예방 조치를 항상 준수해야 합니다.