Name: 다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 배우세요 인간 다능성 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법과 심근 수복을 위한 세포 이식 기술을. 패치 매개 사이토카인 전달법으로 세포 정착률을 향상시키는 혁신적인 프로토콜을 확인하세요.

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이 작업은 미국 공중 보건 서비스 보조금 NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120 및 UO1 HL100407-project 4 (to JZ), 미국 심장 협회 과학자 개발 보조금 (16SDG30410018) 및 University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ)의 Research Voucher Award의 지원을 받았습니다.

모든 실험 절차는 버밍엄에서 알라바마 대학의 동물 가이드 라인에 따라 수행된다. 1. hiPSC-CM이에 hiPSCs 차별화 <ol><li> 코트 밤새 4 ℃에서 사전 냉각 된 성장 인자 - 감소 된 젤라틴 단백질 혼합물로 6 웰 플레이트의 웰. 사용하기 전에 젤라틴 단백질 혼합물을 기음. 5 % CO 2, 10 μM의 ROCK 저해제와 37 ° C mTeSR1 중간 보충에있는 세포 (물론 당 1 × 10 5 세포를) 미리 코팅 된 플레이트 상에 hiPSCs 종자, 문화. </li><li> 세포가 90 % 합류에 도달 할 때까지 매일 배지를 새로 고침; 다음, 5 % CO 2, 37 ° C 두 개 더 일 동안 매체 (0.5 mg을 젤라틴 단백질 6 웰 플레이트 당 혼합물, 잘 당 2 ㎖의 중간), 문화에 세포 성장 인자 감소 젤라틴 단백질 혼합물을 추가합니다. <ol><li> 매체를 교체하려면, 부드럽게 진공 통해 페트리 접시에서 매체를 빨아아웃 셀을 터치하고, 전송 피펫을 사용하여 새로운 매체를 추가합니다. </li></ol></li><li> 보충 된 RPMI1640 배지 배지로 대체하여 분화를 시작하지 않고 인슐린 젤라틴 단백질 혼합물 B27를 성장 인자 - 감소, 100 NG / ㎖ 티빈 a 및 문화 5 % CO 2, 24 시간 동안 37 ℃에서 세포. </li><li> ; RPMI1640 인슐린없이 B27로 보충 된 배지 10 NG / ㎖ 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP-4), 10 ng의 / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)와 매체를 대체 문화 5 % CO 2, 96 시간 동안 37 ℃에서 세포. </li><li> B27 보충 된 RPMI1640 배지로 배지를 교체하고, 5 % CO 2 및 37 ° C에서 배양 세포를 계속; 3 일마다 배지를 새로 고칩니다. </li><li> 분화를 시작 후 3 일 ~ 현미경으로 세포를 수축의 클러스터를 관찰한다. ~ 칠일 최초의 수축을 관찰 한 후 클러스터를 수집하고 행크스 균형 소금 솔루션에 씻어. <ol><li> 부드러운 진동 37 ºC에서 10 분 동안 100 U는 / ㎖ 콜라게나 제 IV 포함 행크스 버퍼를 배양하여 접시에 클러스터 된 세포를 떼어 놓다; 이어서, 5 분 동안 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 0.25 % 트립신을 추가한다. </li><li> RPMI / B27 배지에서 10 % 소 태아 혈청 효소 용액을 중화하고 RPMI / B27 배지에서 세포를 재현 탁. </li><li> 혈구에 의해 세포 수를 계산. 문화 비 심근 세포가 배양 용기의 표면에 부착 할 수 있도록 5 % CO 2, 적어도 3 시간 동안 37 ℃에서 10cm 접시에 세포. </li></ol></li><li> hiPSC-CMS에 포함 된 세포 현탁액을 수집하고, 단백질 혼합물을 젤라틴 코팅 된 표면을 배양함으로써 (10cm 접시 당 1 × 106 세포 주위) 세포를 유지한다. </li></ol> 2. hiPSC-되는 EC에 hiPSCs 차별화 <ol><li> 일을 배양하여 단일 세포로 hiPSC 인구 해리5 % CO 2, 5 분 동안 37 ° C에서 킬레이트 제와 엠. mTeSR1 신선한 배지를 함유하는 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포를 옮긴다. </li><li> 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀 다운. 10 μM의 ROCK 저해제로 보충 mTeSR1 매체에 세포를 재현 탁. 혈구와 셀 밀도를 결정합니다. </li><li> 24 웰 플레이트 잘 하나에 20 NIH 단위 / ml의 트롬빈 용액 250 μl를 추가합니다. </li><li> 12.5 ㎎ / ㎖ 피브리노겐 용액 250 ㎕를 1 × 10 6 hiPSCs를 추가합니다. 그리고 트롬빈로드 웰에 세포 함유 피브리노겐 용액 250 μl를 추가합니다. 혼합물 분 내에 hiPSC 함유 섬유소 발판을 형성하기 위해 응고 관찰한다. </li><li> 커버 유리 집게로 6 웰 플레이트에 고화 셀 - 함유 지지체를 전송하고, 인슐린없이 2 % B27 보충 2ml의 EBM2 매체 골격을 배양하여 분화를 개시, 티빈-A (50 NG / ㎖) BMP-4 24 시간 동안 (25 NG / ㎖), 5 % CO에서 <sUB&gt;이 37 ° C를. <ol><li> 부드럽게 세포를 건드리지 않고 진공을 통해 기존의 매체를 흡입하여 매체를 교체합니다. 인슐린없이 B27 보충 된 새로운 EBM2 매체, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF, 50 NG / ㎖) 에리트로 포이 에틴 (EPO 100 NG / ㎖) 및 변형 성장 인자 β1 (TGFβ1 10 NG / ㎖)과 문화 추가 5 %에서 비계 CO 2, 48 시간 동안 37 ° C. </li><li> 매체와 문화 5 % CO 2와 다른 48 시간 동안 37 ℃에서 공사장 공중 발판을 새로 고침; 다음에, 배지에 200 U의 콜라게나 제 IV (100 U / ㎖)을 첨가하여 지지체로부터 세포를 분리. </li><li> 이 출시 된 후 세포를 스핀 다운. B27, VEGF-A (50 NG / ㎖) 및 SB-431542 (10 μM)의 2 % 용액이 보충-MV EGM2 배지로 배지를 교체; 매 2 일 매체를 새로 고칩니다. </li><li> 100 U와 / ㎖ 콜라게나 제 IV를 세포를 떼어 놓다 약 10 일 후 (~ 분화가 시작된 후 하루 14 예), 시간을 분리유동 세포 계측법을 통한 분화 세포 집단에서 IPSC의 EC-EC는 특정 마커 단백질의 발현을 분석하여 (예를 들어, CD31, CD144) 3. </li><li> 설립 프로토콜 (3)을 통해 고립 hiPSC-되는 EC를 확장합니다. </li></ol></li></ol> 3. hiPSC-SMCs에 hiPSCs 차별화 <ol><li> 젤라틴 단백질 혼합물로 코팅 된 플레이트 상에 hiPSCs 종자, 문화 mTeSR1 배지에서 세포를 5 % CO 2, 37 ℃에서 하루 중 변화와 합류 할 때까지 (~ 2 일간). </li><li> 3 일간 RPMI1640 배지 및 2 % B27 플러스 인슐린에 CHIR99021 (5 μM) 및 BMP-4 (10 ng의 / ㎖) 세포를 배양하여 혈통 중배엽 세포로의 분화를 시작. </li><li> 주로 합성 표현형과 hiPSC-SMCs을 생성하려면 : <ol><li> 문화 VEGF-A (25 NG / ㎖), RPMI1640 내에서 섬유 아세포 성장 인자 β (FGFβ 5 NG / ㎖)을 세포<html> dium, 2 %의 B27 마이너스 인슐린 5 % CO 2에서 4 일 동안 37 ° C. </li><li> 문화 VEGF-A의 셀 (25 NG / ㎖) FGFβ 5 % CO 2 및 37 RPMI1640 배지 (5 NG / ㎖)에 2 % B27 플러스 인슐린 2 일 동안 C를 °. </li><li> 문화 혈소판 유래 성장 인자 β (PDGFβ 10 NG / ㎖), TGFβ, 5 % CO 2 및 37 RPMI1640 (3 NG / ㎖), 2 % B27 플러스 인슐린 세포 4 일 동안 C를 °. </li></ol></li><li> 주로 수축 표현형과 hiPSC-SMCs을 생성하려면 : <ol><li> 문화 4 RPMI1640에서 VEGF-A와 일 (25 NG / ㎖) 및 FGFβ (5 NG / ㎖) 및 2 % B27 마이너스 인슐린에 대한 세포. </li><li> RPMI1640 배양하고, 2 % B27 플러스 인슐린 PDGFβ (5 NG / mL) 및 TGFβ (2.5 NG / ㎖) 7 일 동안 세포. </li></ol></li><li> 6 ~ 일 대사 RPMI1640 배지를 함유하는 락트산 (4 mM)을 상기 세포를 배양하여 최종 hiPSC SMC-집단을 정제. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. IGF-포함하는 마이크로 스피어 만들기 <ol><li> 열 올리브 오일 수조에서 45 ° C까지. </li><li> 열 50 ° C로 10 % 젤라틴 용액 5 ㎖. </li><li> 올리브 오일, 볶음에 젤라틴을 추가하고 물을 욕조에 얼음을 추가하여 5 ° C에 다음 급속 냉각. </li><li> 스물 다섯 분 후, 마이크로 스피어의 형성을 유도하기 위해 올리브 오일에 냉장 (4 ℃로) 아세톤을 추가합니다. </li><li> 도 5에서의 온도를 유지 1 시간 동안 ° C; 다음 올리브 오일을 제거하기 위해 미리 냉각 아세톤으로 그들에게 5 번 세척, 미세을 수집하고, 4 ℃에서 자연 건조로 할 수 있습니다. </li><li> 가교 결합을 유도 밤새 4 ℃에서 70 % 에탄올 및 0.25 %의 글루 타르 알데히드의 용액에 미소 구를 재현 탁하고 100mM의 글리신과 혼합하여 중화. </li><li> H를 30 분 동안 5 μg의 IGF와 0.1 % 소 혈청 알부민을 함유하는 2 O 증류수 15 ㎕의 5 mg의 미세 구를 혼합하여 미립자로로드 IGF. </li></ol> 5. 세포를 손상의 사이트를 통해 패치를 작성 및 주입 <ol><li> 1 ml의 최소 필수 중간 (MEM)에 함께 hiPSC 파생 SMCs (100 만)의 CM (200 만), 및되는 EC (1000000)를 일시 중단합니다. </li><li> 1 ㎖의 피브리노겐 용액 (25 ㎎ / ㎖)에 5 ㎎ 미소 일시 중단. </li><li> 셀 - 함유 용액, 피브리노겐 / 미세 용액과 다른 주사기 및 트롬빈 용액 1 ㎖와 함께 제 주사기 한 주사기를 채우기 (80 NIH 단위 / ㎖, 2 ㎕의 400 mM의 CaCl2를 200 mM의 ε 아미노 카프로 보충 산). </li><li> 수술이 이전에 설명 된 바와 같이 관상 동맥을 내림차순 왼쪽 전방의 결찰을 통해 돼지 심장에서 심근 경색을 유도한다. 참고 : 간단한, 여성 요크셔 돼지에서 (~ 13kg이, 연령 45 일)을 Telazol / 크 실라 (4.4 ㎎ / ㎏)의 근육 내 주사로 진정되고, 이소 플루 란 (0.5 %)와 전신 마취하에 삽관. 4 번째 intercostal 개흉술을 수행하고 노출 관상 동맥을 내림차순 앞쪽에 남아 있습니다. 관상 동맥을 60 분간 결찰하여 가려 짐 후 봉합사를 제거한다. 직접 전기 세동은 심실 세동의 경우에서 수행된다. </li><li> 돼지 마음의 경색 영역의 심장 외막에 멸균 플라스틱 링 (~ 2.5 cm)을 배치하고 동시에 링에 미세 / 피브리노겐과 트롬빈 솔루션을 주입. </li><li> 혼합물 (~ 30 초)을 고화하도록 한 다음 세포를 심근 경색으로 응고 된 혼합물을 통해 세포 함유 주사기의 바늘을 삽입하고 삽입. 3-0 또는 2-0 Monocryl 봉합이 동물의 크기에 따라와 근육 층, 피하 조직, 그리고 가슴 벽을 닫습니다. 부 프레 노르 핀 0.01-0.02 밀리그램 / kg 근육 내 주사는 8 시간마다 수술 후 처음 3 일 동안 통증을 제어하는 ​​데 사용된다. </li><li> 심장 자기 공명를 사용하여 심장 기능을 평가수술 한 주일 수술 2, 3, 4 이후 사주 전 영상 (MRI). 최종 MRI 연구 후에, 동물을 희생하고 조직 학적 및 분자 분석을 2, 3, 4의 마음을 처리한다. </li></ol>

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hiPSC-CM이 향상된 수율 / 순도 의 CM으로 인간의 줄기 세포를 분화에 대한 기존의 프로토콜들은 종종 낮은 수율과 순도에 의해 제한된다 예를 들어, hESC의-CM이 단지 35-66% 느린 마이 오신 중쇄 또는 cTnT의 6 표현 퍼콜 분리 및 심장 몸 형성을 통해 획득했습니다. 분화 hiPSC-CM 인구의 순도는 대략의 프로모터에 결합되어 리포터 유전자의 발현을 위해 선택함으로써 증가 될 수있는 CM 특정 단백질 7, 8, 9, 그러나이 기술은 반드시 유전자 변형의 사용을 필요 특히 임상 연구에 대해 덜 바람직하다 세포. 여기에 제시된 프로토콜로, hiPSC-CM이 68 %가 cTnT를 표현하고, 순도는 이후 유전자 조작 또는 단일하지 않고 마이크로 해부 및 예비 ...

들이 환자의 면역계에 의해 거부되지 않은 셀의 잠재적으로 무한 범위의 수로 구분 될 수 있기 때문에 유도 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 재생 세포 치료에 가장 유망한 제제들이다. (SMCs을하지만, 자기 복제 및 분화 능력은 또한 종양 형성을 초래할 수 있으며, 결과적으로, hiPSCs 완전히 같은 심근 (CMS), 내피 세포 (EC에) 및 평활근 세포와 같은 특정 세포 유형으로 분화 될 필요 ), 투여 전. 세포 투여 간단하고 가장 일반적인 방법 중 하나는 직접 심근 내 주입이지만, 네이티브 심근 조직으로 이식 접목되는 세포의 수는 매우 낮다. 이 감소의 대부분은 허혈성 조직의 세포 독성 환경에 기인한다; 그러나, 생쥐 배아 줄기 세포 (는 ESC)가 있었을 때 손상되지 않은 마음의 심근에 직접 주입 O투여 된 세포의 상당한 비율이 그들이하는 동안 생성 된 높은 압력에 의해 바늘 트랙을 통해 압박했다 아마도 때문에 관리 사이트를 종료 제안 3-5 시간 1 일 동안 유지되었다 전달 된 5 백만 셀 할수 있답니다는 ~ 40 % 심근 수축. 여기, 우리는 hiPSC 유래 심근 세포 (hiPSC-CMS) 2, 내피 세포 (hiPSC-되는 EC) 3, 평활근 세포 (SMCs)을 4 생성 소설과 실질적으로 더 효율적인 방법을 제시한다. 특히,이 hiPSC-SMC 프로토콜은 주로 합성 또는 수축 SMC 표현형으로 세포를 연출하여 체세포 SMCs 5에서 관찰 형태 학적 및 기능적 특성의 넓은 범위를 모방 처음이다. 우리는 또한 사이토 카인 함유 피브린 (P)을 생성하여 주사 세포의 생착 속도를 향상 세포 전달 방법을 제공하는주사 부위를 통해 ATCH. 패치는 적어도 3 일에 걸쳐 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)를 해제함으로써, 심근 종료로부터 세포를 방지 바늘 트랙 및 세포 생존을 밀봉함으로써, 두 세포 유지를 향상시키기 위해 나타난다.

<table><tbody><tr><td>Protocol Section 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>Stem cell technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Growth-factor-reduced matrigel</td><td>Corning lifescience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stem cell technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement, free</td><td>Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>액티브빈 A</td><td>R& D</td><td>338-AC-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>232-FA-025</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 IV</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>NC0217889</td><td></td></tr><tr><td>행크스 밸런스 염 용액(덱스트로오스, KCl, KH<서브>2</서브>PO<서브>4</서브>, NaHCO<서브>3</서브>, NaCl, Na<서브>2</서브>HPO<서브>4</서브> 무수)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>14175079</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>피셔 사이언</td>티픽 <td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Corning Lifescience</td><td>356721</td><td></td></tr><tr><td>10cm 접시</td><td>Corning Lifescience</td><td>354732</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양기</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>프로토콜 섹션 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>피브리노겐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5g</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7009-1KU</td><td></td></tr><tr><td>EMB2 매체</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>ProSpec-Tany</td><td>CYT-241</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Life Technologies</td><td>PHC9431</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&#946;</td><td>Peprotech</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>EGM2-MV 매체</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB555445</td><td></td></tr><tr><td>CD144</td><td>BD Bioscience</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorff 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Section 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stem cell technologies</td><td>720542</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-&#946;</td><td>Prospec</td><td>CYT-501-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Section 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olive oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1514</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>IGF</td><td>R& D</td><td>291-G1-01M</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher Scientific</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>가열판</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10Q</td><td></td></tr><tr><td>프로토콜 섹션 5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>&#949;-아미노카프로산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A0420000</td><td></td></tr><tr><td>MEM 배지</td><td>Fisher Scientific</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482748</td><td></td></tr><tr><td>마취 인공호흡기</td><td>Datex-Ohmeda</td><td>47810</td><td></td></tr><tr><td>마취 인공호흡기</td><td>Ohio Medical</td><td>V5A</td><td></td></tr><tr><td>제세동기</td><td>Physiol Control</td><td>LIFEPAK 15</td><td></td></tr><tr><td>1.5 T MRI</td><td>General Electric</td><td>Signa Horizon LX</td><td></td></tr><tr><td>7 T MRI</td><td>Siemens</td><td>10018532</td><td></td></tr><tr><td>Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)</td><td>Berlex</td><td>50419-188-02</td><td></td></tr><tr><td>2-0 silk suture</td><td>Ethilon</td><td>685H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 silk suture</td><td>Ethilon</td><td>622H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 모노필라멘트 봉합사</td><td>Ethilon</td><td>627H</td><td></td></tr></tbody></table>

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)이 완전히 심근 (hiPSC-CMS), 내피 세포 (hiPSC-되는 EC), 및 평활근 세포 (SMCs)에 hiPSCs 차별화에 대한 관리 전에 특정 세포 유형,하지만 기존의 프로토콜로 분화해야합니다 자주 낮은 수율, 순도, 및 / 또는 가난한 표현형의 안정성에 의해 제한. 여기서는 신규 hiPSC-CM이, -ECs를 생성하기위한 프로토콜 및 -SMCs 실질적으로 종래의 방법보다 더 효율적이며, 물론 투여의 사이트를 통해 생성 된 사이토 카인 - 함유 패치 세포 주입을 조합하는 방법을 제시한다. 패치는 장기간 동안 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)를 해제함으로써, 심근에서 압착되는 세포 않도록 바늘 트랙 및 세포 생존을 밀봉함으로써, 주입 된 세포의 보존을 모두 개선한다. 심근 허혈 재관류 손상의 돼지 모델에서 생착 속도가 클 때 두 배보다 더이었다세포는 세포 및 패치 모두 시토 킨 - 함유 패치없이 셀 비교 패치 및 치료 투여 아니라 단독 세포, 심장 기능 및 경색 크기에서 상당한 개선 연관되었다.

차별화 된 hiPSC-CM이, -ECs 및 -SMCs의 특성 hiPSCs의 차동 용량 4, 2 (3)을 평가했다. 세포 계측법 최종 hiPSC-CM 인구의 순도가 90 % (그림 1A, 1B, 패널 B1)를 초과 할 수 있음을 시사 심장 트로포 닌 T (cTnT를) 식의 분석 흐름. 거의 모든 셀 느린 미오신 중쇄 (도 1b 패널 A1)을 표현 α-sarcomeric 액틴 (도 1b 패널 A2), 약 25 %의 미오신 경쇄의 2V 이성체 (MLC2v)을 표현하는 동안 <strong...

우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 - 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

이 비디오의 전반적인 목표는 인간 다능성 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 기술을 소개하고, 허혈 재관류 손상 후의 심근 재생 연구에 이러한 세포들을 활용하는 방법을 시연하는 것입니다. 이 방법은 심근 재생을 위해 인간 iPS 세포 유래 심장 세포로 심장 조직을 공학적으로 구현하는 것에 대한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차의 주요 장점은 과학자들이 정제된 심근세포, 평활근세포 및 내피세포를 수집하고, 이러한 전구 세포들을 이용해 심장 조직을 생성할 수 있다는 점입니다.Ling Gao는 UAB의 Zhang 박사 연구실의 박사후 연구원이며, Greg Walcott는 UAB 병원의 심장 전문의입니다. Trina는 UAB 병원의 MRI 전문가입니다. 다능성 줄기세포를 심근세포로 분화시키려면, 먼저 6-웰 플레이트의 웰을 4°C로 냉각된 성장 인자 감소 젤라틴 단백질 혼합물로 코팅하십시오.그 후, 플레이트를 4 °C에서 하룻밤 동안 냉장 보관하십시오. 다음 날, 젤라틴 형태의 단백질 혼합물을 흡입하여 제거하고, 웰당 1억 개의 줄기세포를 플레이트에 분주하십시오. 줄기세포를 인큐베이터 밖으로 15분 이상 꺼내두지 마십시오.또한, 항상 신선한 배지를 사용하십시오. 이 경우에는 10 $\mu\text{M}$의 ROCK inhibitor가 첨가된 mTeSR1 배지를 사용합니다. 그 다음, 37 °C, 5% $\text{CO}_2$ 조건에서 세포를 배양하고, 세포에 닿지 않게 주의하며 기존 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거한 후 전이 피펫을 사용하여 신선한 배지를 넣어줌으로써 매일 배지를 교체해 줍니다.세포가 90% 합류(confluent)될 때까지 배양합니다. 분화 과정 3일째부터 수축하는 세포 군집이 있는지 확인하기 시작합니다. 수축이 관찰되는 즉시(보통 1주일 정도 소요됨) 세포를 수집합니다.헤모사이토미터를 사용하여 수축 세포의 수를 측정한 후, 10 centimeter 플레이트에 밀리리터당 100만 개의 세포 농도로 배양합니다. 줄기세포로부터 혈관 내피세포뿐만 아니라 평활근 세포를 생성하는 것도 가능합니다. 그 과정은 서로 다르며, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.먼저, 돼지 심장에 심근경색을 외과적으로 유도합니다. 제4 늑간 흉강절개술을 간략히 시행하여 좌전하행 관상동맥을 노출시킵니다. 그 후, 결찰사를 사용하여 관상동맥을 60분 동안 폐쇄합니다.필요에 따라 심장 제동을 실시합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

정렬 심근 조직의 생성 임상 유용한 목적에 줄기 세포 생물학의 최근 발전을 조절하기위한 중요한 요구 사항입니다. 여기에 우리는 세포의 형태와 기능의 정확한 제어를위한 microcontact 인쇄 방법을 설명합니다. 심장 progenitors을 파생 배아 줄기 세포의 높은 정화 인구 사용하여, 우리는 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다.

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

고혈압이나 심근 경색 등의 심혈관 질환의 생쥐 모델에서 심근 내 세포 전달은 널리 재생 연구에서 서로 다른 종류의 세포 치료 가능성을 테스트하는 데 사용됩니다. 그러므로, 상세한 설명이 수술의 명확한 시각화가 작은 설치류의 혈관 세포 치료 분석의 한계와 이점을 정의하는 것을 도울 것이다.

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

이 프로토콜에서는 마우스 및 인간 배아 줄기 세포 모두에서 심장 전구 세포의 유도가 설명됩니다. 이 프로토콜의 주요 전략은 배아 줄기 세포주에 조작된 형광 리포터를 사용하여 유세포 분석으로 심장 전구 세포를 풍부하게 하는 것입니다.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

이 프로토콜 심장 조상 세포는 내 피 분화 기법을 설명합니다. 그것은 특히 혈 청 농도 셀 시드 밀도 미치는 내 피 분화 가능성에 초점을 맞추고.

낮은 혈 청 조건 하에서 심장 조상 세포에서 내 피 분화의 유도

여기, 우리 세포 이식 전에 줄기 세포에서 DNA 무결성의 평가의 분석 실험 설정에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

심장 세포 치료를 위한 줄기 세포 DNA 무결성을 평가

본 프로토콜은 인간 유도만능 줄기 세포에서 유래한 심혈관 세포를 포함하는 메쉬 모양의 엔지니어링 된 심장 조직을 생성하여 심장 질환에 대한 세포 이식 요법의 조사를 허용합니다.

생체 내 심근 수리를 위한 인간 iPS 세포에서 파생된 메쉬 모양의 조작된 심장 조직의 준비

여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

생쥐의 심근 경색 부위 주변의 초음파 유도 세포 전달은 안전하고 효과적이며 편리한 세포 이식 방법입니다.

심근 경색 마우스에서 초음파 유도 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 이식

배우세요 인간 다능성 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법과 심근 수복을 위한 세포 이식 기술을. 패치 매개 사이토카인 전달법으로 세포 정착률을 향상시키는 혁신적인 프로토콜을 확인하세요.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

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