Name: 형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 학습하세요 수정된 광견병 바이러스로 표지된 뉴런의 형태 재건 및 편견 없는 클러스터 분석 방법을. 이 기술은 대규모 신경 형태학 분석과 뉴런 하위 유형의 정확한 분류를 가능하게 합니다.

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우리는 박사에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 이전 연구와 리비 Fairless 및 Shiyuan 리우의 연결 복원에 대한 도움말의 일환으로 준비 조직을 사용할 수 있도록하기위한 에드 캘러웨이와 마티 Usrey. 그리고 화이트 홀 재단 :이 작품은 NIH (EY018683 NEI)에 의해 투자되었다.

<ol><li>Cajal, S. R. y <a target="_blank" href="https://archive.org/details/b2129592x_0001">Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres</a>. , Maloine. (1911).</li>
<li>Seung, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+functional+connectomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toward functional connectomics.</a> Nature. 471, 170-172 (2011).</li>
<li>Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+circuit+tracing+with+neurotropic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).</li>
<li>Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+neuronal+tracing+with+a+deletion-mutant+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus.</a> Nature Methods. 4, 47-49 (2007).</li>
<li>Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+substrates+for+parallel+streams+of+corticogeniculate+feedback+originating+in+both+V1+and+V2+of+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey.</a> Neuron. 90, 388-399 (2016).</li>
<li>Cauli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+fusiform+neocortical+interneurons+based+on+unsupervised+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering.</a> PNAS. 97, 6144-6149 (2000).</li>
<li>Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+visual+sector+thalamic+reticular+neurons+in+the+macaque+monkey+sugests+retinotopically-specialized%2C+parallel+stream-mixed+input+to+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus.</a> J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/neuron/abstract/S0896-6273(11)00600-3">New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits.</a> Neuron. 71, 617-631 (2011).</li>
<li>Callaway, E. M., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+with+glycoprotein-deleted+rabies+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses.</a> Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).</li>
<li>Nhan, H. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+superior+colliculus-+and+middle+temporal+area-projecting+neurons+in+primate+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex.</a> J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thalamic+reticular+nucleus%3A+structure%2C+function+and+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept.</a> Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, e3564(2012).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Research. 171, 11-28 (1979).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+neuroanatomical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Basic neuroanatomical methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1(2003).</li>
<li>Thorndike, R. L. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10.1.1.177.7605">Who belongs in the family?</a> Psychometrika. 18, 267-276 (1953).</li>
<li>Talebi, V., Baker, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Categorically+distinct+types+of+receptive+fields+in+early+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).</li>
<li>Helmstaedter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomic+reconstruction+of+the+inner+plexiform+layer+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina.</a> Nature. 500, 168-174 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

신경 해부학 연구는 신경 과학 및 connectomics 및 구조 - 기능 관계에서 최근 관심의 기둥이 선택적 신경 인구의 상세한 형태 학적 특성에 대한 열정을 갱신했다 남아있다. 전통적으로, 신경 해부학 적 연구는 전문가 neuroanatomists에 의해 정의 된 신경 세포의 형태 학적으로 별개의 클래스로 신경 질적 분류에 의존하고있다. 신경 세포를 복원 및 형태 학적 데이터를 추출하는 기술의 진보에 의해,이 공평하게 뚜렷한 형태 학적 신경 클래스 분류 정교한 정량적 데이터 분석 방법을 활용하는 것이 가능하다. 본 연구에서는 단계별 방법 1에 설명되어있다) 바이러스 - 매개 역행 레이블링 방법을 이용하여 각각의 신경 세포를 선택적으로 라벨링 수백; 2) 개별 뉴런의 체계적 재구성 수백은 내 신경 세포의 포괄적 따라서 대표 샘플을 형성한다<html> 선택적 인구; 3) 독립 클러스터링 형태 메트릭에 기초하여 선택 뉴런 집단 내에 최적의 클러스터를 결정하기 위해 통계적으로 분석 평가. 이러한 분석 방법은 TRN 뉴런 기존 데이...

신경 해부학은 &quot;connectomics&quot;에서 신경 과학 (1) 최근 관심의 기초 중 하나가 신경 인구의 형태 학적 다양성과 특정 뉴런 (2) 사이의 연결을 이해하기위한 열정을 갱신했다입니다. 라벨링 방법 및 재구성 신경 세포는 크게 유전 및 바이러스 매개 회로 추적 등을 포함하여 혁신과 개선의 연결 인구 5의보다 포괄적 인 형태 설문 조사를 수 있도록, 3, 4에 접근한다. 개별 뉴런 라벨의 개선 이외에, 정량 데이터 분석 기술들은 그 데이터 형태 5, 6에 기초하여 별개의 개체군으로 뉴런의 독립적 인 편향 구분 가능 나왔다. 이러한 편견 기술은 더 traditiona의시 개선된다한 세기 넘게 분야에서 표준이되어왔다 L 질적 분류 방법. 이 연구의 목표는, 개요 단계별하는 것입니다, 선택적 인구 내에서 신경 세포의 바이러스 매개 라벨의 조합이하는 이러한 신경 세포의 포괄적 인 샘플 및 정량 데이터 분석의 대규모 복원은 독립적 인 클러스터링을 기반으로 통계 평가. 이러한 방법을 결합함으로써, 우리는 선택적 신경 인구 내에서 포괄적 인 샘플링과 형태 학적으로 독특한 신경 종류의 편견 분류를 용이하게하기 위해 수집 및 신경 해부학 데이터의 분석을 향한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이러한 방법의 예를 들어, 우리는 짧은 꼬리 원숭이의 시상 망상 핵 (TRN)의 단일 섹터 내에서 뉴런의 대규모 인구의 분석에 대해 설명합니다. 이 자료는 이전 연구 7에서 있습니다. 선택적 지느러미 latera에 돌출 TRN 뉴런을 라벨에 대한 방법EGFP 4, 8 인코딩 수정 광견병 바이러스의 수술 주입을 사용하여 시상 (dLGN)의 리터의 geniculate 핵이 설명되어 있습니다 (특정 자재 / 장비, 행 2의 표 참조). 이 변형 광견병 바이러스는 유전자 필수적인 코트 단백질을 코딩하는 바이러스 트랜스 - 시냅스 움직임을 제거 없다. 바이러스 주사 부위 엑손 단자 입사되면, 감염된 신경 5, 9, 10의 전체에 걸쳐 수상 arborization EGFP 발현을 구동하는 중요한 이점 전통적인 역행 트레이서처럼 작용한다. 따라서,이 G-삭제 광견병 바이러스는 선택적으로 감염 및 사출과 역행 전송 다음 모든 신경 인구 라벨을 사용할 수있다. 특정 신경 세포 집단의 포괄적 분석을 수행하기 위해, 샘플은 중요인구 내에서 뉴런의 광범위한 분포. 바이러스 - 매개 표지 기술은 완전한 세포를 생성하기 때문에, &quot;골지체 형상은&quot;바이러스 주사 부위 축삭 많은 뉴런 채우고, 그 뇌 구조의 전체 범위 내에서 신경 세포의 매우 큰 샘플을 재구성 할 수있다. 개질 광견병 바이러스 감염과 뉴런의 다수의 라벨에 있으므로 효과적이기 때문에 또한, 동물 당 수백 뉴런을 재구성 할 수있다. dLGN 투 TRN 뉴런의 광범위한 샘플을 생성하기 위해 TRN (11)의 영상 분야에 걸쳐 160 뉴런 샘플링 절차가 설명된다. 현미경, 카메라, 및 재구성 소프트웨어를 포함하는 신경 복원 시스템을 이용하여 각각의 신경 세포를 복원하는 과정을 설명한다. 또한 설명합니다 (TRN 내의이 경우) 뇌 구조 내의 개별 뉴런의 위치를 ​​결정하는 바이러스 주입 윗몸을 확인하는 방법이다체적 형상 복원을 사용합니다 (dLGN 내의 이러한 경우) 구조 내에서 전자 볼륨 및 위치. 각 신경 세포를 측정 형태 측정이 설명되어 있습니다에 형태 학적 데이터를 내보낼 독립적 인 클러스터를 수행하는 단계는 기반 분석. 클러스터링 방법에 제한이 있습니다 가능한 다른 클러스터링 알고리즘의 다양한도 있습니다. 따라서, 이러한 옵션과 더 일반적으로 사용되는 알고리즘의 몇 가지의 장점이 설명되어 있습니다. 클러스터 분석 클러스터의 고유성의 통계적 검증을 제공하지 않습니다. 따라서, 추가 단계가 최적의 클러스터뿐만 아니라 내부 및 클러스터에 걸쳐 형태 데이터 사이의 관계를 확인하기 위해 설명된다. 그 TRN 뉴런을 확인하기 위해 TRN 데이터 세트에 대한 클러스터를 평가하기위한 통계 방법이 설명되어 있습니다 (10) 독립적 인 형태 학적 지표에 따라 세 가지 고유 한 클러스터로 그룹화됩니다. 따라서, 선택적으로 표시하는 단계를 요약하여, 재구성, 특정 신경 세포 집단에서 형태 학적 자료를 분석, 우리는 인구 내에서 신경 세포 사이의 형태 학적 차이를 정량화하는 방법을 설명합니다. 짧은 꼬리 원숭이 원숭이 TRN의 시각적 부문 내에서 서로 다른 신경 세포 유형의 선행 연구 결과는 별도의 통계적인 평가 방법으로 확인된다. 함께, 우리는 이러한 기술은 신경 해부학 데이터 세트에 광범위하게 적용 할 수 뇌를 통해 신경 인구의 다양성의 정량적 분류를 확립 도움이되기를 바랍니다.

<table><tbody><tr><td>슬픔&델타; G-EGFP</td><td>E.M. 캘러웨이 연구소, 솔크 연구소</td><td></td><td>F. Osakada 박사 준비. Salk Institute Viral Core Recording 전극을 통해 사용할 수 있는 G-deleted 광견병</td></tr><tr><td>바이러스: 백금/이리듐 또는 텅스텐</td><td>FHC</td><td>UEPSGGSE1N2M</td><td>대체 주문 사양은 웹사이트(www.fh-co.com)를 참조하십시오</td></tr>. <tr><td>Nanoject II</td><td>Drummod Scientific</td><td>3-000-204, 110V</td><td>대안: picospritzer, Hamilton 주사기</td></tr><tr><td>냉동 마이크로톰</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5905-50TAB</td><td>3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드, 정제, 정제당 10mg 기질. 주의: 발암 물질 - 반드시 폐기하기 전에 표백해야 합니다.</td></tr><tr><td>Cytochrome C</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2037-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldich</td><td>C9322-5G</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Life Technologies/Thermo Fisher</td><td>#A-11122&nbsp;</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Biotinylated 염소 항-토끼</td><td>Vector Laboratories</td><td>#BA-1000</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Neurolucida System&nbsp;</td><td>뉴런 추적 및 분석을 위한</td> <td>MicroBrightField</td><td></td> 소프트웨어. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida</tr><tr><td>Neurolucida Explorer</td><td>MicroBrightField</td><td></td><td>데이터 내보내기 소프트웨어</td></tr><tr><td>Microfire Camera&nbsp;</td><td>Optronics</td><td></td><td>2 메가 픽셀 트루 컬러 현미경 카메라. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf</td></tr><tr><td>Nikon E800 현미경</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>생물학 연구 현미경. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks Inc.&nbsp;</td><td></td><td>매트릭스 기반 계산 수학 소프트웨어.</td></tr><tr><td>http://www.mathworks.com Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>스프레드시트 프로그램</td></tr></tbody></table>

형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

이 프로토콜은 독립적 바이어스 클러스터링의 사용과 결합 된 신경 세포의 대규모 복원이 선택적 신경 세포 집단 중에서 관찰 학적 특성의 광범위한 조사를 만들 분석 요약. 이러한 기술들의 조합은 신경 해부학 정보의 수집 및 분석을위한 새로운 방법을 구성한다. 함께, 이러한 기술은 대규모을 활성화하고 선택적 신경 인구 때문에보다 포괄적 인 샘플링 및 인구 내에서 형태 학적으로 독특한 신경 클래스를 설명하는 편견 양적 방법을 설정합니다. 이 프로토콜은 선택적으로 신경 세포에 라벨을 수정 광견병 바이러스의 사용을 설명합니다. 관심의 대상 뇌 구조로 정위 주입 다음 역행 추적 등의 광견병 바이러스의 역할을 G는-삭제 및 신경 세포에서 EGFP의 전달과 표현을위한 수단으로 역할을합니다. 뉴런의 많은 수는이를 사용하여 감염기술과 개별 뉴런의 &quot;골지 같은&quot;전체 채우기를 생산, 자신의 수상 돌기에 걸쳐 GFP를 표현한다. 따라서, 바이러스 매개 역행 추적 방법은 완전한 세포 칠을 생성함으로써 기존의 염료 계 역행 추적 기술을 개선시킨다. 연구중인 뇌 영역의 모든 영역에 걸쳐 개별 잘 격리 뉴런은 신경 세포의 대표적인 샘플을 획득하기 위해 재 선정된다. 이 프로토콜은 세포 기관을 재구성하고 여러 조직 섹션에 걸쳐 표시 신경 세포의 수지상 arborization 패턴을 완료하는 절차를 설명합니다. 뇌 구조 내의 각 뉴런의 위치를 ​​포함하여 형태 학적 데이터, 추가 분석을 위해 추출된다. 표준 프로그래밍 함수는 독립 클러스터 분석 학적 지표에 기초하여 클러스터 평가를 수행하는 데에 이용 하였다. 클러스터 분석 PERFO의 이러한 분석의 유틸리티, 통계적 평가를 확인하려면원숭이 원숭이의 시상 (TRN)의 시상 망상 핵에 재건 (160) 뉴런에 rmed가되었다. 원래 클러스터 분석하고 여기에 수행 통계적 평가는 모두 TRN 뉴런 세 소집단, 독특한 형태 학적 특성을 각각으로 분리되어 있음을 나타냅니다.

우리는 선택적 모집단 내의 뉴런의 대규모 복원이 dLGN (5)에 변형 광견병 바이러스의 가능한 다음 주입 이전임을 보여 주었다. 최근, 동일 조직은 TRN 시각적 섹터 (160)의 뉴런을 재구성하기 위해 이용 하였다 (브래그 등, 리뷰].도 2A-B) 상술 한 상세한 방법 론적 단계에 따라. TRN 연구에서 TRN 뉴런의 세 가지 고유의 클러스터는 독립적 10 형태 메트릭 클러스터 분석에 기초하여 확인되었다 : 세포체 구역, 세포체 진원도의 TRN 내의 TRN 등쪽 - 복부 위치의 중심 내측 측방 상대적인 위치 , 수지상 나무, 노드에 평균 수지상 거리, 제 3의 평균 길이 및 고차 수상 돌기, 1 일 주문 수상 돌기의 평균 각도, 총 수지상 arborization의 평균 위상 각과에의 각도 편차의 수탈 수지상 arborization. TRN 뉴런...

이 프로토콜은 수정 된 광견병 바이러스가 형광 마커를 표현, 독립, 편견 클러스터가 서로 다른 신경 세포의 서브 클래스 간의 형태 학적 통계의 종합적인 특성을 사용하는 것이 분석과 역 행성 감염 다음 레이블이 선택적 신경 인구의 대규모 복원에 대해 설명합니다.

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

본 프로토콜의 목적은 바이러스로 라벨링된 뉴런의 형태를 재구성하는 단계를 설명하고, 라벨링된 뉴런 집단에 대해 독립적이고 편향되지 않은 클러스터 분석을 수행하여 서로 다른 뉴런 하위 분류에 따른 형태학적 지표를 포괄적으로 특성화하는 것입니다. 본 연구에서는 선택적 뉴런 집단 내에서 형태학적으로 고유한 뉴런 유형의 보다 포괄적인 샘플링과 편향 없는 분류를 용이하게 하기 위해 신경해부학적 데이터를 수집하고 분석하는 새로운 접근 방식을 제시합니다. 이 기술의 주요 장점은 뉴런 형태의 대규모 분석이 가능하며, 서로 다른 뉴런 하위 분류를 분류하기 위해 편향되지 않은 방법을 활용한다는 점입니다.형태학적 재구성에서 가장 어려운 부분은 재구성할 잘 분리된 뉴런을 선택하고, 적절한 z-깊이를 할당하며, 인접한 조직 절편 간에 재구성을 이어가기 위해 수지상 돌기를 정렬하는 것입니다. EGFP를 발현하는 변형 광견병 바이러스가 정위 고정법으로 주입된 영장류의 50 micron 뇌 조직 절편이 염색된 슬라이드를 선택하여 재구성을 시작하십시오. 슬라이드를 현미경 슬라이드 홀더에 놓고 저배율 대물렌즈를 사용하여 관심 있는 단일 절편에 초점을 맞추십시오.카메라 셔터를 적절하게 배치하여 라이브 이미지에 카메라 영상이 보이는지 확인하십시오. 수지상 돌기 분기 구조의 명확한 재구성이 가능하도록 관심 있는 뇌 구조 내에서 적절히 격리된 표지된 뉴런을 선택하십시오. 10x 배율로 전환하고 해당 영역의 초점을 맞추십시오.세포체의 면적과 원형도를 정확하게 측정하기 위해, 세포체가 단일 절편 내에 완전히 포함된 뉴런을 우선적으로 선택하십시오. 염색이 잘 되고 잘 분리된 뉴런을 선택했다면, 소프트웨어의 새 절편(new section) 버튼을 클릭하여 세포체가 포함된 홈 섹션을 섹션 관리자에 추가하십시오. 재구성 시 포함할 절편 수를 입력하십시오.처음에는 2~3개의 절편을 삽입하는 것을 권장합니다. 절편 두께를 50 microns로 설정하십시오. 2x 대물렌즈를 선택한 다음, 상단 툴바의 contour 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 contour 유형을 선택하십시오.마우스를 사용하여 윤곽선을 따라 점을 클릭함으로써 대상 구조의 윤곽을 추적하십시오. 윤곽선 추적을 마친 후, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 메뉴에서 윤곽선 닫기(close contour)를 선택하여 윤곽선을 닫으십시오. 다음으로, 뷰 배율을 2배(two x)로 유지한 상태에서 왼쪽 도구 모음의 원하는 마커 기호를 클릭하십시오.그런 다음 대상 구조의 중심을 클릭하여 마커를 배치합니다. 윤곽선 설정이 완료되면 40x 또는 60x 대물렌즈를 선택하여 세포체의 외곽선을 추적합니다. 그런 다음 상단 도구 모음에서 뉴런 추적 버튼을 선택하고 드롭다운 메뉴에서 추적할 뉴런 구조(이 경우에는 세포체)를 선택하십시오.세포체의 가장 넓은 외곽을 따라 지점들을 클릭하여 세포체의 윤곽을 그리고, 필요에 따라 z-깊이를 조정하여 세포체에 초점을 맞추십시오. 그 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 세포체 윤곽 그리기를 마칩니다. 이어서 세포체 윤곽의 중심에 다른 스타일의 마커를 배치하되, 마커가 z-깊이 상으로 대략 중심에 위치하도록 하십시오.z축 값이 정확하게 측정될 수 있도록, 각 트레이싱을 시작하기 전에 홈 섹션뿐만 아니라 인접 섹션에서도 정확한 z-깊이를 설정하는 것이 중요합니다. 수지상 돌기(dendritic arbors)의 트레이싱을 시작하려면 상단 드롭다운 메뉴에서 dendrite를 선택하십시오.그런 다음 세포체에서 시작하여 각 수지상돌기를 추적합니다. 수지상돌기가 분지될 때, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 분지점(bifurcating node) 또는 삼분지점(trifurcating node)을 선택하여 해당 분지 지점에 노드를 배치합니다. 수지상돌기의 각도와 방향을 정확하게 포착할 수 있도록 추적 과정 전반에 걸쳐 z-깊이를 적절히 조절하십시오.이 섹션의 수상돌기 끝부분에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 ending을 선택하십시오. 홈 섹션의 모든 수상돌기 분지 추적이 완료되면, 인접한 섹션으로 이어질 가능성이 높은 수상돌기 말단을 식별하십시오. 그리고 현미경 이미지의 20배율에서 적절한 z-깊이로 이 부분들을 초점에 맞추십시오.현미경 이미지에 혈관이나 쉽게 식별 가능한 수지상 돌기 패턴 또는 다발과 같은 주변의 주요 표지물을 포함하십시오. 다음으로, 컴퓨터 화면에 디지털 카메라를 대고 실시간 이미지의 사진을 찍으십시오. 그 후 현미경 대물렌즈를 2x로 변경하고 슬라이드의 인접한 절편으로 이동하십시오.그런 다음 소프트웨어 뷰에서 이전에 추적한 섹션의 윤곽선을 새 섹션의 LGN 및 TRN 경계에 맞춥니다. 20배율로 돌아가 랜드마크를 사용하여 정렬합니다. 이후 이전 섹션에서 추적한 수지상 돌기 말단 사진을 참고하여, 먼저 화살표 도구로 재구성물을 선택한 다음 추적선을 이동시켜 수지상 돌기를 정렬합니다.그 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 'move'를 선택하여 트레이싱을 적절하게 이동시킵니다. 트레이싱을 회전시키려면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 'rotate'를 선택하여 트레이싱을 적절하게 회전시킵니다. 또는 상단 도구 드롭다운에서 'match' 도구를 선택하고 일치시킬 포인트 수를 선택하십시오.그런 다음 재구성된 이미지의 끝점과 라이브 이미지의 해당 연속 지점을 클릭하여 수지상 돌기 끝과 시작 지점을 일치시킵니다. 이전 섹션의 트레이싱이 새 섹션의 수지상 돌기와 정렬되면, 이전과 동일하게 섹션 관리자에 새 섹션을 추가하십시오. 또는, 이전에 생성된 인접 섹션을 단순히 선택하고 동일한 방식으로 z-깊이를 조정하십시오.현재 섹션을 클릭하여 섹션 관리자에서 해당 새 섹션이 선택되었는지 확인하십시오. 그런 다음 배율을 40x 또는 60x로 높인 후, 화살표를 사용하여 수지상 돌기를 선택하십시오. 이전 섹션의 수지상 돌기 끝부분에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 '끝에 추가'를 선택하십시오.연속 부분이 새로운 섹션에 있는지 묻는 프롬프트가 나타나면 '예'를 클릭하십시오. 그런 다음 마우스를 그리기 도구로 사용하여 수상돌기의 연속 부분을 추적하십시오.다음 절편과 정렬하기 위해 말단 부위의 이미지를 촬영합니다. 그 후, 해당 뉴런에 대해 최소 3개 이상의 절편이 추적될 때까지, 또는 수상돌기를 더 이상 추적하거나 찾을 수 없을 때까지 수상돌기 추적의 연속 부분을 추가합니다. 뉴런 재구성 시스템과 연동된 추출 프로그램을 사용하여 완료된 재구성 파일을 엽니다.편집 드롭다운 메뉴에서 모든 객체 선택을 선택하십시오. 상단 분석 툴바에서 분지 구조 분석을 선택한 다음, 각 탭을 클릭하여 각 탭에서 원하는 분석 옵션을 선택하십시오. 분석 창의 확인 버튼을 클릭하여 원하는 모든 데이터를 추출하고, 출력 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 후 분석을 위해 Excel로 내보내기를 선택하여 스프레드시트 형식으로 저장하십시오.이 사진은 한 동물의 등쪽 LGN을 통과하는 단일 관상면 절편을 보여줍니다. LGN 층을 시각화하기 위해 시토크롬 산화효소 염색이 사용되었습니다. 그리고 GFP 염색은 바이러스 주입 부위를 표시합니다.화살표는 역행성으로 표지된 밀집된 시상망상핵 뉴런 영역을 나타냅니다. 절편의 방향은 표시된 등측-복측-내측-외측 방위표에 따릅니다. 스케일 바는 왼쪽 하단 모서리에 표시되어 있습니다.이 이미지는 검은색 윤곽선으로 표시된 바이러스 주입이 포함된 모든 단면에서 LGN은 빨간색, TRN은 밤색의 윤곽선으로 나타낸 것입니다. 노란색 별은 주입 지점의 중심을 나타냅니다. 이 이미지는 윤곽선과 주입 지점의 3D 렌더링을 보여줍니다.이것은 갈색으로 표시된 단일 통합 TRN 윤곽 내의 클러스터 할당에 따라 색상으로 구분된 재구성된 TRN 뉴런 위치 지도입니다. 스케일 바는 500 microns를 나타냅니다. 이 이미지는 검은색의 TRN 통합 윤곽과 회색의 LGN을 보여주며, 5개의 재구성된 TRN 뉴런이 TRN 내의 내측-외측 위치에 따라 따뜻한 색에서 차가운 색으로 표시되어 있습니다.스케일 바는 500 microns를 나타냅니다. 이 사진들은 동일한 5개 TRN 뉴런의 상세 모습을 보여주며, 색상이 일치하는 스케일 바는 100 microns를 나타냅니다. 이 계층적 덴드로그램 트리는 10가지의 독립적인 형태학적 지표를 기반으로 재구성된 160개 TRN 뉴런 간의 연결 거리를 보여주며, 군집 분석의 전반적인 결과를 나타냅니다.TRN 뉴런의 세 가지 뚜렷한 클러스터가 파란색, 녹색, 빨간색으로 표시되어 있습니다. 이러한 뉴런 재구성 기술을 숙달하면 단일 뉴런을 1~2시간 만에 완전히 재구성할 수 있습니다. 뉴런을 재구성하는 동안 z-깊이를 지속적으로 모니터링하고 조정하는 것이 중요합니다.여기에 설명된 프로토콜은 기존의 더 편향된 신경해부학적 분석 방법보다 개선된 방식으로, 연구자가 대규모 형태학적 데이터를 기반으로 새로운 뉴런 하위 분류군을 탐색할 수 있게 합니다. 이 영상을 시청한 후에는 인접한 조직 절편을 통해 뉴런을 재구성하고, 추가 분석을 위한 형태학적 데이터를 추출하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리의 연결 형태를 분석하는 컴퓨터 프로그램을 개발했습니다. 두개의 기존 오픈 소스 분석 도구와 함께, 우리의 프로그램은 숄 분석을 수행하고 neurites, 지사 지점 및 neurite 팁의 수를 결정합니다. 분석은 neurite 형태의 지역 변화가 관찰 수 있도록 수행됩니다.

여러 스케일에서 디지털의 연결 형태론의 자동 숄 분석

여기, 우리는 열 및 레이어 초파리 수질 신경 세포의 수지상 라우팅을 분석하는 방법을 보여줍니다. 워크 플로우는 추적 기준 열 배열 수지상 아버를 등록하기위한 3 차원 공간에서 수지상 구조를 분석하기위한 이미지 품질과 연산 툴을 개선하기 위해 이중 - 뷰 영상 법을 포함한다.

열 및 레이어에 수지상 형태학 분석

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

여기, 우리는 그들의 3 차원 모양에 따라 건강 하 고 병 적인 세포의 식별을 허용 하는 워크플로 제공 합니다. 우리는 객관적인 조사 세포 인구의 클러스터링 하는 것을 제공할 것입니다 Self-Organizing 지도 훈련 3D 표면에 따라 2D 투영 윤곽선을 사용 하는 프로세스를 설명 합니다.

건강 하 고 병 적인 사이 구별 형태학에 기초를 둔 세포 이용한 푸리에 변환 및 자기 조직 지도

여기에 설명 된 프로토콜 설명 면역 형광 분석, biocytin 복구 hippocampal CA2 수는 세포내 electrophysiological 녹음 생체 외에서, 수 있도록 신경 다음의 높은-품질 개조 특성화 고 궁극적으로 훌륭한 신경 해부학 공부를 해야.

Biocytin 복구 및 채워진된 Hippocampal CA2 수의 3D 복원

설명된 파이프라인은 기가바이트보다 큰 전자 현미경 데이터 세트를 세분화하여 전체 세포 형태를 추출하도록 설계되었습니다. 셀을 3D로 재구성하면 개별 요구를 중심으로 설계된 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 3D로 직접 정성적 및 정량적 분석을 수행할 수 있으며 가상 현실을 사용하여 뷰 오클루전을 극복할 수도 있습니다.

신경교 세포와 신경 세포의 3D 재건 및 가상 현실 분석을위한 방법

제시된 것은 2D 형광 심상에서 신경 수지상 분기의 방향을 간단하고 직접 자동적으로 측정할 수 있는 계산 도구입니다.

수지상 가지 및 방향자동 식별

이 프로토콜은 조직 제거 방법인 ScaleSF를 사용하여 뇌 절편에서 신경 세포 영상의 상세한 방법을 제공한다. 이 프로토콜에는 뇌 조직 준비, 조직 정화, 클리어 슬라이스 처리 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미징이 포함됩니다.

중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법

이 프로토콜은 iDISCO+를 사용하여 온전한 마우스 뇌의 자기 공명 영상, 제거 및 면역 표지를 수행하는 방법을 설명한 다음, 라이트 시트 현미경을 사용한 이미징 및 NuMorph를 사용한 다운스트림 분석에 대한 자세한 설명을 설명합니다.

MRI, 조직 투명화 및 라이트 시트 현미경을 사용한 온전한 신생아 마우스 뇌의 전뇌 단일 세포 이미징 및 분석

Neurite outgrowth assay는 재생 신경 세포 과정에 대한 정량적 가치를 제공합니다. 이 반자동 소프트웨어의 장점은 마스크를 생성하여 세포체와 신경돌기를 별도로 분할하고 신경돌기 길이, 분지점 수, 세포체 클러스터 면적 및 세포 클러스터 수와 같은 다양한 파라미터를 측정한다는 것입니다.

Neurite Outgrowth 측정을 위한 새로운 반자동 소프트웨어의 표준화 

학습하세요 수정된 광견병 바이러스로 표지된 뉴런의 형태 재건 및 편견 없는 클러스터 분석 방법을. 이 기술은 대규모 신경 형태학 분석과 뉴런 하위 유형의 정확한 분류를 가능하게 합니다.

형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기

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