형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기

본 프로토콜의 목적은 바이러스로 라벨링된 뉴런의 형태를 재구성하는 단계를 설명하고, 라벨링된 뉴런 집단에 대해 독립적이고 편향되지 않은 클러스터 분석을 수행하여 서로 다른 뉴런 하위 분류에 따른 형태학적 지표를 포괄적으로 특성화하는 것입니다. 본 연구에서는 선택적 뉴런 집단 내에서 형태학적으로 고유한 뉴런 유형의 보다 포괄적인 샘플링과 편향 없는 분류를 용이하게 하기 위해 신경해부학적 데이터를 수집하고 분석하는 새로운 접근 방식을 제시합니다. 이 기술의 주요 장점은 뉴런 형태의 대규모 분석이 가능하며, 서로 다른 뉴런 하위 분류를 분류하기 위해 편향되지 않은 방법을 활용한다는 점입니다.

형태학적 재구성에서 가장 어려운 부분은 재구성할 잘 분리된 뉴런을 선택하고, 적절한 z-깊이를 할당하며, 인접한 조직 절편 간에 재구성을 이어가기 위해 수지상 돌기를 정렬하는 것입니다. EGFP를 발현하는 변형 광견병 바이러스가 정위 고정법으로 주입된 영장류의 50 micron 뇌 조직 절편이 염색된 슬라이드를 선택하여 재구성을 시작하십시오. 슬라이드를 현미경 슬라이드 홀더에 놓고 저배율 대물렌즈를 사용하여 관심 있는 단일 절편에 초점을 맞추십시오.

카메라 셔터를 적절하게 배치하여 라이브 이미지에 카메라 영상이 보이는지 확인하십시오. 수지상 돌기 분기 구조의 명확한 재구성이 가능하도록 관심 있는 뇌 구조 내에서 적절히 격리된 표지된 뉴런을 선택하십시오. 10x 배율로 전환하고 해당 영역의 초점을 맞추십시오.

세포체의 면적과 원형도를 정확하게 측정하기 위해, 세포체가 단일 절편 내에 완전히 포함된 뉴런을 우선적으로 선택하십시오. 염색이 잘 되고 잘 분리된 뉴런을 선택했다면, 소프트웨어의 새 절편(new section) 버튼을 클릭하여 세포체가 포함된 홈 섹션을 섹션 관리자에 추가하십시오. 재구성 시 포함할 절편 수를 입력하십시오.

처음에는 2~3개의 절편을 삽입하는 것을 권장합니다. 절편 두께를 50 microns로 설정하십시오. 2x 대물렌즈를 선택한 다음, 상단 툴바의 contour 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 contour 유형을 선택하십시오.

마우스를 사용하여 윤곽선을 따라 점을 클릭함으로써 대상 구조의 윤곽을 추적하십시오. 윤곽선 추적을 마친 후, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 메뉴에서 윤곽선 닫기(close contour)를 선택하여 윤곽선을 닫으십시오. 다음으로, 뷰 배율을 2배(two x)로 유지한 상태에서 왼쪽 도구 모음의 원하는 마커 기호를 클릭하십시오.

그런 다음 대상 구조의 중심을 클릭하여 마커를 배치합니다. 윤곽선 설정이 완료되면 40x 또는 60x 대물렌즈를 선택하여 세포체의 외곽선을 추적합니다. 그런 다음 상단 도구 모음에서 뉴런 추적 버튼을 선택하고 드롭다운 메뉴에서 추적할 뉴런 구조(이 경우에는 세포체)를 선택하십시오.

세포체의 가장 넓은 외곽을 따라 지점들을 클릭하여 세포체의 윤곽을 그리고, 필요에 따라 z-깊이를 조정하여 세포체에 초점을 맞추십시오. 그 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 세포체 윤곽 그리기를 마칩니다. 이어서 세포체 윤곽의 중심에 다른 스타일의 마커를 배치하되, 마커가 z-깊이 상으로 대략 중심에 위치하도록 하십시오.

z축 값이 정확하게 측정될 수 있도록, 각 트레이싱을 시작하기 전에 홈 섹션뿐만 아니라 인접 섹션에서도 정확한 z-깊이를 설정하는 것이 중요합니다. 수지상 돌기(dendritic arbors)의 트레이싱을 시작하려면 상단 드롭다운 메뉴에서 dendrite를 선택하십시오.

그런 다음 세포체에서 시작하여 각 수지상돌기를 추적합니다. 수지상돌기가 분지될 때, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 분지점(bifurcating node) 또는 삼분지점(trifurcating node)을 선택하여 해당 분지 지점에 노드를 배치합니다. 수지상돌기의 각도와 방향을 정확하게 포착할 수 있도록 추적 과정 전반에 걸쳐 z-깊이를 적절히 조절하십시오.

이 섹션의 수상돌기 끝부분에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 ending을 선택하십시오. 홈 섹션의 모든 수상돌기 분지 추적이 완료되면, 인접한 섹션으로 이어질 가능성이 높은 수상돌기 말단을 식별하십시오. 그리고 현미경 이미지의 20배율에서 적절한 z-깊이로 이 부분들을 초점에 맞추십시오.

현미경 이미지에 혈관이나 쉽게 식별 가능한 수지상 돌기 패턴 또는 다발과 같은 주변의 주요 표지물을 포함하십시오. 다음으로, 컴퓨터 화면에 디지털 카메라를 대고 실시간 이미지의 사진을 찍으십시오. 그 후 현미경 대물렌즈를 2x로 변경하고 슬라이드의 인접한 절편으로 이동하십시오.

그런 다음 소프트웨어 뷰에서 이전에 추적한 섹션의 윤곽선을 새 섹션의 LGN 및 TRN 경계에 맞춥니다. 20배율로 돌아가 랜드마크를 사용하여 정렬합니다. 이후 이전 섹션에서 추적한 수지상 돌기 말단 사진을 참고하여, 먼저 화살표 도구로 재구성물을 선택한 다음 추적선을 이동시켜 수지상 돌기를 정렬합니다.

그 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 'move'를 선택하여 트레이싱을 적절하게 이동시킵니다. 트레이싱을 회전시키려면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 'rotate'를 선택하여 트레이싱을 적절하게 회전시킵니다. 또는 상단 도구 드롭다운에서 'match' 도구를 선택하고 일치시킬 포인트 수를 선택하십시오.

그런 다음 재구성된 이미지의 끝점과 라이브 이미지의 해당 연속 지점을 클릭하여 수지상 돌기 끝과 시작 지점을 일치시킵니다. 이전 섹션의 트레이싱이 새 섹션의 수지상 돌기와 정렬되면, 이전과 동일하게 섹션 관리자에 새 섹션을 추가하십시오. 또는, 이전에 생성된 인접 섹션을 단순히 선택하고 동일한 방식으로 z-깊이를 조정하십시오.

현재 섹션을 클릭하여 섹션 관리자에서 해당 새 섹션이 선택되었는지 확인하십시오. 그런 다음 배율을 40x 또는 60x로 높인 후, 화살표를 사용하여 수지상 돌기를 선택하십시오. 이전 섹션의 수지상 돌기 끝부분에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 '끝에 추가'를 선택하십시오.

연속 부분이 새로운 섹션에 있는지 묻는 프롬프트가 나타나면 '예'를 클릭하십시오. 그런 다음 마우스를 그리기 도구로 사용하여 수상돌기의 연속 부분을 추적하십시오.

다음 절편과 정렬하기 위해 말단 부위의 이미지를 촬영합니다. 그 후, 해당 뉴런에 대해 최소 3개 이상의 절편이 추적될 때까지, 또는 수상돌기를 더 이상 추적하거나 찾을 수 없을 때까지 수상돌기 추적의 연속 부분을 추가합니다. 뉴런 재구성 시스템과 연동된 추출 프로그램을 사용하여 완료된 재구성 파일을 엽니다.

편집 드롭다운 메뉴에서 모든 객체 선택을 선택하십시오. 상단 분석 툴바에서 분지 구조 분석을 선택한 다음, 각 탭을 클릭하여 각 탭에서 원하는 분석 옵션을 선택하십시오. 분석 창의 확인 버튼을 클릭하여 원하는 모든 데이터를 추출하고, 출력 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 후 분석을 위해 Excel로 내보내기를 선택하여 스프레드시트 형식으로 저장하십시오.

이 사진은 한 동물의 등쪽 LGN을 통과하는 단일 관상면 절편을 보여줍니다. LGN 층을 시각화하기 위해 시토크롬 산화효소 염색이 사용되었습니다. 그리고 GFP 염색은 바이러스 주입 부위를 표시합니다.

화살표는 역행성으로 표지된 밀집된 시상망상핵 뉴런 영역을 나타냅니다. 절편의 방향은 표시된 등측-복측-내측-외측 방위표에 따릅니다. 스케일 바는 왼쪽 하단 모서리에 표시되어 있습니다.

이 이미지는 검은색 윤곽선으로 표시된 바이러스 주입이 포함된 모든 단면에서 LGN은 빨간색, TRN은 밤색의 윤곽선으로 나타낸 것입니다. 노란색 별은 주입 지점의 중심을 나타냅니다. 이 이미지는 윤곽선과 주입 지점의 3D 렌더링을 보여줍니다.

이것은 갈색으로 표시된 단일 통합 TRN 윤곽 내의 클러스터 할당에 따라 색상으로 구분된 재구성된 TRN 뉴런 위치 지도입니다. 스케일 바는 500 microns를 나타냅니다. 이 이미지는 검은색의 TRN 통합 윤곽과 회색의 LGN을 보여주며, 5개의 재구성된 TRN 뉴런이 TRN 내의 내측-외측 위치에 따라 따뜻한 색에서 차가운 색으로 표시되어 있습니다.

스케일 바는 500 microns를 나타냅니다. 이 사진들은 동일한 5개 TRN 뉴런의 상세 모습을 보여주며, 색상이 일치하는 스케일 바는 100 microns를 나타냅니다. 이 계층적 덴드로그램 트리는 10가지의 독립적인 형태학적 지표를 기반으로 재구성된 160개 TRN 뉴런 간의 연결 거리를 보여주며, 군집 분석의 전반적인 결과를 나타냅니다.

TRN 뉴런의 세 가지 뚜렷한 클러스터가 파란색, 녹색, 빨간색으로 표시되어 있습니다. 이러한 뉴런 재구성 기술을 숙달하면 단일 뉴런을 1~2시간 만에 완전히 재구성할 수 있습니다. 뉴런을 재구성하는 동안 z-깊이를 지속적으로 모니터링하고 조정하는 것이 중요합니다.

여기에 설명된 프로토콜은 기존의 더 편향된 신경해부학적 분석 방법보다 개선된 방식으로, 연구자가 대규모 형태학적 데이터를 기반으로 새로운 뉴런 하위 분류군을 탐색할 수 있게 합니다. 이 영상을 시청한 후에는 인접한 조직 절편을 통해 뉴런을 재구성하고, 추가 분석을 위한 형태학적 데이터를 추출하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.