Name: 자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 배우세요 자궁 내 일렉트로포레이션을 이용하여 피질 신경세포의 구조적 연결성과 흥분성을 분석하는 방법을. 이 기술은 희소한 신경세포 집단을 표지하고 단일 세포 수준의 정량적 분석을 가능하게 합니다.

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우리는 그들의 우수한 기술 지원 및 편집을위한 LA 바이스에 R. 구티에레스와 A. 모랄레스에 감사하고 있습니다. CGB는 스페인 Ministerio 드 Ciencia 전자 Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011에 의해 투자된다. 이 작품은 M. Navarrete은에 BBVA 재단과 SAF2014-58598-JIN (MINECO)에서 연구비와 라몬 Areces 재단과 보조금 SAF2014-52119-R과 (MINECO에서) BFU2014-55738 - REDT에에서 보조금에 의해 투자되었다 M. 니에 토.

<ol><li>Dehorter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+fast-spiking+interneuron+properties+by+an+activity-dependent+transcriptional+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch.</a> Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).</li>
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<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).</li>
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<li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transportable%2C+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Dev Growth Differ. , (2015).</li>
<li>Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+I.+A+quantitative+study+of+Golgi-impregnated+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons.</a> J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).</li>
<li>Miller, M., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+II.+A+combined+Golgi-electron+microscope+study+of+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).</li>
<li>Cubelos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux-2+controls+the+proliferation+of+neuronal+intermediate+precursors+of+the+cortical+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone.</a> Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).</li>
<li>Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Control+of+a+Neuronal+Protein+Using+a+Genetically+Encoded+Unnatural+Amino+Acid+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrinsic+properties+and+excitability+of+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+during+a+critical+period+for+sensory+maps+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex.</a> J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
</ol>

저자는 관심의 충돌을 선언합니다.

이 프로토콜은 연결과 흥분을 분석하기 위해 C75BL / 6 마우스의 체성 감각 피질의 뉴런 레이블을하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 기존의 방법과 관련하여, 이러한 신경 세포 축삭 당 분기의 수, 정확한 지형 및 해부학 적 위치로 연결성 판별 측면을 가시화. 전극의 위치를 변경함으로써, 예에 cingulate 피질과 같은 다른 신경 세포 집단을 대상 (전극 뇌와 같은 각도를 유지하지만, 자극의 방향 변화) 또는 해마 5와 유사한 수행 할 수있다 원하는 전략에 따라 개별 뉴런 또는 광범위한 인구, 라벨 실험. 모든 집단이 동등 또는 동등 접근을 선택적으로 표시되어 그러나, 이것에 제한이있다. 예를 들면, 해마에서는, 선택적 CA1 영역의 후반 태생 뉴런을 타겟팅 할 수 있지만 EARLY 전기는 내부 및 외부 피라미드 세포의 이종 인구를 표시합니다. 대뇌 피질에서 신경 세포는 순차적으로 태어난, 그래서 IUE 동안 임신의 날은 영향을받는 대뇌 피질의 층을 결정한다. 이전 IUE 대상...

수지상 및 축삭 구조의 개발은 대뇌 피질에서 비롯한 신경계의 조절 회로의 중요한면이다. 또한 다양한 신경 세포 개체군의 선택 배선 동안 중요한 역할을한다. 최근 보고서 다수 연결 이외에 뉴런의 분자 다양성 소성 높은 특정 모드의 획득에 의해 반사되고, 그 보였다. 그러나, 개발 중에 별개 아형 신경의 흥분성 연결성 결정 메커니즘뿐만 아니라 배위 학위 여전히 잘못 2 1 이해된다. 생체 loss- 및 기능 획득하는 발현 유전자의 특정 레벨과 상기 회로의 개발에 대한 영향 사이의 관계에 대한 연구를 허용 분석한다. 자궁의 전기에서 (IUE)는 광범위하게 연구하는 데 사용하는 기술입니다특정 신경 인구에 대한 관심의 유전자의 기능과는 연결의 전체 패턴을 연구합니다. 그러나, 살아있는 생쥐의 대뇌 피질 층의 축삭과 수상 돌기의 형태 학적 특성을 결정하기 위해서는 띄엄 띄엄 뉴런 레이블을하는 것이 필수적이다. IUE와 결합 Cre 호텔 재조합 시스템은 식별 된 피질 박편의 개별 셀에 의해 방사 돌기를 해결하기 위해 충분히 낮은 밀도 뉴런 저밀도 인구를 표시하는데 사용될 수있다. 이 방법은 전기 천공 뇌 (도 1)의 적절한 수의 정량적 분석 후 데이터를 획득 피질 뉴런 당 충분한 수의 라벨. 이 원고는 연결의 미세 분석을위한 방법을 제시한다. 또한 별도의 실험에서, 분석과 유사한 전략을 제공, 녹색 형광 단백질 (GFP)에 전류 클램프 기록을 수행함으로써 신경 세포의 전기적 특성은 급성 대뇌 피질의 조각에서 세포 -electroporated. 이 프로tocols는 손실 함수의 게인이 IUE 동안 추가 플라스미드 도입 된 뉴런과 같은 다목적 및 WT 형질 전환 동물의 신경 세포의 흥분성 연결성 연구에 적용 할 수 있으며. 이 프로토콜은 배아 일 (E) 15.5에서 마우스의 전기를 설명하지만,이 기술은 E9.5 3 및 출생 후의 일 (P)이 4 사이의 나이에 수행 할 수 있습니다. 초기 단계에서 전기는 신경 세포와 시상의 전구체와 피질의 깊은 층, 이후 단계 전기 마크보다 표면 층 (예를 들어, E15.5 IUE 목표 층 II-III 뉴런)를 대상으로하지만. 요약하면, 단일 셀 형태 학적 분석과 함께 전기 생리학 IUE의 조합 신경계 뉴런의 엄청난 구조적 및 기능적 다양성의 기초가되는 분자 메카니즘을 해명하는 유용한 도구이다.

<table><tbody><tr><td>pCAG-Cre</td><td>Addgene</td><td>13775</td><td></td></tr><tr><td>pCALNL-GFP</td><td>Addgene</td><td>13770</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>15777</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>패스트 그린</td><td>Carl Roth</td><td>301.1</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree 플라스미드 맥시 키트</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>1615 ESP</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란(IsoFlo)</td><td>Abbott (Esteve)</td><td>1385 ESP</td><td></td></tr><tr><td>케타민(Imalgene)</td><td>Merial</td><td>2528-ESP</td><td></td></tr><tr><td>자일라진(Xilagesic)</td><td>Calier</td><td>0682-ESP</td><td></td></tr><tr><td>포비돈 요오</td>드 <td>메다</td><td>694109.6</td><td></td></tr><tr><td>눈 연고(Lipolac)</td><td>안젤리니</td><td>65.277</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td> <td>Gibco by Life Technologies</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마 -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들 # 3 - 12 cm</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드 # 10</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Adson 펜치 - 톱니 - 스트레이트 12 cm</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>경화 된 고급 가위-직선 11cm</td><td>미세 과학 도구</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>가위 Mezenbaum-Nelson 곡선 L = 14.5cm</td><td>Teleflex</td><td>PO143281</td><td></td></tr><tr><td>얇은 곡선 팁 - 스타일 7 Dumoxel</td><td>Dumont</td><td>0303-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 Forceps-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Mathieu 바늘 홀더-톱니 모양</td><td>미세 과학 도구</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Applier</td><td>Braintree scientific, Inc</td><td>ACS&nbsp; APL</td><td></td></tr><tr><td>9mm 자동 클립</td><td>MikRon Precision, Inc.</td><td></td><td></td>205016</tr><tr><td>봉합사 - Polysorb 6-0</td><td>Covidien</td><td>UL-101</td><td></td></tr><tr><td>전기 면도기&nbsp;</td><td>Panasonic</td><td>ER 240</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관(100mm, 1.0/0.58 외경/내경)</td><td>World Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>교정 미세모세관 피펫용 흡인기 튜브 어셈블리</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Gauze (Aposan)</td><td>Laboratorios Indas, S.A.U.</td><td>C.N. 482232.8</td><td></td></tr><tr><td>면봉 (스타 코트)</td><td>Albasa-Needle</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>25g (BD Microlance 3)</td> <td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마 -Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>시그마 -Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>OCT 화합물</td><td>사쿠라</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>GFP 태그 다클론 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11122</td><td></td></tr><tr><td>보조 항체, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>10270106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>전기포레이터 ECM 830&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>플래티넘 전극 650P 7 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>현미경&nbsp; 형광 이미징용 - MZ10F</td><td></td> <td>Leica-VIP</td><td></td></tr> <tr><td>3000 Isofluorane Vaporizer</td> Matrx-TCS-SP5 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 시스템</td><td>Leica-Axiovert</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>200 현미경</td> <td>Zeiss-Cryostat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- CM 1950</td><td></td> Leica-P-97 <td></td><td></td></tr><tr><td>Micropette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 분석 소프트웨어(p-Clamp Clampfit 10.3)</td><td>분자 소자</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>수집 소프트웨어(MultiClamp 700B 증폭기)</td><td>분자 소자</td><td>DD1440A</td><td></td></tr><tr><td>전동 마이크로 매니퓰레이터 + 회전 베이스&nbsp;</td><td>셔터 기기</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>에어 테이블</td><td>Newport</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>소형 연동 펌프</td><td>WPI</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

신경계의 연결은 별개 형태의 엄청난 범위로 구성된다. 이러한 신경 세포의 소집단 다른 기능, 자신의 고유 한 수지상 형태학, 축삭 연결의 특정 패턴과 선택적 발사 응답 중 특징으로한다. 개발하는 동안 차별화의 이러한 측면을 담당하는 분자 및 세포 메커니즘은 여전히 ​​저조한 이해된다. 여기, 우리는 라벨에 대한 결합 된 프로토콜을 설명하고 대뇌 피질의 신경 세포의 구조적 연결과 흥분을 특성화. 에서 자궁 전기 (IUE) 프로토콜의 수정은 뉴런의 스파 스 인구의 표시를 할 수 있습니다. 이것은, 차례로, 개별 돌기 신경 축색 돌기 층류 위치의 정확한 특성 및 형태 계측 학적 분석 축삭의 식별 및 추적 할 수있다. IUE 또한 흥분성의 변화를 조사하기 위하여 사용될 수있다야생형 (WT) 또는 전기 천공 두뇌의 급성 조각에서 전체 셀 녹음과 결합하여 유전자 변형 뉴런. 이 두 기술은 구조적 및 기능적 연결성의 결합에 대한 이해 및 개발 중에 신경 다이버 시티를 제어하는 ​​분자 메커니즘에 기여한다. 이러한 발달 과정은 축삭 배선, 신경 세포의 기능 다양성,인지 장애의 생물학에 중요한 의미를 가지고있다.

상세 및 개발을 통해 신경 세포의 형태 학적 변화를 특성화하기 위해, 띄엄 띄엄 뉴런 레이블을하는 것이 필수적이다. 이 효소를 통합 만 신경 GFP (그림 1A)를 표현할 수 있도록 Cre 호텔 - 재조합 효소 희석 시스템은 뉴런의 스파 스 인구에 대한 관심의 유전자의 발현을 허용한다. 이 전략을 사용하여 레이어 II-III는 대상과 E15.5에서 IUE에 의해 표시된다. CAG-DsRed2는 / μL 1 μg의에서 공동 일렉트로 대조군으로 살아있는 동물에서 긍정적 인 일렉트로 머리를 식별하는 것입니다. 중요한 것은, 항 GFP 항체로 염색 한 후, 상기 신호는 수지상 모폴로지 및 축색 돌기 (도 1D 및 E)의 명확한 시각화를 허용하기에 충분히 강하다. IUE 및 전기...

이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

이 자궁 내 전기천공법(in utero electroporation) 접근 방식의 전반적인 목표는 정상 상태 및 실험 조건 하에서 피질 뉴런의 구조적 연결성과 흥분성을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 뇌의 구조 및 기능적 연결성 분석과 인지 장애의 생물학적 기전을 규명하는 것과 같이 발달 신경생물학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소수의 뉴런 집단만을 선택적으로 표지할 수 있어 수지상 돌기를 시각화하고 개별 뉴런에 접근할 수 있게 하며, 이를 통해 더욱 효율적이고 정밀한 정량적 분석이 가능하다는 점입니다.주입 전, 단일 세포 표지 또는 표준 패치 클램프 연구를 위해 수술당 10 µL의 DNA 혼합액을 준비합니다. 그다지 배아를 손가락으로 조심스럽게 조작하여 종뇌(telencephalon)의 위치를 찾습니다. 다음으로, 준비된 붕규산 유리 모세관을 마우스 피펫에 장착합니다.혈관을 피해 바늘 끝을 자궁으로 통과시켜 외측 뇌실에 도달할 때까지 삽입합니다. 그 후, 커다란 파란색 점이 관찰될 때까지 Fast Green으로 염색된 DNA 용액 약 1 µL를 천천히 주입합니다. 이 과정에서 가장 중요한 단계는 DNA의 주입입니다.이 과정은 가능한 한 조심스럽게 수행해야 합니다. 이제, 7mm 백금 전극을 배아의 머리 측면에 배치하고 백금 전극을 통해 전압을 가합니다. 이 절차에서는 고정된 뇌를 4°C에서 30% sucrose-PBS 10mL에 1~2일 동안, 뇌가 가라앉을 때까지 동결 보호 처리합니다.그 다음 1cm³ 크기의 알루미늄 호일 큐브를 준비하고 큐브의 2/3 정도를 OCT로 채웁니다. 이후 뇌 조직을 큐브에 넣고 드라이아이스에서 동결시킵니다. 이어서 동결된 뇌 조직을 -80°C에서 보관합니다.크라이오스탯(cryostat)에서 뇌 조직을 절편화하려면, 시료 디스크 표면에 OCT를 한 방울 떨어뜨립니다. 조직 블록에서 알루미늄 호일을 벗겨낸 후, 액체 상태의 OCT 위에 블록을 원하는 방향으로 배치합니다. 조직 블록이 고정될 때까지 강하게 눌러줍니다.그 다음 시편 디스크를 크라이오스탯의 시편 헤드에 삽입하고 절편 제작을 위해 시편의 방향을 잡습니다. 이어서 50-100 µm 두께로 절편을 만들고, 미세 붓을 사용하여 부유하는 동결 절편을 PBS로 옮깁니다. 그 후 0.5% Triton X-100이 포함된 PBS 내의 5% fetal bovine serum으로 상온에서 1시간 동안 절편을 블로킹합니다.다음으로, 블로킹 용액에 1:500로 희석한 1차 항체를 처리하여 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 절편을 PBS로 3회 세척합니다. 블로킹 용액에 1:500로 희석한 2차 항체를 첨가하고, 절편을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.그 다음 섹션들을 PBS로 3회 세척합니다. 그 후 0.5% Triton X-100이 포함된 PBS 내에서 dapE로 10분 동안 대조 염색합니다. 섹션들을 PBS로 헹구고 마운팅 용액을 사용하여 마운팅합니다.뉴런을 재구성하려면, 뇌 절편의 이미지를 고배율 및 고해상도로 획득하십시오. 다음으로, 획득 소프트웨어에서 Tile Scan을 선택하여 모든 수지상 돌기와 축삭 돌기를 포함하는 관심 영역을 설정하십시오. 정보 손실을 방지하기 위해 Z축으로 충분한 수의 스택을 획득하십시오.그 후, 이미지를 열고 메뉴에서 분절 선(segmented line) 옵션을 선택합니다. 뉴런의 구조를 따라 선을 그립니다. 이어서 Analyze, Tools를 거쳐 ROI manager로 이동한 후, Add를 클릭하여 선을 저장합니다.분석 대상 뉴런의 모든 축삭 또는 수지상 돌기에 대해 이 과정을 반복하십시오. ROI Manager 메뉴에서 Measure를 눌러 길이를 측정합니다. 분석을 위해 측정값을 텍스트 파일이나 스프레드시트로 내보내십시오.GFP가 전기천공된 마우스에서 GFP가 발현된 뉴런의 기록을 수행하려면, 뇌를 냉각된 배양 접시에 놓으십시오. 작은 가위로 소뇌를 절단하십시오. 그런 다음 스패튤라로 뇌를 들어 올려 페이퍼 타월로 물기를 닦아내십시오.뇌의 복측 미측면을 Vibratome 홀더에 접착합니다. 홀더를 얼음처럼 차가운 ACSF가 채워진 Vibratome 위에 놓고, Vibratome 챔버에 카보젠(carbogen)이 지속적으로 공급되고 있는지 확인합니다. 그 후, 15분 이내에 300 micrometer 두께의 관상면 절편을 잘라 급성 절편을 얻습니다.다음으로, 카보젠(carbogen)을 버블링하며 ACSF 내에서 급성 절편을 25 °C로 최소 60분 동안 배양합니다. 60분 후, 파스퇴르 피펫이나 작은 브러시를 사용하여 절편을 기록 챔버로 옮깁니다. 하프로 절편을 고정하고 분당 2 mL의 속도로 ACSF를 관류합니다.GFP 양성 뉴런을 패치하기 위해, 10x 대물렌즈를 통해 현미경으로 관심 영역을 찾습니다. 그 다음, 60x 대물렌즈를 사용하여 GFP 양성 세포를 찾습니다. 이어서, 기록 전극을 세포 내 용액으로 채웁니다.그 다음, 유리 피펫을 피펫 홀더에 장착합니다. 이어서, 피펫 팁을 배스(bath)에 넣고 팁에 초점을 맞춥니다. 피펫이 배스에 들어가면, 배압 제어 시스템을 통해 양압을 가합니다.피펫 내의 배압을 유지하면서 시각적 안내에 따라 대상 세포에 접근합니다. 세포 표면에 작은 함몰이 나타나면 압력을 해제합니다. 이 시점에서 1 GΩ 이상의 저항을 가진 기밀 봉쇄(tight seal)가 형성될 수 있습니다.그렇지 않은 경우, 이를 용이하게 하기 위해 약한 음압을 가합니다. 씰(seal)이 형성되는 동안 유지 전압 클램프를 60 millivolts로 맞춥니다. 기가옴 씰(giga-ohm seal)이 형성되면, 흡입 펄스를 가하여 세포막을 파열시키고 홀셀 모드(whole cell mode)로 진입합니다.전세포 모드(whole cell mode)가 되면, 전압 고정(voltage clamp)에서 전류 고정(current clamp) 모드로 전환하고 기록을 시작합니다. 이 이미지들은 배아기 15.5일에 자궁 내 전기천공법을 통해 2/3층 뉴런으로 벡터를 전달한 모습을 보여주며, 관상 단면은 생후 16일에 준비되었습니다. CAG DsRed2 벡터가 대조군으로 공동 형질전환되었습니다.GFP는 cre가 함께 도입되어 CALNL GFP 벡터 내의 LoxP 부위의 재조합이 일어난 뉴런에서만 발현됩니다. 여기서는 드물게 표지된 또 다른 GFP 뉴런의 수지상 돌기 분지 모습을 고배율 공초점 이미지로 보여줍니다. 이는 GFP가 전기천공법으로 도입된 피라미드 뉴런으로, 명시야 및 녹색 형광 조건에서 관찰되었습니다.다음은 2/3층에 위치한 CAG-GFP 전기천공 대조군 뉴런의 전형적이고 규칙적인 스파이킹 반응입니다. 이 기술을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 자궁 내 전기천공은 30분, 패치 클램프 기록은 반나절 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 어미의 스트레스를 줄이고 새끼의 생존 확률을 높이기 위해 수술을 가능한 한 빠르게 진행하는 것이 중요함을 기억하십시오.이 절차 이후에, 특정 유전자의 발현과 그것이 대리체 발달에 미치는 영향 사이의 관계와 같은 추가적인 의문을 해결하기 위해 발현 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 개발 이후, 발달 신경과학 분야의 연구자들이 생쥐 뉴런의 연결성과 형태학을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 단일 세포 수준에서 뉴런의 구조와 연결성 및 형광 표지된 뉴런의 흥분성을 기술하기 위해 자궁 내 수술을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

in-utero-electroporation-approaches-to-study-excitability-neuronal

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는​​ 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

이 비디오는 전체 세포 패치 전류 클램프를 사용하여 형광 단백질을 발현하는 신경 세포의 흥분성을 연구하는 방법을 보여줍니다. 전류 클램프 모드에서는 신경 흥분성을 나타내는 활동 전위가 생성됩니다.

Whole-Cell Patch Clamp를 사용한 형광 뉴런의 흥분성 연구

이 프로토콜은 관련 개선 explant 절차를...

예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

이 절차는 자궁 내 전기천공법을 통해 발달 중인 마우스 전뇌의 인터뉴런을 표적으로 삼는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 피질의 표재층으로 향하는 중간뉴런 아형에서 선택적 유전자 발현을 달성하는 데 특히 효율적이었습니다.

두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

배우세요 자궁 내 일렉트로포레이션을 이용하여 피질 신경세포의 구조적 연결성과 흥분성을 분석하는 방법을. 이 기술은 희소한 신경세포 집단을 표지하고 단일 세포 수준의 정량적 분석을 가능하게 합니다.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

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