단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

이 절차의 전반적인 목표는 단일 세포에서 메가염기 규모의 DNA 복제 수 변화를 식별하는 것입니다. 세포 집단에서 게놈 이질성을 분류하기 위해서는 단일 세포 해상도에서 게놈 변화를 식별해야 합니다. 전통적으로 이는 세포학적 접근법을 사용하여 달성되었지만, 이러한 방법은 민감도와 특이성이 제한적이었습니다.

단일 세포 염기서열분석은 이전 접근 방식보다 향상된 민감도와 특이도로 다양한 게놈 변화를 검출할 수 있지만, 이는 신중하게 실행된 경우에만 가능합니다. 여기에서는 단일 세포 염기서열분석을 사용하여 단일 세포에서 메가베이스 규모의 복제 수 변화를 안정적으로 감지하는 방법을 설명합니다. 마이크로 흡기를 조립하려면 흡인기 튜브 어셈블리에서 투명한 플라스틱 끝을 제거하고 좁은 끝을 내경이 3/16인치인 1피트 길이의 PVC 튜브의 한쪽 끝에 삽입하는 것으로 시작합니다.

0.2마이크로미터 주사기 필터의 배출구를 내경이 3/16인치인 1피트 길이의 PVC 튜브의 다른 쪽 끝에 삽입합니다. 그런 다음 0.2마이크로미터 주사기 필터의 입구를 내경이 5/16인치인 6인치 길이의 PVC 튜브의 한쪽 끝에 삽입합니다. 1 밀리리터 눈금에서 5 밀리리터 플라스틱 혈청 피펫을 부수고 부러진 끝을 5/16 인치 내경의 PVC 튜브의 열린 끝에 삽입합니다.

다음으로, 5밀리리터 플라스틱 혈청학 피펫의 배출구를 흡인기 튜브 어셈블리의 유연한 끝 부분에 삽입한 다음 멸균 플라스틱 튜브를 사용하여 보관을 위해 튜브 어셈블리의 빨간색 마우스피스를 덮습니다. 튜브 중앙을 화염 근처에 놓고 튜브의 양쪽 끝에 장력을 가하여 유리 모세관 튜브를 내경 10-30마이크로미터로 끌어냅니다. 뽑힌 튜브를 두 반으로 나누어 두 개의 잠재적인 흡인기 바늘을 만듭니다.

여러 튜브에 대해 이 단계를 반복하여 단일 세포를 채취하기에 적절한 내경을 가진 충분한 바늘이 준비되었는지 확인합니다. 인간 섬유아세포 세포주와 같은 부착 세포를 준비하려면 트립신화(trypsinization)를 통해 세포를 수확하고 세포를 적절한 배지가 들어 있는 원뿔형 튜브로 전달합니다. 10% 표백제를 사용하여 후드, 피펫 팁 상자 및 피펫 팁 표면에 분사하여 전체 게놈 증폭을 위한 후드를 설정합니다.

그런 다음 70% 에탄올로 세탁을 반복하기 전에 종이 타월을 사용하여 모두 닦으십시오. WGA(Whole Genome Amplification) 키트의 8마이크로리터의 물을 개별 웰에 96웰 PCR 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 96웰 조직 배양 플레이트의 뚜껑으로 96웰 PCR 플레이트를 덮고 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.

다음으로, 15 센티미터 페트리 접시에 10 밀리리터의 배지 또는 PBS에 1, 000 세포를 추가하고 세포가 접시에 부착하는 것을 방지하기 위해 접시를 얼음에 놓습니다. 그런 다음 얼음 위에 있는 동안 페트리 접시와 96웰 PCR 플레이트의 세포를 10X 대물렌즈가 있는 광학 현미경으로 옮깁니다. 끝이 부러지도록 바늘의 당겨진 끝을 단단한 표면에 부드럽게 두드려 흡입기 바늘의 입구를 늘립니다.

그런 다음 바늘의 넓은 끝을 마이크로 흡입기의 투명한 끝 부분에 삽입합니다. 다음으로, 세포가 들어있는 페트리 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 흡인기의 빨간색 마우스피스를 입에 삽입합니다.

그런 다음 하나를 사용하는 동안 하나는 흡인기 바늘을 움직여야 하고 다른 손은 페트리 접시를 움직여 염기서열 분석할 단일 세포를 식별해야 했습니다. 구강 흡입을 사용하여 약 1-2마이크로리터의 중간 또는 PBS와 함께 단일 세포를 흡인기 바늘로 끌어당깁니다. 96웰 PCR 플레이트의 단일 웰에 있는 8마이크로리터의 물로 세포를 옮깁니다.

단일 세포 염기서열분석 데이터의 품질과 유용성은 각 세포의 상태와 게놈에 따라 달라지므로 세포 준비 및 미세 흡인 중에 생존 가능한 세포와 비세포사멸 세포를 분리하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 각 세포를 흡인하고 PCR 플레이트의 웰로 옮긴 후 세포를 수용한 웰을 표시합니다. 원하는 수의 셀에 대해 이 작업을 반복합니다.

그 동안 Whole Genome Amplification Kit에서 10X Single Cell Lysis Fragmentation Buffer를 해동합니다. 전체 게놈 증폭 중 오염을 방지하려면 조직 배양 후드 내부에 모든 시약을 추가합니다. 필터가 있는 피펫 팁을 사용하고 웰 사이의 피펫 팁을 교체하십시오.

최대 32개의 세포로 구성된 각 세트에 대해 32마이크로리터의 10X 단세포 용해 및 단편화 완충액과 2마이크로리터의 Proteinase K 용액을 마이크로 원심분리기 튜브에 결합한 다음 튜브를 와류로 혼합하여 내용물을 혼합합니다. 각 웰에 1마이크로리터의 용액을 추가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 접시를 덮고 플라스틱 필름을 사용하여 모든 우물을 밀봉합니다.

그런 다음 미니 플레이트 스피너에서 플레이트를 잠시 원심분리합니다. 다음으로, 다음 프로그램을 사용하여 thermocycler를 통해 플레이트를 실행합니다. 그런 다음 얼음으로 접시를 식히고 잠시 원심분리합니다.

Whole Genome Amplification Kit에서 작업 라이브러리 준비 완충액을 준비하려면 각 세포에 대해 2마이크로리터의 1X Single Cell Library Preparation Buffer와 1마이크로리터의 Library Stabilization Solution을 결합합니다. 적절한 세포 용해와 완전한 게놈 단편화는 전체 게놈 증폭 중 편향을 최소화하고 고품질 염기서열분석 라이브러리의 준비를 보장하기 위해 매우 중요합니다. 따라서 이러한 단계를 작성된 대로 정확하게 수행해야 합니다.

접시에서 플라스틱 필름을 제거하고 각 웰에 3마이크로리터의 용액을 추가합니다. 우물의 내용물을 위아래로 피펫팅하여 혼합한 다음 플라스틱 필름을 교체하십시오. 플레이트를 잠시 회전시킨 후 섭씨 95도에서 2분 동안 세포를 배양한 다음 얼음으로 플레이트를 식힌 다음 플레이트를 다시 잠시 원심분리합니다.

이제 플라스틱 필름을 제거하고 각 웰에 1마이크로리터의 라이브러리 준비 효소를 추가하고 웰의 내용물을 위아래로 피펫팅하여 혼합한 다음 플라스틱 필름을 교체하십시오. 플레이트를 잠시 회전시킨 후 열순환기에 넣고 다음 프로그램을 실행합니다. 플레이트를 냉각하고 잠시 회전시킨 후 각 세포에 대해 48.5마이크로리터의 물, 7.5마이크로리터의 10X 증폭 마스터 믹스 및 5마이크로리터의 WGA DNA 중합효소를 결합하여 전체 게놈 증폭 키트에서 작동하는 증폭 혼합물을 준비합니다.

작업 믹스를 얼음 위에 보관하십시오. 플레이트에서 플라스틱 필름을 제거합니다. 61마이크로리터의 작동 증폭 혼합물을 각 웰에 추가하고 각 웰의 내용물을 위아래로 피펫팅하여 혼합한 다음 플라스틱 필름을 교체합니다.

다음과 같이 플레이트와 열주기를 간단히 원심분리합니다. 샘플을 염기서열화하고 텍스트 프로토콜에 따라 데이터 분석을 수행합니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이 전체 게놈 증폭이 성공적이면 샘플이 아가로스 겔에 도말로 나타납니다.

번짐이 희미하거나 존재하지 않는 것은 증폭 반응이 실패했음을 나타내며 샘플의 염기서열을 분석해서는 안 됩니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 단편 크기의 분석은 단편 분석기에서 모세관 전기영동을 사용하여 수행되었습니다. 성공적으로 준비된 라이브러리는 150에서 900 염기쌍까지 단편 크기가 다소 균일하게 분포되어 있습니다.

라이브러리 준비에 실패하면 프래그먼트 크기 분포가 왜곡되며 이러한 라이브러리는 염기서열을 분석해서는 안 됩니다. 숨겨진 마르코프 모델과 순환 이진 분할을 사용하여 각 세포의 게놈을 추정 복제 수의 세그먼트로 구문 분석했습니다. 이 표는 단일 세포에서 중첩된 결과를 보여주며 염색체 10이 67 메가베이스에서 130 메가베이스로 증가하고, 염색체 19가 0 메가베이스에서 20 메가베이스로 증가함을 보여줍니다.

단일 세포의 분리 및 전체 게놈 증폭은 하루에 수행할 수 있으며 수행해야 합니다. 그런 다음 염기서열분석 라이브러리의 준비, 전체 게놈 염기서열분석 및 데이터 분석을 유연한 일정에 따라 수행할 수 있습니다. 세포 분리 및 전체 게놈 증폭이 적절하게 수행되고 설명된 대로 데이터 분석이 엄격하게 수행되면 5메가염기를 초과하는 복제 수 변형을 높은 민감도와 특이도로 검출할 수 있습니다.

당사의 프로토콜은 복제 수 변형 감지를 위한 단일 세포 염기서열분석의 사용을 구체적으로 설명하지만, 단일 세포 분리 및 라이브러리 준비와 같은 이 프로토콜의 측면을 적용하여 다른 게놈 변화를 감지하는 데 적용할 수 있습니다.