Name: 니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 배우세요 니트로셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나아제 자가 인산화를 정량하는 방법입니다. 이 고감도 기법은 피코몰 수준의 포스포히스티딘 검출이 가능하여 동역학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 필요 프로그램 (P200A100044) 분야의 대학원 지원을 통해 교육부에 의해 지원되었다.

주의 :이 프로토콜은 방사성 물질의 적절한 사용 교육 및 처리가 필요합니다. 베타 방사선 차폐를 포함하여,이 분석을 수행 할 때 필요한 개인 보호 장비를 사용하십시오. 폐기물 대량 실험의 세척 단계에서 생성 된 방사성 폐기물은 조심스럽게 취급되어야한다. 폐기물은 쉽게 이상 기절 또는 유출되지 않습니다 큰 통이나 병으로 수직 용기에 저장되어 있는지 확인합니다. 실험이 체결되면, 신중하게 모든 액체 폐기물을 적절하게 방사성 폐기물 컨테이너를 표시하는 전송합니다. 주의 모든 자료를 처리, 오염에 대한 작업 공간을 모니터링하기 위해 인근 가이거 카운터를 유지합니다. 참고 :이 프로토콜은 우리 그룹에서 이전에보고 된 분석의 수정 된 버전입니다. H 3 PO 4 15 Phosphohistidine 안정성이 방법을 사용하기 전에 모든지지 않은 히스티딘 키나제에 대한 테스트해야합니다. phosphohistidine 일기능 시험은 전술되었다. 키나제를 함유하지 않는 음성 대조군 (15)가 포함되어야한다. 이것은 각 샘플의 배경 신호를 감산하고, [γ- 32 P] -ATP 충분히 막으로부터 세정되는 것을 보장하기 위해 필요하다. 시약 및 재료 1. 준비 <ol><li> 세균 배양의 사전이 분석을 사용하여 히스티딘 키나제를 정화. <ol><li> 이 분석의 개발 비브리오 파라 헤 몰리 티 커스 (EB101, ATCC 17802)에서 히스티딘 키나아제 (유전자 ID 1189383)을 정제. 을 NdeI 및 XhoI 제한 효소를 이용하여 발현 벡터 애완 23aHis-TEV로 키나아제를 복제 및 돌연변이의 D499A Vp1876를 구성 수득 부위 - 지정 돌연변이 유발을 수행한다. </li><li> 대장균 BL21 (DE3) pLysS 균주에 플라스미드를 변환 및 37 ° C에서 TB 배지에서 세포를 성장한다. 암피실린 (100 μg의 / ㎖) 및 클로람페니콜와 보충 문화 (34 μg의 / ㎖), 교반과 함께 성장OD 0.6 600 (250 RPM). </li><li> 25 μM의 최종 농도로 IPTG로 단백질 발현을 유도하고, 16 ℃에서 밤새 배양 하였다. 원심 분리 (5,000 XG), 초음파에 의해를 Lyse, 원심 분리에 의해 수확 세포는 세포 파편 (18,000 XG)를 제거합니다. </li><li> 니켈 NTA 아가 로스를 이용하여 그 표지 된 키나제 정제. SDS-PAGE에 의해 순도를 확인합니다. 각 단백질 정제를 최적화하고,이 분석을 사용하기 전에 순도를 확인합니다. </li></ol></li><li> 25 mM의 H 3 PO 4 씻어 솔루션을 준비합니다. 증류 된 탈 이온수 1 L에 25 mM의 최종 농도 H 3 PO 4를 추가한다. 이 용액의 pH는 약 2.0이다. 얼음에 25 mM의 H 3 PO 4를 놓습니다. </li><li> 325 mM의 H (3)의 13 배 원액 PO 4를 준비하는 키나아제 반응을 해소하는 데 사용할 수 있습니다. 이 용액의 pH는 약 1.5이다. 얼음에 325 mM의 H 3 PO 4를 놓습니다. 참고 : H 3 PO 4 </sub&gt; 25 mM의 최종 농도에서 충분히 니트로 셀룰로오스 막에 결합에서 히스티딘에 결합되지 않은 방사성 표지 된 포스페이트를 차단하는 데 도움이 또한 반응을 소멸하고. </li><li> 4 배 160 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 600 mM의 KCl을 16 밀리미터의 MgCl 2를 포함하는 반응 버퍼 원액, 40 % 글리세롤을 준비합니다. </li><li> 단백질 농도 설정 방법 (브래드 포드, UV-비스 등) 히스티딘 키나아제 농도를 정량화. 16, 17의 4 배 원하는 최종 농도의 농도와 히스티딘 키나아제 용액을 준비한다. 충분한 신호를 얻기 위해 상기 반응의 최종 단백질 농도는 이상적으로 적어도 5 μM이어야한다. </li><li> 4 배 방사성 표지를 준비 레이블이없는 ATP의 적절한 배 농도 표시와 -ATP 솔루션 [32 P γ-] : 실험에 대한 레이블이없는 비. 주 :이 조합에 포함되어야 [γ- 32 P] -ATP의 양은 ^ [양에 의존7 - 32 P] -ATP는 궁극적으로 각 반응에 발견됩니다. 반응 당 5 μCi를 - 우리는 0.1 사이에 이르기까지 최종 농도로 적절한 신호를 얻을 수있다. 레이블이 지정되지 않은 ATP 비율 주어진 실험에서 모든 반응에 대해 일정하게 유지 될 : 표지는 것이 중요합니다. 모든 농도에 걸쳐 표지되지 않은 ATP 비율 전율 : 여러 ATP 농도가 요구되는 경우가 아니라 표식을 지킬 희석액이 만들어 져야한다. 최종 ATP 농도는 일반적으로 10 μM 적어도 1 ㎜의 범위, 각 농도 안정적인 운동 데이터를 얻기 위해 중으로 분석한다. </li><li> 96- 웰 점 오점 장치 <ol><li> 니트로 셀룰로오스 막 (0.2 μm의 기공 크기)의 8cm X 12cm 조각을 잘라. </li><li> 멤브레인 장치는 밀폐되고, 모든 웰을 완전히 막에 의해 커버되도록 적합 보장 도트 블롯 장치에 위치 니트로. 올바르게 조립하면 진공 APPL이면, 공기 누설이 없어야IED. </li><li> 여액을 수집하기 위해, 2 가지 부착 플라스크에 상기 장치를 연결한다. 밸브 스템에서, 상기 장치는 편안 보조 플라스크 팁없이 사용될 수 있도록 적절한 배관을 연결한다. </li><li> 흡인기 / 진공 원에 2 차측 암 플라스크를 연결합니다. </li><li> 상기 장치가 완전히 장치에 진공을인가하여 밀봉되는 것을 테스트한다. 상기 장치가 올바르게 조립되어있는 경우, 강한 진공 웰 모두 존재할 것이다. 모든 튜브 연결은 파라 필름으로 포장 될 수있다 또는 꽉 밀봉을 보장하기 위해 포장 사란. </li><li> 선택적으로, 잘 하나에 반응 버퍼의 진공, 피펫 100 μL를 테스트합니다. 진공이 잘 통해 멤브레인에 모든 액체를 그릴 수있을 정도로 견고해야한다. </li><li> 모든 샘플은 막에서 발견 될 준비가 될 때까지 진공을 해제합니다. </li></ol></li></ol> 2. 반응 개시 및 담금질 <ol><li> 반응 성분의 혼합 <ol><li> 이전 initi에반응 버퍼가 -ATP (1.6) [32 P γ-, 히스티딘 키나제 (1.5), (섹션 1.4 참조), DDH 2 O : ATION, 4 배의 재고 솔루션으로 네 반응 성분을 준비 </li><li> 반응 완충액, 히스티딘 키나아제 같은 부피 섞은 DDH 2 O. 이러한 반응 성분이 단시간 (10 분) 동안 상온에서 평형을 허용. 주 : 최종 반응 부피는 실험 시간에 따라, 효소 - 의존성 또는 기판에 의존하는지 여부에 의존한다. 여러 분취 원하는 시점에서 동일한 반응 취하여 급냉 될 때 시간에 따른 반응은 커야한다. 반응 부피는 원하는 시점의 개수에 의존 할 것이다. 상기 분석은 반응 30 μL를 포함하는 니트로 셀룰로오스 막에 각각의 스폿에 최적화되어있다. 10 시간 지점이 요구되는 경우, 따라서, 상기 반응 부피는 적어도 300 μL이어야 (높은 용적 같은 330 μL 피펫은 에러 발생시 바람직 할 것이다).효소와 기질에 의존하는 실험은 작은 반응 볼륨을 필요로한다. 이 니트로 셀룰로오스 막에서 목격되는 최종 부피는 이들 실험의 반응 부피는 30 μL로 작을 수있다. </li><li> 반응을 개시하기 위해 반응 [32 γ- P] -ATP 용액 1 볼륨을 추가로 pipetting 아래로 섞는다. 타이머로 반응 경과 시간을 추적하고, 반응은 원하는 시간 동안 진행하도록 허용한다. </li><li> 반응을 종결 반응에 얼음처럼 차가운 325 mM의 H (3)의 총 반응 볼륨 PO 4의 1/13을 추가로 pipetting 아래로 혼합합니다. 또한, 325 mM의 H 3에 대한 반응 PO 4의 나누어지는을 추가합니다. 참고 : H 3 PO 4의 최종 농도는 충분히 반응을 해소하기 위해 25 mm 이상이어야한다. 예를 들어, 30 μL 반응에 2.5 μL 325 mM의 H 3 PO 4를 추가 또는 &lt;30 μL 반응 2.5 μL 325 mM의 H 3 PO를 추가서브&gt; 4. 반응의 최종 pH는 약 4.0이다. H 3 PO 4의 이러한 농도는 테스트 phosphohistidine 저하없이 버퍼의 키나아제 반응을 종결 확인되었다. <ol><li> 예를 들어, 7.5 μL [γ- 32 P] -ATP와 반응을 개시 7.5 배 μL 반응 완충액, 7.5 μL 4X 히스티딘 키나아제, 7.5 μL DDH 2 O. 섞는다. 2.5 μL 325 mM의 H 3 PO 4의 반응을 끄다. </li></ol></li><li> 모든 반응이 종료 될 때까지 즉시 얼음에 급냉 반응을 놓습니다. 참고 효율을 최대화하기 위해, 모두 반응 할 때까지 매 15 또는 20 (S)가 개시되어 하나의 반응을 시작하는 것이 바람직하고, 소정의 반응 시간이 경과 한 후에 모든 켄칭 될 때까지, 하나의 반응을 매 15 초 또는 20 초 급랭. 처음 분석을 사용하는 사람들을 위해, 더 긴 간격이 더 관리 할 수있다. </li></ol></li></ol> 3.이 보인다 오니트로 셀룰로오스에 F 담금질 반응 <ol><li> 96 웰 점 오점 장치에 진공을 시작합니다 <ol><li> 보조 용기에 미리 조립 된 96 웰 점 오점 장치 (1.7 절)을 놓습니다. 장치 및 막 사용 후 방사성되는 바와 같이, 상기 장치는 쉽게에서 분해 될 때까지 이러한 용기는 충분히 커야한다. </li><li> 96 웰 점 오점 장치에 진공을 적용합니다. </li><li> 상기 장치는 진공 하에서되면 신중 각 웰에서 니트로 셀룰로오스 막 상으로 직접 켄칭 반응 피펫. 모든 반응이 막에로드 될 때까지 반복합니다. 니트로 셀룰로오스의 결합능 때문에 (75-110 μg의 / cm 2)에 올바르게 장착 할 때 거의 모든 키나제는 세포막에 결합하는 것으로 발견 될 수있다 히스티딘 키나아제의 양보다 크다. 참고 : 사용되는 장치에 따라, 치료는 니트로 셀룰로오스에 구멍을하지 않도록주의해야합니다. 반응 모두 번째와 연락을했음을 관찰전자 니트로 셀룰로오스. 일부 또는 모든 반응이 웰의 벽에 부착하고, 니트로 셀룰로스에 도달하지하는 것이 용이하다. </li><li> 얼음처럼 차가운 25 mM의 H 3 PO 4의 100 μL로 우물을 씻으십시오. 이 모든 반응을 완전히 로딩을 보장 막에 도달하는 웰에 포획되었을 수있는 반응 부피를 허용 할 것이다. 전체 볼륨이 멤브레인을 통과 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 장치를 해체하고 니트로 셀룰로오스 막에 전사 <ol><li> 조심스럽게 진공을 차단하기 전에 장치를 분해. 장치 및 니트로 셀룰로오스 막 모두가이 시간에 방사성 있음을 알려드립니다. 이 시간에 차 컨테이너에서 모든 장치의 구성 요소를 제거하지 마십시오. </li><li> 집게로 조심스럽게 약 200㎖에 25 밀리미터 빙냉 H 3 PO 4 컨테이너에 장치로부터 니트로 셀룰로오스 막 옮긴다. 세척은 라디에이터 수있는 바와 같이,이 용기에 뚜껑을 배치oactive. 이때, 진공이 차단 될 수있다. </li></ol></li></ol> 4. 니트로 셀룰로오스 처리 <ol><li> 니트로 셀룰로오스 세척 <ol><li> 로커의 세척 막과 용기를 놓습니다. 막 부드럽게 20 분 동안 흔들 수 있습니다. </li><li> 20 분 후, 조심스럽게 큰 버킷에 사용할 세척액 임시 폐기물 저장에 사용되는 디 캔트. 막 반복에 얼음처럼 차가운 25 mM의 H 3 PO 4의 200 ㎖를 추가합니다. 참고 : 적어도 세 20 분 세척 배경 막에서 -ATP 신호 [32 P γ-] 제거하는 것이 필요하다. 세 번째 세척 후, 가이거 카운터와 방사선의 사용 세척 솔루션을 테스트합니다. 신호가 세척 용액에 존재하지 않을 때까지 상술 한 바와 같이 상기 멤브레인을 세척 계속. </li></ol></li><li> 니트로 셀룰로오스 건조 <ol><li> 막 충분히 세척 한 후, 간단히 공기 건조를 막을 수 있습니다. 이것은 일반적으로 5 분 이하 소요됩니다.</li></ol></li></ol> 저장 형광체 화면 5. 노출 참고 :이 섹션은 선택 사항입니다. 형광면에 막을 노출시키는 단계는 상기 멤브레인의 각 지점에서의 방사성 표지 된 키나제의 강도의 시각화를 허용하는 것이 유리하다. 이러한 스폿의 상대 강도가 ​​각각의 스폿에서의 인산화 히스티딘 키나아제의 양에 정비례한다. 또한 부 (7)에서 생성되는 행의 강도를 화상 처리 소프트웨어를 정량화 할 수 있고, 이러한 결과를 비교할 수 있으며,이 단계는 품질 관리를 허용한다. 이 검사에서 볼 수 이상이 섬광 계수에서 얻은 불규칙한 결과를 설명 할 수 있습니다. <ol><li> 형광면 준비 <ol><li> 저장 형광면에 막을 노광하기 전에, 5 분 이상 백색광 형광면을 노출. 이것은 스크린에 의해 유지 될 수있는 임의의 잔상이 소거되는 것을 보장한다. </li><li> 화면이 깨끗한 지 확인건조. 필요한 경우, 부드럽게 화면 제조 업체에 의해 승인 형광체 화면 청소 용액으로 화면을 청소, 건조 닦아냅니다. </li></ol></li><li> 니트로 셀룰로오스 막 제제 <ol><li> 조심 형광면 손상으로부터 잔류 수분을 방지하기 위해 얇은 플라스틱 랩 드라이 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 포장. 주름이나 기포가 더 없는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 형광체 화면에 노출 <ol><li> 스토리지 형광체 화면 카세트에 랩 된 니트로 셀룰로오스 막 배치 막 상에 스크린면이 아래를 놓고 카세트를 닫습니다. 카세트를 열거 나 노출시 막 이동은 두 번이나 얼룩 져 이미지를 캡처하는 원인이됩니다대로, 형광체 화면을 스캔하는 시간이 될 때까지 멤브레인을 이동하지 마십시오. </li><li> 한 형광면 제조 있듯이 적어도 4 시간 동안 노출하거나. </li><li> 노광이 완료되면, 형광면을 스캔하여 형광 스캐너로 이미지를 캡처. </li></ol></li></ol> 섬광 계수에 대한 니트로 셀룰로오스 막 준비 (6) <ol><li> 폰소 s 염색과 탈색 <ol><li> 간단히 폰소 s 염색 액에 담가 니트로 셀룰로오스 막 (0.1 % 폰소 s를 (W / v)의 5 % 아세트산) 1 - 2 분. 탈색하기 전에 얼룩 전체 막을 젖은. </li><li> 막에서 초과 폰소 s를 가만히 따르다. </li><li> 히스티딘 키나제 만 반점이 물들 때까지 DDH 2 O와 멤브레인을 씻어. 모든 관광 명소 단백질의 검출 금액을 포함 할 경우이 절차에만 작동합니다. 참고 :이 단계는 키나제는 니트로 셀룰로오스에 결합되어 있는지 확인하는 것이 필요하고, 그 단백질 로딩도 모든 장소에 걸쳐있다. 또한 발견 키나아제 용이 막으로부터 절단 할 수있다. </li></ol></li><li> 관광 명소를 절단 <ol><li> 가위를 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에 각각 자리를 잘라. 아론 완벽하게 절단 할 필요가 없습니다g 염색 스폿의 가장자리; 막 충분히 세척 한 경우, 때문에 잘라 관광 명소의 다양한 크기 배경은 무시할 수 있습니다. 각 반응에 대한 전체 자리를 잘라 만 중요합니다. </li><li> 집게를 사용하여 조심스럽게 섬광 유리 병에 각각 자리를 옮긴다. 32 P가 체렌 코프 효과에 의해 쉽게 검출 할 어떠한 섬광 칵테일이 필요하지 않습니다. 참고 : 또는, 그 자리가 날카롭게 코르크 구멍 뚫는을 사용하여 절단 할 수 있습니다. 코르크 구멍 뚫는와 니트로 셀룰로오스에서 각 지점을 제거하고 핀으로 섬광 유리 병에 밀어 넣습니다. 이 방법으로, 상기 멤브레인은 상기 방사선 노출을 최소화 접촉 할 필요가 없다. </li></ol></li><li> [γ- 32 P] -ATP 솔루션의 결정 CPM / pmol의 <ol><li> 의 명소 몇 희석 1cm 니트로 셀룰로오스의 X 1cm 사각형 위에 -ATP 용액 (1.5 절) 32 P γ-]. 간단히 공기 건조. </li><li> 집게를 사용하여 조심스럽게 섬광에 각각의 광장을 전송유리 병. 어떤 섬광 칵테일이 필요하지 않습니다. 이들 샘플은 ATP 용액의 CPM / pmol의을 결정하는 표준 곡선을 생성하는데 사용된다. </li></ol></li></ol> 7. 섬광 계수 <ol><li> 섬광 계수기 카세트에 모든 섬광 튜브를로드합니다. 섬광 계수기로로드 카세트. </li><li> 각각의 병에 대한 CPM을 측정하는 섬광 계수 프로그램을 실행합니다. 이러한 데이터는, (6.3)에서 방사성 표지 된 ATP 믹스 CPM / pmol의 함께 각 스팟에 존재하는 인산화 히스티딘 키나아제의 양, 및 따라서 인산화의 속도를 계산하는 데 사용될 수있다. 18, 19 </li></ol>

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</ol>

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우리가 설명했다 니트로 셀룰로오스 결합 분석은 히스티딘 키나제의 특성을하기 이전에 사용 된 방법에 비해 많은 장점을 가지고있다. 전통적인 SDS / PAGE 계 오토 라디오와 비교하여, 우리의 방법은 높은 처리량과 더 짧은 시간이 소요된다. 니트로 셀룰로오스 막을 SDS 겔에 비해 취급이 용이하며, 고정 될 필요는 없다. 단백질 명소가 가시화 될 때까지 니트로 셀룰로오스를 염색 개양귀비 빛이 있습니다. 이 섬광 계수에 대한 각 자리를 잘라, 단백질 로딩이 모든 점에서 일관성이 있는지 결정하는 쉬운 방법을 제공합니다. 각각의 스폿의 섬광 계수에 용이도 3b에 도시 된 표준 곡선의 기울기를 이용하여 반응 속도로 변환 될 수있는 정확한 결과를 제공한다. 저장 형광면에 니트로 셀룰로오스 막을 노광하는 실험의 전체 지속 시간을 추가하지만,이 단계 블롯의 성공에 대한 통찰력을 제공한다. 어떤섬광 계수 데이터에서 발견되는 잠재적 불일치 상보 형광 이미지에 의...

적응 반응은 박테리아의 생존을 위해 매우 중요하다. 검출 및 환경 변화에 대응하기 위해, 박테리아는 이성 신호라고도 자극 - 반응 시스템을 사용한다. 전형적인 2 성분계 1,2-는 히스티딘 키나아제는 동족 자극 검출의 보존 히스티딘 잔기 autophosphorylates 후 반응 조절 단백질의 수신기 영역에 보존 된 아스파 테이트 잔기에 인산을 전송한다. (3)이 이벤트는 하류 효과를 자극 반응 조절제의 활성의 변화를 트리거한다. 4,5- 따라서, 박테리아 감지 지역 환경의 변화에 적응할 수있다. 어떤 두 개의 구성 요소 경보 시스템이 원형에서 이탈. 어떤 경우에는, 히스티딘 키나아제의 감각 영역 직접 감각 입력을 검출하고 단백질 - 단백질 상호 작용을 통해 키나아제 활성을 수정 독립형 단백질이다. 6 - 그러나 8, 펀드amental 처리 시스템의 전체적인 역할은 동일하다. 이성 시그널링은 박테리아의 생존에 필수적이다 유비쿼터스 - 응답 시스템 및 히스티딘 키나제는 신호 전달에 중요한 역할을한다. 9 세균 생물학 히스티딘 키나제의 중요성에도 불구하고, 그들은 가난 특성화 남아있다. 이것은 phosphohistidine의 고유 한 불안정성과 인산화를 측정하는 실제적인 방법의 결여에 기인한다. Phosphohistidine는 포스 포세린, phosphothreonine 및 포스보다 더 불안정하다. 10 따라서, 일반적으로 빼앗아 /의 Thr / 티르 키나제를 분석하는 데 사용되는 기술은 히스티딘 키나제에 대한 적용되지 않습니다. 히스티딘 키나제을 연구하는 11 체외 분석은 크게 SDS-PAGE의 오토 라디오 그래피로 제한되어있다. 이 방법은 12, 13, [γ- 32 P] -ATP은 키나제와 함께 배양하고, 키나제 인산화 POL로 분석yacrylamide 겔 전기 영동 (PAGE)은 겔의 오토 라디오 그래피 하였다. 이 방법은 반응 조절기 키나아제의 인산화 키나아제뿐만 아니라 phosphotransfer을 모니터링하는데 사용될 수있다. 그러나,이 방법에 띄는 결점이있다. 페이지 기반 분석은 낮은 처리량 및 시간 소모적이다. 이러한 제한은 단백질의 특성과 운동 매개 변수를 확인하는에 도움이되지 않습니다. 최근 발표 된 히스티딘 키나아제를 연구하기위한 다른 방법은 인산화를 검출 phosphohistidine 항체를 이용한다. 이 방법은 1, 3 phosphohistidine phosphohistidine 구별하는 이점을 갖지만 (14)는 검출에 이용되는 장비에 따라서,이 방법은 넓은 동적 범위 또는 검출의 높은 상한을 제공하지 않을 수있다. 따라서, 이러한 중요한 단백질을 연구하는데 사용될 수있는 빠르고 덜 힘든, 더욱 민감한 분석이 필요하다. 여기, 우리가 설명하고 D시험관 내에서 정제 된 박테리아 히스티딘 키나아제의 인산화를 정량화하는데 사용될 수있는 니트로 셀룰로오스 신중 개발 결합 분석을 emonstrate. 이 분석은 높은 처리량과 PAGE 기반 분석법보다 시간이 덜 걸린다. 이 방법은 또한 검출 및 큰 동적 범위의 높은 상한을 구비 phosphohistidine 정량 용 체렌 코프 효과를 이용한다. 상기 분석은 히스티딘 키나아제에 대한 운동 매개 변수를 결정하기 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>인산</td><td>VWR</td><td>AAAA18067-AP</td><td>담금질 반응 및 세척 용 니트로 셀룰로오스</td></tr><tr><td>트리스 염기</td><td>RPI</td><td>T60040-5000.0</td><td>Tris-HCl pH 8.0, 키나아제 반응 완충액 용</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>RPI</td><td>P41000-2500.0</td><td>키나아제 반응 완충액 용</td></tr><tr>염화<td>마그네슘</td><td>RPI</td><td>M24000-500.0</td><td>키나아제 반응 완충액</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>RPI</td><td>G22020-4000.0</td><td>키나아제 반응 버퍼</td></tr><tr><td>5'-ATP</td><td>Promega</td><td>E6011</td><td>키나아제 기질</td></tr><tr><td>[&감마;-32P]-5'-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002Z250UC&nbsp;</td><td>6,000 Ci/mmol</td></tr><tr><td>96-well 도트 블롯 장치</td><td>Bio-rad</td><td>1706545</td><td>스포팅 반응용</td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스</td><td>Whatman</td><td>32-10401396-PK</td><td>스포팅 반응용</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma aldrich</td><td>P3504-50G</td><td>니트로셀룰로오스 염색용</td></tr></tbody></table>

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

우리는 정제된 박테리아 히스티딘 키나아제의 자가인산화를 정량화하는 유용한 방법을 보여줍니다. 히스티딘 키나아제는 박테리아가 환경 자극을 감지하고 반응하는 유비쿼터스 시스템인 2성분 신호 전달에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 2성분 신호전달은 히스티딘 키나아제의 자가인산화(autophosphorylation)에 이어 반응 조절 단백질의 수용 도메인(receiver domain)으로 인산화(phosphotransfer)를 통해 궁극적으로 출력 반응을 유도합니다. 히스티딘 키나아제의 자가인산화는 동족 환경 자극의 존재에 반응하여 박테리아가 환경 변화를 감지하고 반응할 수 있는 수단을 제공합니다. 박테리아 생물학에서의 중요성에도 불구하고, 히스티딘 키나아제는 포스포히스티딘의 선천적인 불안정성으로 인해 잘 이해되지 않고 있습니다. SDS-PAGE 자가방사선 촬영과 같은 이러한 단백질을 연구하는 기존 방법에는 상당한 단점이 있습니다. 당사는 히스티딘 키나아제를 특성화하는 데 사용할 수 있는 니트로셀룰로오스 결합 분석을 개발했습니다. 이 분석을 위한 프로토콜은 간단하고 실행하기 쉽습니다. 당사의 방법은 SDS-PAGE 자동 방사선 촬영보다 처리량이 높고 시간이 많이 소요되며 동적 범위가 더 큽니다.

<html> 대표 데이터 집합 형광체 이미 저 (도 1) 니트로 셀룰로오스 막, 폰소 s 염색 (도 2), 및 섬광 계수 데이터 (도 3)로 촬영 한 화상을 갖춘 생성 하였다. 그림 3a는 위버 - 버크 플롯에서 효소 반응 속도 상수를 보여줍니다. 이러한 결과는 그램 음성 종 비브리오 파라 헤 몰리 티 커스 (유전자 ID 1189383)로부터 정제 된 히스티딘 키나아제를 사용하여 수득 하였다. 키나제를 정화하는 데 사용되는 프로토콜은 섹션 1.1에 기재되어있다. 반응의 최종 키나아제 농도 7.5 μM이었다. 최종 ATP 농도는 0 μM부터 1.28 밀리미터였다. 에서 [γ- 32 P] -ATP 솔루션은 171.97 CPM / pmol의의 ATP했다. 이러한 데이터는 모든 우리 기재 한 절차에 따라 하루에 생성 될 수...

우리는 정제된 박테리아 히스티딘 키나아제의 자가인산화를 정량화하는 데 사용할 수 있는 최적화된 니트로셀룰로오스 결합 분석을 보고하고 시연합니다. 우리의 방법은 전통적인 SDS-PAGE 기반 기술에 비해 몇 가지 장점이 있어 이러한 중요한 단백질을 특성화하기 위한 귀중한 대안을 제공합니다.

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 정제된 박테리아 히스티딘 키나아제의 자가인산화를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 2성분 신호 전달 분야의 핵심 질문, 예를 들어 단백질-단백질 상호작용에서 인지 자극이 히스티딘 키나아제의 자가인산화에 미치는 영향과 같은 의문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 고처리량 방법이라는 점이며, 형성된 피코몰 단위의 phosphohistidine을 정확하게 검출하고 histidine kinase의 동역학적 파라미터를 얻는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 박사후 연구원으로서 저는 단백질 결합 방사성 리간드를 정량화하기 위해 니트로셀룰로오스 막 여과법을 사용해 왔습니다. 따라서 세균성 histidine kinase의 histidine 인산화를 정량화하기 위해 이와 유사한 기술을 개발하는 것이 타당하다고 판단했습니다.텍스트 프로토콜에 기술된 대로 시약과 재료를 준비하여 이 절차를 시작하십시오. 96-웰 도트-플롯 장치를 설정하려면, 8cm x 12cm 크기로 니트로셀룰로스 막을 자릅니다. 도트-플롯 장치 내에 니트로셀룰로스를 배치하십시오.멤브레인이 장치에 잘 밀착되어 밀봉되고 모든 웰이 멤브레인으로 완전히 덮였는지 확인하십시오. 여과액을 수집하려면 장치를 보조 사이드암 플라스크에 연결하십시오. 밸브 스템에 적절한 튜브를 연결하여 보조 플라스크가 기울어지지 않고 장치를 편리하게 사용할 수 있도록 하십시오.그런 다음, 보조 사이드암 플라스크를 아스피레이터 진공원에 연결합니다. 장치에 진공을 가하여 장치가 완전히 밀폐되었는지 테스트합니다. 장치가 올바르게 조립되었다면, 모든 웰에 강한 진공이 형성될 것입니다.모든 튜브 연결 부위는 밀폐를 확실히 하기 위해 Parafilm 또는 Saran wrap으로 감쌀 수 있습니다. 시작 전, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 4가지 반응 성분을 모두 4X 스톡 용액으로 준비하십시오. 반응 버퍼, 히스티딘 키나아제 및 2중 증류수를 동일한 부피로 혼합하십시오.이 반응 성분들이 실온에서 잠시 동안 평형을 이룰 수 있게 둡니다. 반응을 시작하려면 gamma-32 P ATP 용액 1부피를 첨가하고 피펫팅으로 섞어줍니다. 타이머로 반응 경과 시간을 측정하며 원하는 시간 동안 반응이 진행되도록 합니다.반응을 정지시킵니다. 반응액의 일부를 325 millimolar 인산에 첨가합니다. 모든 반응이 정지될 때까지 정지시킨 반응액을 즉시 얼음에 둡니다.미리 조립된 96-웰 닷-플롯 장치를 2차 용기에 넣습니다. 사용 후 장치와 멤브레인이 방사성 물질로 오염되므로, 이 용기는 장치를 내부에서 쉽게 분해할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 96-웰 닷-플롯 장치에 진공을 가합니다.장치가 진공 상태가 되면, 켄칭된 반응물을 각 웰의 니트로셀룰로오스 막 위에 조심스럽게 피펫으로 분주합니다. 모든 반응물이 막에 로딩될 때까지 이 과정을 반복합니다. 니트로셀룰로오스의 결합 용량은 점적된 histidine kinase의 양보다 크기 때문에, 올바르게 로딩되었다면 kinase의 거의 전부가 막에 결합된다고 가정할 수 있습니다.사용하는 장치에 따라 니트로셀룰로오스가 뚫리지 않도록 주의하십시오. 모든 반응액이 니트로셀룰로오스에 접촉했는지 확인하십시오. 반응액의 일부가 웰의 벽면에 달라붙기 쉽습니다.100 µL의 얼음처럼 차가운 25 mM 인산으로 웰을 세척합니다. 이를 통해 웰에 갇혀 있을 수 있는 모든 반응 부피가 멤브레인에 도달하게 하여, 모든 반응물이 완전히 로딩되도록 합니다. 전체 부피가 멤브레인을 통해 모두 흘러내리도록 둡니다.진공을 끄기 전에 장치를 조심스럽게 분해하십시오. 이때 장치와 니트로셀룰로오스 막 모두 방사능을 띠고 있음에 유의하십시오. 보조 용기에서 장치 구성 요소를 외부로 꺼내지 마십시오.핀셋을 사용하여 니트로셀룰로스 막을 장치에서 약 200 milliliters의 25 millimolar 얼음처럼 차가운 인산 용액이 담긴 용기로 조심스럽게 옮깁니다. 세척 과정 중 방사성 물질이 발생하므로 용기에 뚜껑을 덮으십시오. 이때 진공 장치는 꺼도 됩니다.세척 막이 들어 있는 용기를 로커(rocker) 위에 놓습니다. 막이 20분 동안 부드럽게 흔들리도록 둡니다. 20분 후, 사용한 세척액을 임시 폐기물 저장용 대형 버킷에 조심스럽게 따라 냅니다.200 milliliters의 ice cold 25 millimolar 인산을 막에 첨가합니다. 막에서 배경 $\gamma$-32 P ATP 신호를 제거하기 위해 이 방식으로 막을 최소 3회 세척합니다. 3회 세척 후, 사용한 세척액을 가이거 계수기로 방사능 측정합니다.세척액에 더 이상 신호가 나타나지 않을 때까지 막을 계속 세척하십시오. 막이 충분히 세척되면, 일반적으로 5분 이내로 소요되는 짧은 시간 동안 막을 자연 건조시키십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 니트로셀룰로오스를 phosphorus green에 노출시킨 후, Ponceau S 염색 및 탈색을 준비하십시오.니트로셀룰로오스 막을 Ponceau S 염색액에 1~2분 동안 짧게 담급니다. 탈색 전 단계에서 막 전체가 염색액으로 충분히 적셔지도록 합니다. 그 후, 막에서 과잉의 Ponceau S 용액을 따라내어 제거합니다.히스티딘 키나아제(histidine kinase)로 인한 반점만 염색되어 남을 때까지 이중 증류수로 멤브레인을 세척합니다. 이 과정은 모든 반점에 검출 가능한 양의 단백질이 포함되어 있을 때만 유효하다는 점에 유의하십시오. 가위를 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 상의 각 반점을 오려냅니다.염색된 반점의 가장자리를 따라 완벽하게 절단할 필요는 없습니다. 멤브레인을 충분히 세척했다면, 절단된 반점의 크기가 일정하지 않더라도 그로 인한 배경 신호는 무시할 수 있는 수준입니다. 각 반응을 위해 반점 전체를 절단하는 것만이 중요합니다.포셉을 사용하여 각 스팟을 신틸레이션 바이알로 조심스럽게 옮깁니다. phosphorus 32는 체렌코프 방사선으로 쉽게 검출되므로 신틸레이션 칵테일은 필요하지 않습니다. 다음으로, gamma-32 P ATP 용액의 여러 희석액을 1 cm x 1 cm 크기의 니트로셀룰로오스 사각형 위에 스팟합니다.포셉을 사용하여 각 사각형 조각을 신틸레이션 칵테일이 들어있지 않은 신틸레이션 바이알로 조심스럽게 옮깁니다. 이 시료들은 ATP 용액의 피코몰당 분당 계수(counts per minute per picomole)를 결정하기 위한 표준 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. 여기서는 니트로셀룰로오스 막의 폰소(Ponceau) 염색 결과가 표시되어 있습니다.모든 샘플에서 염색이 균일하게 나타나며, 이는 모든 샘플이 동일하게 로딩되었음을 나타냅니다. 니트로셀룰로오스 막의 플루오로그래피 결과는 각 스팟에 있는 방사성 표지 phosphohistidine의 상대적 수준을 보여줍니다. 네 번째와 여덟 번째 행은 과잉 ATP가 니트로셀룰로오스 막에서 세척되었음을 보여주는 음성 대조군입니다.히스티딘 키나아제 자가인산화 정량 분석의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 이 데이터는 멤브레인에서 절단한 각 스팟의 신틸레이션 계수를 통해 생성되었습니다. 여기에 표시된 picomole의 ATP당 분당 계수(counts per minute) 표준 곡선 또한 신틸레이션 계수로 생성되었으며, 각 샘플에 존재하는 phosphohistidine의 picomole 양을 계산하는 데 사용됩니다.본 절차 이후, 인지 자극을 도입하거나 키나아제(kinase) 활성을 조절할 것으로 가설이 세워진 단백질을 추가하는 등의 다른 방법을 실험에 접목하여, 이러한 첨가제가 키나아제 활성에 미치는 영향과 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 방사성 물질을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 유념하십시오. 본 절차를 수행하는 동안에는 적절한 방사선 안전 교육 이수, 개인 보호 장구 착용 및 차폐막 사용과 같은 예방 조치를 항상 준수해야 합니다.

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Research

연구

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Biochemistry

생화학

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단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.

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 종속 키 1 (Cdk1) 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 되 고 많은 세포 경로 조절. 여기, Cdk1, Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별이 중요 한 키의 셀룰러 목표 설정에 대 한 수와 함께 체 외에 니 분석 결과 대 한 프로토콜 선물이.

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배우세요 니트로셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나아제 자가 인산화를 정량하는 방법입니다. 이 고감도 기법은 피코몰 수준의 포스포히스티딘 검출이 가능하여 동역학 연구에 활용됩니다.

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

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