형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기

이 프로토콜의 목표는 바이러스 표지된 뉴런의 형태를 재구성하는 단계를 설명하고 표지된 뉴런 집단에 대해 독립적이고 편향되지 않은 클러스터 분석을 수행하여 고유한 뉴런 하위 클래스를 따라 형태학적 메트릭을 포괄적으로 특성화할 수 있도록 하는 것입니다. 우리는 선택적 신경 세포 집단 내에서 형태학적으로 고유한 신경 세포 유형에 대한 보다 포괄적인 샘플링 및 편견 없는 분류를 촉진하기 위해 신경 해부학적 데이터를 수집하고 분석하는 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 신경 세포 형태에 대한 대규모 분석을 가능하게 하고 편향되지 않은 방법을 활용하여 고유한 신경 세포 하위 분류를 분류한다는 것입니다.

형태학적 재구성의 가장 어려운 측면은 재구성할 잘 격리된 뉴런을 선택하고, 적절한 z 깊이를 할당하고, 인접한 조직 절편을 가로질러 재건을 계속하기 위해 수목을 정렬하는 것입니다. EGFP를 발현하는 변형된 광견병 바이러스를 입체택학적으로 주입한 영장류에서 염색된 50미크론 뇌 조직 단면이 있는 슬라이드를 선택하여 재구성을 시작합니다. 슬라이드를 현미경 슬라이드 홀더에 놓고 저배율 대물렌즈를 사용하여 관심 있는 단일 섹션에 초점을 맞춥니다.

카메라 셔터를 적절하게 배치하여 라이브 이미지에서 카메라 이미지가 보이는지 확인하십시오. 관심 있는 뇌 구조 내에서 합리적으로 격리된 표지된 뉴런을 선택하여 수지상 수목화(dendritic arborization)를 명확하게 재구성할 수 있습니다. 10배 배율로 전환하고 영역에 초점을 맞춥니다.

세포체가 단일 섹션 내에 완전히 있는 경우 뉴런을 선택하여 세포의 면적과 진원도를 정확하게 추정하는 것이 좋습니다. 잘 염색되고 잘 격리된 뉴런이 선택되면 소프트웨어에서 새 섹션 버튼을 클릭하여 세포체를 포함하는 홈 섹션을 섹션 관리자에 추가합니다. 재건에 포함할 단면 수를 입력합니다.

시작하려면 2-3개의 섹션을 삽입하는 것이 좋습니다. 단면 두께를 50미크론으로 지정합니다. 두 개의 x 목표를 선택한 다음 상단 도구 모음에서 윤곽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 윤곽 유형을 선택합니다.

마우스를 사용하여 윤곽선을 따라 점을 클릭하여 대상 구조의 윤곽을 추적합니다. 윤곽선 추적이 완료되면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 메뉴에서 윤곽선 닫기를 선택하여 윤곽선을 닫습니다. 다음으로, 뷰가 여전히 2 x에 있는 상태에서 왼쪽 도구 모음에서 원하는 마커 기호를 클릭합니다.

그런 다음 대상 구조체의 중심을 클릭하여 마커를 배치합니다. 윤곽이 완성되면 40x 또는 60x 대물렌즈를 선택하여 세포체의 윤곽을 추적합니다. 그런 다음 상단 도구 모음에서 뉴런 추적 버튼을 선택하고 드롭다운 메뉴에서 추적할 뉴런 구조(이 경우 세포체)를 선택합니다.

세포체의 가장 큰 범위 주위의 점을 클릭하여 세포체를 추적하고, 세포체에 초점을 맞추기 위해 필요에 따라 z 깊이를 조정합니다. 그리고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 세포체 윤곽을 완성합니다. 다음으로, 세포체 윤곽의 중앙에 다른 스타일 마커를 배치하여 마커가 z 깊이의 중심에 대략적으로 오도록 합니다.

홈 섹션에서 올바른 z-깊이를 설정하는 것이 중요합니다.인접 섹션뿐만 아니라 Z-축 값이 정확하도록 각 추적을 시작하기 전에. 수지상 아버 추적을 시작하려면 상단 드롭다운 메뉴에서 수상돌기를 선택합니다.

그런 다음 세포체에서 시작하여 각 수상돌기를 추적합니다. 덴드라이트가 분기되면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 분기 노드 또는 삼분기 노드를 선택하여 이 분기점에 노드를 배치합니다. 덴드라이트의 각도와 방향을 정확하게 캡처할 수 있도록 추적 전체에서 z-깊이를 조정해야 합니다.

이 섹션의 수상돌기 끝에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 ending을 선택합니다. 모든 수지상 가지나무가 홈 섹션에서 추적될 때 인접한 섹션으로 계속될 가능성이 있는 수지상 말끝을 식별합니다. 그리고 20x에서 현미경 이미지의 적절한 z-깊이에서 초점을 맞춥니다.

현미경 이미지에 혈관 또는 쉽게 알아볼 수 있는 수상돌기 패턴 또는 다발과 같은 근처의 주요 랜드마크를 포함합니다. 다음으로, 컴퓨터 화면에 핸드헬드 디지털 카메라를 사용하여 라이브 이미지를 촬영합니다. 그런 다음 현미경 대물렌즈를 2x로 전환하고 슬라이드의 인접 섹션으로 이동합니다.

그런 다음 소프트웨어 보기에서 이전에 추적한 섹션의 윤곽을 새 섹션의 LGN 및 TRN 경계와 정렬합니다. 20x로 돌아가 랜드마크를 사용하여 정렬합니다. 그런 다음 이전에 추적한 섹션의 수상돌기 끝 사진을 사용하여 먼저 화살표 도구를 사용하여 재구성을 선택하여 추적을 이동하여 수상돌기를 정렬합니다.

그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 이동을 선택하고 그에 따라 추적을 이동합니다. 트레이싱을 회전하려면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 회전을 선택한 다음 그에 따라 트레이싱을 회전합니다. 또는 상단 도구 드롭다운에서 일치 도구를 선택하고 일치시킬 포인트 수를 선택합니다.

그런 다음 재구성의 끝부분과 라이브 이미지에서 해당 연속 지점을 클릭하여 수지상 끝을 시작과 일치시킵니다. 이전 섹션의 트레이싱이 새 섹션의 수상돌기와 정렬되면 이전과 같이 섹션 관리자에 새 섹션을 추가합니다. 또는 이전에 생성된 인접 섹션을 선택하고 동일한 방식으로 z-depth를 조정하기만 하면 됩니다.

현재 섹션을 클릭하여 섹션 관리자에서 해당 새 섹션이 선택되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 배율을 40배 또는 60배로 늘린 후 화살표를 사용하여 수상돌기를 선택합니다. 이전 섹션의 수상돌기 끝에 있는 마우스를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 Add to ending을 선택합니다.

연속 작업이 새 섹션에 있는지 묻는 메시지가 표시됩니다. 예를 클릭합니다. 그런 다음 마우스를 그리기 도구로 사용하여 수상돌기의 연속을 추적합니다.

다음 섹션에 정렬하기 위해 준비하기 위해 끝 부분의 이미지를 촬영합니다. 그런 다음 뉴런에 대해 최소 3개의 절편이 추적될 때까지 또는 수상돌기를 더 이상 추적하거나 찾을 수 없을 때까지 수상돌기 추적에 연속을 추가합니다. 뉴런 복원 시스템과 연결된 추출 프로그램을 사용하여 완료된 복원 파일을 엽니다.

편집 드롭다운 메뉴에서 모든 개체 선택을 선택합니다. 상단 분석 도구 모음에서 분기 구조 분석을 선택한 다음 각 탭을 클릭하고 각 탭에서 원하는 분석 옵션을 선택합니다. 분석 창에서 확인 버튼을 클릭하여 원하는 모든 데이터를 추출하고 출력 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 추가 분석을 위해 Excel로 내보내기를 선택하여 스프레드시트 형식으로 저장합니다.

이 사진은 한 동물의 등쪽 LGN을 통한 단일 관상 단면을 보여줍니다. 사이토크롬 산화효소 염색은 LGN 층을 시각화하는 데 사용됩니다. 그리고 GFP 염색은 바이러스 주입 부위를 표시합니다.

화살표는 조밀하고 역행성으로 표지된 시상 망상 핵 뉴런의 영역을 나타냅니다. 단면 방향은 그림에 표시된 dorsal ventral medial lateral compass에 따릅니다. 축척 막대는 왼쪽 아래 모서리에 표시되어 있습니다.

이 이미지는 검은색 윤곽으로 표시된 것처럼 바이러스 주입이 포함된 모든 섹션에 대한 LGN의 윤곽 윤곽을 빨간색으로 표시하고 TRN을 적갈색으로 표시합니다. 노란색 별은 주사 부위의 중심을 나타냅니다. 이 이미지는 윤곽선과 사출 부위의 3D 렌더링을 보여줍니다.

이것은 적갈색으로 표시된 단일 응집 TRN 윤곽 내에서 클러스터 할당에 따라 색상으로 구분된 재구성된 TRN 뉴런의 위치 지도입니다. 눈금 막대는 500미크론을 나타냅니다. 이 이미지는 TRN의 검은색 및 LGN의 회색 윤곽을 보여주며, TRN 내의 내측 측면 위치에 따라 따뜻하게 차갑게 착색된 5개의 재구성된 TRN 뉴런을 보여줍니다.

눈금 막대는 500미크론을 나타냅니다. 이 사진은 100미크론을 나타내는 색상 일치 스케일 바가 있는 동일한 5개의 TRN 뉴런의 세부 사항을 보여줍니다. 이 계층적 덴드로그램 트리는 10개의 독립적인 형태학적 메트릭을 기반으로 160개의 재구성된 TRN 뉴런 간의 연결 거리를 보여주고 클러스터 분석의 전반적인 결과를 보여줍니다.

TRN 뉴런의 세 가지 뚜렷한 클러스터가 파란색, 녹색 및 빨간색으로 표시됩니다. 이러한 신경 세포 재구성 기술을 숙달하면 1-2시간 내에 단일 신경 세포를 완전히 재구성할 수 있습니다. 뉴런을 재구성하는 동안 z-depth를 지속적으로 모니터링하고 조정하는 것이 중요합니다.

여기에 설명된 프로토콜은 기존의 보다 편향된 신경 해부학적 분석 방법을 개선한 것으로, 연구자들이 대규모 형태학적 데이터를 기반으로 뉴런의 새로운 하위 분류를 탐색할 수 있도록 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인접한 조직 절편을 통해 뉴런을 재구성하고 추가 분석을 위해 형태학적 데이터를 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.