니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

이 프로토콜의 전반적인 목표는 정제된 박테리아 히스티딘 키나아제의 자가인산화를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 2성분 신호 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 히스티딘 키나아제의 자가인산화에 대한 단백질-단백질 상호 작용에서 동족 자극의 효과.

이 기술의 주요 장점은 형성된 포스포히스타딘의 피코몰을 정확하게 검출하고 히스티딘 키나아제에 대한 운동 매개변수를 얻는 데 사용할 수 있는 고처리량 방법이라는 것입니다. 박사 후 연구원으로서 저는 단백질 결합 방사성 리간드를 정량화하기 위해 니트로셀룰로오스 멤브레인에 여과를 사용합니다. 결과적으로, 박테리아 히스티딘 키나아제에서 히스티딘 인산화를 정량화하기 위한 유사한 기술을 개발하는 것이 합리적이었습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시약 및 물질을 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 96웰 도트 플롯 장치를 설정하려면 8cm x 12cm 크기의 니트로셀룰로오스 멤브레인 조각을 자릅니다. 니트로셀룰로오스를 점도표 장치에 배치합니다.

장치가 밀봉되고 모든 웰이 멤브레인으로 완전히 덮이도록 멤브레인이 맞는지 확인합니다. 여과액을 수집하려면 장치를 보조 보조 보조 암류 플라스크에 연결하십시오. 밸브 스템에서 적절한 튜브를 연결하여 보조 플라스크를 기울이지 않고 장치를 편안하게 사용할 수 있도록 합니다.

그런 다음 보조 사이드암 플라스크를 흡인기 진공 소스에 연결합니다. 장치에 진공을 적용하여 장치가 완전히 밀봉되었는지 테스트합니다. 장치가 올바르게 조립되면 모든 우물에 강한 진공이 존재합니다.

모든 튜빙 연결부는 파라필름 또는 사란 랩으로 감싸서 단단히 밀봉할 수 있습니다. 시작하기 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 4개의 반응 성분을 모두 4개의 X 스톡 용액으로 준비합니다. 동일한 부피의 반응 완충액, 히스티딘 키나아제 및 이중 증류수를 혼합합니다.

이러한 반응 성분이 실온에서 짧은 시간 동안 평형을 이루도록 합니다. 반응을 시작하려면 한 부피의 감마-32 P ATP 용액을 추가하고 위아래로 피펫으로 혼합합니다. 타이머로 경과된 반응 시간을 추적하고 원하는 시간 동안 반응이 진행되도록 합니다.

반응을 가라앉히십시오. 반응의 부분 표본을 325 밀리몰 인산에 추가합니다. 모든 반응이 끝날 때까지 담금질된 반응을 즉시 얼음 위에 놓습니다.

사전 조립된 96웰 도트 플롯 장치를 보조 용기에 넣습니다. 이 용기는 사용 후 장치와 멤브레인이 방사성이므로 장치를 쉽게 분해할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 96웰 도트 플롯 장치에 진공을 적용합니다.

장치가 진공 상태가되면 담금질 된 반응을 각 웰의 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 직접 조심스럽게 피펫으로 삽입하십시오. 모든 반응이 멤브레인에 로드될 때까지 이 과정을 반복합니다. 니트로셀룰로오스의 결합 능력이 점박이 히스티딘 키나아제의 양보다 크기 때문에 거의 모든 키나아제가 올바르게 로드될 때 막에 결합한다고 가정할 수 있습니다.

사용하는 장치에 따라 니트로 셀룰로오스에 구멍이 나지 않도록주의하십시오. 모든 반응이 니트로 셀룰로오스와 접촉했는지 관찰하십시오. 일부 반응이 우물의 벽에 달라 붙는 것은 쉽습니다.

100 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 25 밀리 몰의 인산으로 우물을 씻으십시오. 이렇게 하면 웰에 갇혔을 수 있는 모든 반응 부피가 멤브레인에 도달할 수 있어 모든 반응의 완전한 로딩을 보장할 수 있습니다. 전체 부피가 멤브레인을 통해 흐르도록 합니다.

진공 청소기를 끄기 전에 기기를 조심스럽게 분해하십시오. 이때 장치와 니트로셀룰로오스 멤브레인 모두 방사성임을 알려드립니다. 보조 용기에서 장치 구성 요소를 제거하지 마십시오.

겸자를 사용하여 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 장치에서 약 200 밀리리터의 25 밀리 몰 얼음 차가운 인산 용기로 조심스럽게 옮깁니다. 세탁물은 방사능을 띠므로 이 용기에 뚜껑을 덮으십시오. 이때 진공이 차단될 수 있습니다.

세척막이 있는 용기를 로커에 놓습니다. 멤브레인이 20분 동안 부드럽게 흔들리도록 합니다. 20분 후 사용한 세척액을 임시 폐기물 보관용으로 사용할 큰 양동이에 조심스럽게 디캔팅합니다.

멤브레인에 얼음처럼 차가운 25 밀리몰의 인산 200 밀리리터를 추가합니다. 이러한 방식으로 멤브레인을 최소 3회 세척하여 멤브레인에서 배경 gamma-32 P ATP 신호를 제거합니다. 세 번째 세척 후 가이거 계수기로 사용한 세척 용액의 방사선 검사를 실시합니다.

세척 용액에 신호가 없을 때까지 멤브레인을 계속 세척합니다. 멤브레인을 충분히 세척한 후 멤브레인을 잠시 자연 건조시키며, 이는 일반적으로 5분 미만이 소요됩니다. 니트로셀룰로오스를 인 녹색에 노출시킨 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Ponceau S 염색 및 탈염을 준비합니다.

니트로셀룰로오스 멤브레인을 Ponceau S 염색 용액에 1-2분 동안 잠시 담그십시오. staining하기 전에 얼룩으로 전체 멤브레인을 적십니다. 그런 다음 멤브레인에서 여분의 Ponceau S를 디캔팅합니다.

히스티딘 키나아제(histidine kinase)의 반점만 염색될 때까지 이중 증류수로 멤브레인을 헹굽니다. 이 절차는 모든 부위에 검출 가능한 양의 단백질이 포함되어 있는 경우에만 작동합니다. 가위를 사용하여 니트로 셀룰로오스 막의 각 부분을 잘라냅니다.

얼룩진 부분의 가장자리를 따라 완벽하게 자를 필요는 없습니다. 멤브레인을 충분히 세척한 경우 컷아웃 반점의 다양한 크기로 인한 배경은 무시할 수 있습니다. 각 반응에 대해 전체 지점을 잘라내는 것만 중요합니다.

집게를 사용하여 각 지점을 섬광 바이알에 조심스럽게 옮깁니다. 인 32는 체렌코프 방사선에 의해 쉽게 검출될 수 있기 때문에 섬광 칵테일이 필요하지 않습니다. 다음으로, 1cm x 1cm 제곱의 니트로셀룰로오스에 감마-32 P ATP 용액을 여러 번 희석합니다.

집게를 사용하여 각 사각형을 섬광 바이알과 섬광 칵테일로 조심스럽게 옮깁니다. 이러한 샘플은 ATP 용액의 피코몰당 분당 개수를 결정하기 위한 표준 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인의 Ponceau 염색이 여기에 나와 있습니다.

염색은 모든 샘플에서 균일하며, 이는 모든 샘플이 동일하게 로드되었음을 나타냅니다. 니트로셀룰로오스 막의 형광 촬영 결과는 각 지점에서 방사성 표지된 포스포히스티딘의 상대적 수준을 보여줍니다. 네 번째와 여덟 번째 줄은 과도한 ATP가 니트로셀룰로오스 막에서 씻겨 나간다는 것을 보여주는 음성 대조군입니다.

histidine kinase autophosphorylation의 정량화에 대한 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 이 데이터는 멤브레인에서 절단된 각 반점의 섬광 계수에서 생성됩니다. 여기에 표시된 ATP 피코몰당 분당 카운트의 표준 곡선도 섬광 계수에서 생성되며 각 샘플에 존재하는 포스포히스티딘의 피코몰을 계산하는 데 사용됩니다.

이 절차에 따라 동족 자극 또는 키나아제 활성을 조절하는 것으로 가정된 단백질을 도입하는 것과 같은 다른 방법을 실험에 추가하여 키나아제 활성에 대한 이러한 첨가제의 효과와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 방사능을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 방사선 안전 교육, 개인 보호 장비 및 차폐 사용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.