자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

자궁 전기천공법(utero electroporation approach)에서 이 접근법의 전반적인 목표는 정상 및 실험 조건에서 피질 뉴런의 구조적 연결성과 흥분성을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 뇌의 구조와 기능적 연결성 및 인지 장애의 생물학을 해부하는 것과 같은 발달 신경생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 희박한 뉴런 집단을 표시할 수 있고 수상돌기를 입히고 개별 뉴런에 접근할 수 있어 보다 효율적이고 정밀한 정량 분석이 가능하다는 것입니다.

주사 전에 단일 세포 라벨링 또는 표준 패치 클램프 연구를 위해 수술당 10마이크로리터의 DNA 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 손가락으로 배아를 부드럽게 조작하여 텔렌팔론을 찾습니다. 다음으로, 준비된 붕규산 모세관을 입 피펫에 놓습니다.

바늘 끝을 혈관을 피하고 자궁을 통해 외심실에 도달할 때까지 통과시킵니다. 그 후, 큰 파란색 반점이 관찰될 때까지 약 1마이크로리터의 패스트 그린 컬러 DNA 용액을 천천히 주입합니다. 이 절차에서 중요한 단계는 DNA를 주입하는 것입니다.

이것은 가능한 한 부드럽게 이루어져야 합니다. 이제 7mm 백금 전극을 배아의 머리에 측면으로 놓고 백금 전극을 통해 전압을 가합니다. 이 절차에서, 섭씨 4도의 PBS에서 30% 자당 10밀리리터에 있는 고정된 뇌를 가라앉을 때까지 1-2일 동안 동결 보호합니다.

그런 다음 1개의 세제곱 알루미늄 호일 큐브를 준비하고 큐브를 2/3 또는 OCT로 채웁니다. 그 후, 뇌를 큐브에 넣고 드라이아이스에 얼립니다. 그 후 얼어 붙은 뇌를 섭씨 80도에서 보관하십시오.

저온 유지 장치에서 뇌를 절편화하려면 표본 디스크 표면에 OCT 한 방울을 떨어뜨립니다. 조직학 블록에서 알루미늄 호일을 벗겨내고 액체 OCT 위에 원하는 방향으로 블록을 배치합니다. 조직학적 블록이 고정될 때까지 강한 압력을 가합니다.

그런 다음 표본 디스크를 저온 유지 장치의 표본 헤드에 삽입하고 절단을 위해 표본의 방향을 지정합니다. 그런 다음 50-100마이크로미터 두께의 절편을 자르고 가는 브러시를 사용하여 부동 극저온 절편을 PBS로 옮깁니다. 그 후, 0.5%Triton X-100을 함유한 PBS의 5% 소 태아 혈청으로 실온에서 1시간 동안 섹션을 차단합니다.

다음으로, 섭씨 4도에서 1:500 1차 항체를 차단 용액에 희석하여 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, PBS에서 섹션을 세 번 세척합니다. 차단 용액에 희석된 1:500 2차 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 절편을 배양합니다.

그런 다음 PBS에서 섹션을 세 번 세척합니다. 그 후, 0.5%Triton X-100을 함유한 PBS에서 10분 동안 dapE로 섹션을 대조염색합니다. PBS로 섹션을 헹구고 장착 매체로 장착합니다.

뉴런을 재구성하려면 고배율과 고해상도로 뇌 부분의 이미지를 획득합니다. 다음으로, 수집 소프트웨어에서 Tile Scan을 선택하여 모든 수상돌기 및 축삭돌기에 걸친 관심 영역을 커버합니다. 정보 손실을 방지하기 위해 Z축에서 충분한 수의 스택을 확보합니다.

그런 다음 이미지를 열고 메뉴에서 분할된 선 옵션을 선택합니다. 뉴런의 구조를 따라 선을 그립니다. 그런 다음 Analyze(분석), Tools(도구), ROI manager(ROI 관리자), Add(추가)로 이동하여 라인을 저장합니다.

분석된 뉴런의 모든 축삭돌기 또는 수상돌기에 대해 이 과정을 반복합니다. ROI Manager 메뉴에서 Measure를 눌러 길이를 가져옵니다. 분석을 위해 측정값을 텍스트 파일 또는 스프레드시트로 내보냅니다.

GFP 전기천공된 쥐에서 GFP로 발현된 뉴런을 기록하려면 뇌를 차가운 배양 접시에 넣습니다. 작은 가위로 소뇌를 잘라냅니다. 그런 다음 주걱으로 뇌를 집어 종이 타월로 닦아내십시오.

뇌의 복부 꼬리 평면을 Vibratome 홀더에 붙입니다. 얼음처럼 차가운 ACSF로 채워진 Vibratome에 홀더를 놓고 Vibratome 챔버가 지속적으로 발암되는지 확인합니다. 그런 다음 15분 이내에 300마이크로미터 관상 절편을 절단하여 급성 절편을 얻습니다.

다음으로, 급성 슬라이스를 섭씨 25도에서 최소 60분 동안 ACSF에서 배양하면서 발암물질로 거품을 냅니다. 60분 후, 파스퇴르 피펫이나 작은 브러시를 사용하여 슬라이스를 기록 챔버로 옮깁니다. 하프로 슬라이스를 누르고 분당 2밀리리터의 속도로 ACSF를 듬뿍 뿌립니다.

GFP 양성 뉴런을 패치하려면 현미경을 통해 10x에서 관심 영역을 찾습니다. 그런 다음 60x 대물렌즈를 사용하여 GFP 양성 세포를 찾습니다. 다음으로, 기록 전극을 세포 내 용액으로 채웁니다.

그런 다음 유리 피펫을 피펫 홀더에 놓습니다. 그런 다음 피펫 팁을 욕조에 넣고 팁에 초점을 맞춥니다. 피펫이 수조에 들어가면 배압 제어 시스템을 통해 양압을 가합니다.

시각적 안내에 따라 관심 세포에 접근하는 동시에 파이펫의 배압을 유지합니다. 세포 표면에 작은 보조개가 나타나면 압력을 해제하십시오. 이 시점에서, 1기가옴보다 큰 저항을 갖는 단단한 밀봉이 형성될 수 있다.

그렇지 않으면 가벼운 음압을 가하여 용이하게하십시오. 씰이 형성되는 동안 유지 전압 클램프를 60밀리볼트로 가져옵니다. 기가옴 밀봉이 형성되면 흡입 펄스를 가하여 세포막을 파열시키고 전체 세포 모드로 전환합니다.

전체 셀 모드가 되면 전압 클램프에서 전류 클램프 모드로 전환하고 녹음을 시작합니다. 이 이미지는 배아 15.5일째에 자궁 내 전기천공법에 의해 2/3 층 뉴런으로 벡터가 전달되는 것을 보여주며, 코로나 절편은 출생 후 16일째에 준비되었습니다. CAG DsRed2 벡터는 대조군으로 cotransfection되었습니다.

GFP는 cre를 통합한 뉴런에서만 발현되어 CALNL GFP 벡터에서 LoxP 부위의 재조합을 허용합니다. 다음은 드문드문 표지된 또 다른 GFP 뉴런의 수상돌기 아버의 고배율 공초점 이미지입니다. 이것은 밝은 필드와 녹색 형광 조건에서 관찰된 GFP로 전기천공된 피라미드 뉴런입니다.

다음은 2/3층에서 CAG-GFP 전기천공 제어 뉴런의 일반적이고 규칙적인 스파이크 반응입니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 자궁 내 electroporations를 위해 30 분 안에 끝날 수 있고, 제대로 실행되면 헝겊 조각 죔쇠 기록의 경우 반나절 안에 끝날 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 어미의 스트레스를 줄이고 새끼의 생존 가능성을 높이기 위해 가능한 한 빨리 수술을 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 특정 유전자의 발현과 대리모 발달에 미치는 영향 사이의 관계와 같은 추가 질문에 답하기 위해 발현과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 발달 신경 과학 분야의 연구자들이 생쥐의 뉴런 연결성과 형태를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단일 세포 수준에서 뉴런의 구조와 연결성, 그리고 형광 표지된 뉴런의 흥분성을 설명하기 위해 자궁 작동에서 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.