Name: 효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 배우세요 효모 두 하이브리드 스크리닝을 사용하여 사과(Malus domestica)의 세균 이펙터와 숙주 단백질 상호작용을 식별하는 방법입니다. 이 기술은 병원성 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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우리는 원고를 교정에 대한 기술 지원을위한 Dualsystems 생명 공학 AG와 줄리아 스트로 블에서 Laimburg 연구 센터와 Mirelle 보르헤스 디아스 Schnetzer에서 크리스틴 Kerschbamer, 토마스 Letschka, 사빈 Oettl, 마고 Raffeiner 및 플로리안 Senoner 감사합니다. 이 작품은 APPL2.0 프로젝트의 일환으로 수행되었다 부분적으로 자노 / 볼 차노, 이탈리아의 자치 지방과 남부 티롤 애플 컨소시엄에 의해 투자되었다.

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

Y2H 화면에서 전위 이펙터 단백질은 다른 가상 단백질 상호 작용한다 (단계 7)로 발현 공동. 각각의 성장 효모 클론 미끼 있지만 (잠재적으로) 다른 인터랙가 포함되어 있습니다. 상호 작용하는 단백질 먹이 플라스미드에 클로닝 된 cDNA 라이브러리로 인코딩됩니다. 미끼와 먹이은 효모 전사 인자의 일부에 대한 각각의 공동 cistronically 코드를 플라스미드. 미끼 (이펙터) 및 먹이 플라스미드 부호화 인터랙 사이의 물리적 상호 작용의 경우에는, 두 개의 전사 인자 부품합니다 (DNA 결합 도메인 및 활성 영역)이 결합되고, 리포터 유전자의 발현이 유도된다. 효모는 histidine- 및 아데닌 고갈 SD 선택 플레이트에 성장 할 수있다. 먹이 cDNA 라이브러리의 종류가 선별 이펙터에 의존하고 따라서 선택되어야한다. 먹이 미끼 벡터뿐만 아니라 효모 균주는 호환되어야한다. 이 화면에서, LEXA DNA는 도메인과 GAL4 활성화 domai 바인딩N 호환 효모 전사 인자 유닛으로 사용 하였다. cDNA의 라이브러리를 개별적으로 지정 수득 상업적 제조하거나 구성 될 수있다. cDNA에 먹이 라이브러리의 제조는이 프로토콜의 일부가 아니다. 이 프로토콜에서, 아 X의 domestica에 잎의 RNA에서 자체 제작, 표준화 된 cDNA 라이브러리를 사용하고 pGAD-HA (41)에 클로닝. 효모 균주를 발현 이펙터 (미끼)는 먹이 라이브러리로 형질 전환하고, 클론 histidine- 및 아데닌 고갈 SD 선택 플레이트에 선정되었다. 효모 식민지에서 플라스미드 DNA를 추출, 박테리아에 대한 열 기반 DNA 플라스미드 미니 키트는 효모 용해 (8 단계)를 개선하기 위해 유리 구슬을 사용하여 기계 중단 단계와 조합하는 것이 좋습니다. 이 플라스미드 정제, 미끼와 먹이 벡터는 상대적으로 낮은 농도에서 동시에 정제 할 것입니다. 그러나, 플라스미드 DNA의 양은 시퀀싱 재치 통해 상호 작용 파트너를 식별하기에 충분심 전 플라스미드 전파 (단계 8.4). 대안으로, 단계 8.4 정제 DNA 유능한 대장균에 형질 전환 될 수 있고 (예, pGAD-HA의 경우에는를 암피실린) 먹이 벡터 매개 항생제 내성으로 선택한. 선택된 E. 콜로니 만 pGAD-HA 라이브러리 플라스미드를 운반 대장균 및 고 수율 플라스미드 정제는 이들 클론에 수행 될 수있다. pLexA-N과 pGAD-HA 구조의 성공적인 변환 NMY51의 트립토판과 류신 영양 요 구성을 보완합니다. 조작자 및 단백질 (pGAD-HA에 부호화) 사이의 상호 작용은 NMY51 균주의 리포터 시스템의 활성화에 이르게. 자동 기동의 경우 NMY51 인해 NMY51 리포터 시스템의 원하지 않는 활성을 pGAD-HA는 TRP-의 Leu-그의 아데을 결여 선택적 플레이트상에서 성장 빈 라이브러리 벡터와 함께 pLexA-N을 발현 이펙터로 형질 40. 자기 활성화는 w 될 수 있습니다eak과의 부재하에 일어날 수 TRP-의 Leu-그의 또는 활성화가 강하고 TRP-의 Leu-그의 아데 플레이트 (41) 상에 성장에 의해 특징 지어 질 수있다. 자기 활성화는 실제 Y2H 화면에서 위양성 클론의 엄청난 배경을 일으킬 수 있습니다. 이 문제를 방지하려면 미끼와 자기 활성화 시험하는 이펙터 발현 벡터 공동 형질 전환 된 빈 라이브러리 벡터로하고, 실시해야합니다. 이 실험 설정에서, 리포터 유전자 발현은 유도해서는 안된다. 자동 활성화 (즉, 선택적 접시에 성장) 시험에서 볼 경우, 배지 3- 아미노 -1,2,4- 트리아 졸 (45) (3-AT)의 다른 농도로 보충 될 수있다. 3-AT는 imidazoleglycerol 인산 탈수 효소 (HIS3), 히스티딘 생합성 46 중 중요한 효소의 억제제이다. 3-AT와 보충, Y2H 화면 47시 자기 활성화의 약한 영향을 줄일 수 있습니다48. 3-AT의 다른 농도를 테스트해야합니다. 이 프로토콜에서, 1-40 mM의 AT-3을 사용 하였다. 자동 활성화의 억제에 이르게 최저 농도는 이후 Y2H 화면에서 사용되어야한다. 공동 변환의 SD-TRP-레우 플레이트 클론의 충분한 개수를 포함 할 경우, 자동 활성화 분석의 선택적 플레이트는 평가 될 수있다. 표시의 ≥로 90 mm (직경) 페트리 접시 당 500 콜로니 충분하다. 정확한 형질 감염 효율을 확인하기 위해서는 공동 형질 전환 효모의 희석액을 제조하고, SD-TRP-레우 플레이트 상을 확산 권장한다. 자기 활성화를 감소시키기 위해, 이펙터는 pLexA-C 단백질의 C 말단에 LEXA 태그 융합 미끼 발현 벡터에 클로닝 할 수있다. 렉스-A 태그의 방향은 자기 활성화 (24)를 감쇠 할 수 있습니다. 그러나, 모든 경우에 감소 또는 자체 활성을 폐지 할 수 없다. 형성빨간색 또는 붉은 식민지가 약하거나 거짓 긍정적 인 상호 작용을 나타냅니다. 그것은, 단백질 - 단백질 상호 작용에 관해서 NMY51의 ade2 리포터 유전자는 활성화되는 선회 블록이 효모 균주 40에서 빨간색 색소의 축적. 강한 인터랙 운반 콜로니 백색 동안 상호 작용이없는 경우, NMY51는 적색이다. 선택 접시에 식민지 색상의 관찰 따라서 각각의 식민지가 true- 또는 위양성 인터랙 경우 판단하는 또 다른 중요한 힌트를 제공합니다. 이는 적응 또는 미끼의 특성 및 상호 작용 특성에 대해 특정 시험 설정을 변경할 필요가 결국. 지금까지 개선 및 공통 Y2H 유도체 다수의 기술은 다른 호스트 시스템들에서 다소 어려운 단백질 상호 작용 분석을 허용하기 위해 설립되었다. Stynen 등의 알에 의한 검토. 49 해결하는차은 Y2H, 그것의 개선과 적응의 다양한 측면을 설명하고, 따라서 적절한 상호 작용 분석을 선택하는 방법에 대한 유용한 정보를 제공합니다. Y2H 화면과 파생 기술은 널리 이진 단백질 상호 작용의 확인이 필요한 곳마다 서로 다른 연구 분야에 이용되고있다. 중요한 컨트롤 등 미끼 자기 활성 테스트 및 상기 식별 된 상호 작용 단백질의 일대일 변환 재로서 수행하더라도 Y2H 거짓 결과가 26, 50, 51를 제조하기 쉽다. 모델로 효모 모든 상호 작용 연구에 적합하지 않다. 효모는 반드시 모든 단백질의 24에 해당하는 번역 후 변형 및 폴딩을 지원하는 셀룰러 환경을 구성하지 않습니다. 또한, Y2H 설정에서, 단백질은 과잉 발현되고, 발현 제어 아니다자연 프로모터에 의해 주도했다. Y2H 반드시 자연 세포 내 목적지되지 않습니다 핵에 단백질 상호 작용 파트너를 강제로. 상호 작용의 기본 세포 상황에 따라서 효모에 의해 반영되지 않을 수 있으며-위음성 또는 위양성 결과가 발생할 수 있습니다. 대부분의 Y2H는 선택적 원칙으로 효모의 영양 요구의 보완을 기반으로합니다. 이것은 영양 선택은 고감도 특징으로하지만, 다른 비교하여 감소 된 선택성 비용 (예를 들면, 발색 기자) (49)를 분석한다. 환원성 자동 활성화 (상기 참조) 또는 다른 제약이 특정 이펙터 발생할 경우 Y2H 적절한 분석 25 아니다. 표 1 및도 1에서, 자기 활성화 시험의 예상되는 결과를 나타내었다. 실제 상호 작용 (예, 위음성)의 부재는 단백질 독성, 잘못된 번역 단백질에 의해 발생할 수 있습니다상호 작용 (24)에 필요한 처리, 상호 작용의 입체 장애, 먹이 도서관에서 소수의 상호 작용 파트너, 미끼의 막 지역화 또는 누락 된 구성 요소. 이것은 새로이에게 추천 pGAD-HA로 서브 클로닝, cDNA를으로부터 식별 된 상호 작용하는 단백질의 전장 유전자를 증폭하고, 상기 생성 pGAD-HA 내로 구성 변환하여 일대일 상호 작용 분석을 수행하는 미끼 발현 NMY51 변형. 먹이 라이브러리에 존재하는 관찰 인터랙은 더 큰 단백질의 단편 될 수 있기 때문에이 작업이 필요합니다. 그러나, 각각의 전체 길이 유전자에 대한 정보는 상당한 게놈과 transcriptomic 시퀀스 데이터를 사용할 수있는 경우에만 접근 할 수있다. 여기에 설명 된 자기 - 활성화 분석의 변형 프로토콜은 일대일 분석에 적용 할 수 있고, 미끼와 인터랙 간의 상호 작용을 재현성이어야한다. 아 X의 domestica에의 TCP의 전사 인자와의 상호 작용이 담배 속 benthamiana에 이분자 형광 보완 (BiFC)와 함께 란타에서 확인되었다 (28) (이 프로토콜의 일부)를 원형질체. 이펙터 단백질 ATP_00189는 식물 병원균 P.의 말리에서 파생되었다. 란타 BiFC에 따라서 아 X의 domestica에 전사 인자 ATP_00189 상호 작용을 확인하기 위해 선택되었다 이전에 Y2H (28)에서 확인. BiFC은 리포터 시스템을 &lt;활성화하기 위해 핵으로 작용 단백질의 세포 내 전위를 필요로하지 않는 단백질 - 단백질 상호 작용 분석법 인SUP 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 52. 또한,에서의 란타의 발현 및 수정 기계 모방의 공장 호스트의 식물 세균 이펙터 사이의 자연스러운 상호 작용의 환경을 제공합니다. 그러나 BiFC를 사용하여 글로벌 화면이 가능하지 않습니다. 신중하게 해결해야 프로토콜의 여러 단계가 있습니다. 이자 (단계 4) 유전자를 증폭 할 때, 프라이머가 식물 DNA에 결합하는 것을 배제하는 것이 중요하다. 따라서, 비 - 감염된 식물 DNA는 대조군으로 포함되어야한다. 관심의 유전자의 서열은 삽입 방향의 복제에 사용되는 효소 EcoRI 및 SalI로 제한 효소 부위를 포함 할 수 없습니다. 순서가 이러한 사이트에 포함되어 있으면 복제에 대해 서로 다른 제한 효소를 선택해야합니다. 효모 변환은이 프로토콜 동안 중앙 방법입니다. 형질 전환 효율은 효모 세포의 능력 그들의 생존, 성장 상태 및 형질 감염 reag의 품질에 따라천만에 53, 54. 제안 된 프로토콜를 들어, 높은 변환을 수행 할 때 (4 ° C로 유지) 이주보다 오래되지 신선한 판에서 효모를 사용하는 것이 좋습니다. 선택적 액체 문화가 된 한천 플레이트에서 콜로니를 접종 할 때 종종 형질 전환 효모의 성장이 지연된다. 이 플레이트로부터 직접 효모를 사용하여 실제 실험을위한 접종 액으로서 선발 배양을 사용하지 않는 것 또한 유용하다. 낮은 효율성 특정 먹이 단백질 (잠재적 인 인터랙)의 과소 대표 될 수 있습니다 미끼 발현 효모에 먹이를 형질 따라서 전체 화면을 왜곡 할 수 있습니다 때. 이 프로토콜에서, Y2H에서 ~ 15 만 CFU / μg의 형질 전환 DNA의 효모 형질 전환 효율은 잘했다. Y2H 기술의 결함과 단점을 파악하고, 중요하고 적절한 방식으로 결과를 해석하면 CORR 그리기에 필수적이다요법 결론. Y2H 분석 및 유도체는 수년간 사용되어왔다과 다른 미끼 특성에 대하여 많은 개선과 개조 후의 한 상호 작용의 세포 내 위치 파악은 상호 작용을 위해 요구 될 수있는 것으로 예상 결합 파트너 및 기타 요인 (참고 Y3H 55, 56, 57). 최근, 어레이 기반 Y2H 스크린할까요 58 수백만 대 다수 베이트 자동화 고 처리량 분석 있도록 개발되었다. 미래는 대부분 다른 연구 분야에서 복잡한 신호 전달 경로와 상호 작용 체의 해명 수 있도록이 분석에 자동화 및 높은 처리량 접근 방식에있다.

<html> 효모 두 하이브리드 스크린 (Y2H)는 11 약 27 년전 한 개발 널리 특정한 단백질 - 단백질 상호 작용이 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10을 결정하는 다양한 분야에 사용되어 이후가 있었다 . 호스트 표적 단백질 세균성 이펙터의 물리적 상호 작용은 종종 표적 단백질의 기능 조작을위한 전제 조건이다. 이러한 상호 작용을 분석하는 것은 감염 생물학 12, 13, 14, 15의 다양한 섹터의 포커스를 이동,&quot;16, 17, 18. Y2H 화면의 원리는 두 단백질의 상호 작용은 리포터 유전자의 발현을 구동하는 기능 전사 인자의 재구성을 유도한다는 것이다. 공지 이펙터 (&gt;을&quot;미끼 &quot;)는 병진 융합 DNA의 결합 도메인 전사 인자 (DBD)와 전위의 상호 작용 파트너 (이하 &quot;먹이&quot;) 상호 작용 파트너 잠재적 라이브러리 알 때문이다. 각각의 전사 인자의 활성 도메인 (AD)에 융합에 인터랙은 소위로 복제됩니다 &quot;먹이 라이브러리.&quot;일반적으로,이 라이브러리가 만든 DBD 인코딩 미끼 벡터와 호환되는 AD를 인코딩 적절한 먹이 벡터 발현 플라스미드로 cDNA를 클로닝하여. 상호 작용의 경우, 재구성 된 전사 인자는 일반적 효모의 성장 선택 사용 리포터 유전자의 발현을 유도한다.을인터랙의 식별은 플라스미드 특이 적 프라이머와 먹이 플라스미드를 시퀀싱에 의해 달성된다. 박테리아는 조작과 호스트의 신진 대사를 공격 또는 방어 메커니즘을 회피하고 다른 세균 분비 시스템 19, 20, 21을 통해 이펙터 분자를 분비하는 다양한 전략을 개발했다. 이러한 세균 이펙터의 결합 파트너를 결정하는 것은 따라서 호스트의 조작 경로를 식별하는 첫 번째 단계입니다. 이것은 특정 병원성 메카니즘의 개선 된 이해를 이끈다. Y2H 스크린 phytoplasmoses 동안 박테리아 효과기 작용을 식별하기 위해 수행되며, 종종 Y2H는 피토 플라스마 조사 22, 23 분자 병원성 메카니즘의 상기 특성화 중요한 초기 실험이다. 그러나, 충족대부분의 출판물에서 HOD 설명은 오히려 부족하고, 이러한 기술들은 생명 공학 회사에 아웃소싱하고 있습니다. 이 방법의 가능성에 관심을 끌기 위해,이 프로토콜은 자연 호스트에 세균 이펙터 분자의 상호 작용 파트너를 식별하기 위해 단계별로 정보를 제공합니다. 넓은 사용과 Y2H 화면의 빨리 감기 접근에도 불구하고, 특정 상호 작용은 효모 시스템에서 발생하지 않을 수도 있음을 잊어서는 안됩니다. 이 효모 세포는 특정 생물학적 제한으로 &quot;생체 반응 용기&quot;의 일종으로 사용되기 때문이다. 몇몇 저자들은 장점 및 Y2H 및 그 유도체 11, 24, 25, 26, 27의 단점을 해결했다. 일반적인 고려 사항은 효모 세포 적절한를 제공 할 수 있음을, 예를 들면, 아르유전자 발현 (포스트) 번역, 또는 각각의 단백질 translocational 조건은 연구되고. 이 화면에서 위음성 결과로 이어질 수 있습니다. 긍정적 인 상호 작용을 차례로 유물 할 수 있으며 (해당 호스트에 이펙터의 경우, 즉) 자연 상태에서 발생하지 않을 수 있습니다. 더 밀접하게 관련된 생물학적 시스템에서의 상호 독립적 인 테스트와 이종 효모 발현 시스템에서의 상호 작용을 확인하는 것이 필수적이다. 본 연구에서는 비 경작 식물 병원균 말리 Candidatus 피토 플라스마 (P.의 말리)에서 이펙터 ATP_00189의 결합 파트너가 확인되었다. 결과는 애플의 증식 (28), 유럽 (29)에 영향 사과 재배 지역에서 높은 경제적 손실을 유발하는 질병의 증상 개발의 기초가되는 분자 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>DNA 준비용</td> <td>세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)</td><td>Applichem</td><td>A6284</td></tr><tr><td>트리스하이드록시메틸아미노메탄(Tris)</td><td>미디어 및 완충액용</td> <td>Applichem</td><td>A2264</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>미디어 및 완충액용</td> <td>Applichem</td><td>A2942</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염(NaEDTA)</td>미디어 및 완충액용 <td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosin 나트륨 염</td><td>Applichem</td><td>A7402</td><td>DNA 준비</td></tr><tr><td>암모늄 아세테이트&nbsp;</td><td>DNA 준비를 위한</td> <td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>9688</td></tr><tr>DNA <td>준비를 위한</td><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Applichem</td><td>A1108</td></tr><tr><td>이소프로판올(2-프로판올)</td><td>DNA 준비를 위한</td> <td>Applichem</td><td>A3928</td></tr><tr>DNA <td>준비를 위한</td><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>51976DNA</td></tr><tr><td>준비를</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>위한 RNAse Applichem A2760클로로포름:DNA 준비용 Isoamyl 24:1</td><td>Applichem</td><td>A1935</td><td></td></tr><tr><td>교정 중합효소(예: iProof)</td><td>PCR용</td> <td>Bio-Rad</td><td>203433</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0271</td><td>클로닝용</td></tr><tr><td>SalI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0641</td><td></td></tr><tr><td>컬럼 기반 DNA 정제 키트(><예: QIAquick)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>클로닝을 위한</td></tr><tr><td>카나마이신 설페이</td>트 <td>Applichem</td><td>A1493</td><td>미생물 선택을 위한</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>자가 <td>활성화 분석을 위한</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A8056</td></tr><tr><td>L-Arginine Monohydrochloride&nbsp;</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Applichem</td><td>A3680</td></tr><tr><td>L-Isoleucine&nbsp;</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Applichem</td><td>A3642</td></tr><tr><td>L-lysine Monohydrate&nbsp;</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Applichem</td><td>A3448</td></tr><tr><td>L-메티오닌&nbsp;</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Applichem</td><td>A3897</td></tr><tr><td>L-페닐알라닌&nbsp;</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Applichem</td><td>A3464</td></tr><tr><td>L-트레오닌&nbsp;</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Applichem</td><td>A3946</td></tr><tr><td>L-티로신&nbsp;</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Applichem</td><td>A3401</td></tr><tr><td>L-Uracile</td> 효<td>모 배양을 위한</td><td>Applichem</td><td>A0667</td></tr><tr><td>L-Valine&nbsp;</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Applichem</td><td>A3406</td></tr><tr><td>L-아데닌 헤미설페이트 소금&nbsp;</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Applichem</td><td>A1596</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m</td><td>멸균 여과를 위한</td>모공 필터 <td>Sartorius</td><td>16541</td></tr><tr><td>L-Histidine Monohydrochloride</td><td>Applichem</td><td>A3719</td><td>효모 배양을 위한</td></tr><tr><td>L-Leucine&nbsp;</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Applichem</td><td>A3496</td></tr><tr><td>L-트립토판&nbsp;</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Applichem</td><td>A3410</td></tr><tr><td>효모 질소 베이스&nbsp;</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>51483</td></tr><tr><td>D-Glucose Monohydrate&nbsp;</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Applichem</td><td>A1349</td></tr><tr><td>효모 및 박테리아 배양을 위한</td><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-1</td></tr><tr><td>효모 배양을 위한</td><td>펩톤</td>, 효모 배양을 위한 <td>Applichem</td><td>A2208</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 4000(PEG)</td><td>효모 변형을 위한</td> <td>Applichem</td><td>A1249</td></tr><tr><td>리튬 아세테이트 이수화물(LiOAc)</td>효모 변형을 위한 <td>Applichem</td><td>A3478</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자 DNA&nbsp;</td><td>효모 형질전환용</td> <td>Applichem</td><td>A2159</td></tr><tr><td>Lex-A 태그에 대한 항체 (예: Anti-LexA DNA 결합 영역)</td><td>Millipore</td><td>06-719</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>플라스미드 Miniprep 키트(예: GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PLN350</td><td>효모 및 박테리아에서 플라스미드 정제</td></tr><tr><td>Acid Washed Glass beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>효모에서 플라스미드 정제를 위한</td> <td>G8772</td></tr><tr><td>미생물 선택을 위한</td><td>Ampicillin Sodium Salt</td><td>Applichem</td><td>A0839</td></tr><tr><td>효모 배양을 위한</td><td>효모 추출물</td><td>Applichem</td><td>A1552</td></tr><tr><td>진공 농축기 원심분리기 (eg. Concentrator 5301)</td><td>Eppendorf</td><td>Z368245 (Sigma)</td><td>DNA 준비를 위한</td></tr><tr><td>Bait vector (e. pLexA-N)</td><td>Y2H</td>먹이 벡터용 <td>Dualsystems</td><td>P01004</td></tr><tr><td>><(예: pGAD-HA)</td><td>Y2><H용</td> <td>Dualsystems</td><td>P01004</td></tr>(<tr><td>예: pLexA-p53)</td><td>Y2H용</td>Dualsystems <td>P01004</td><td></td></tr>(<tr><td>예: pACT-largeT)Y2><</td>H용 Dualsystems <td>P01004</td>(예: /em largeT)<td>Y2H</td><td></td></tr><tr><td>용 Dualsystems P01004Electrocompetent E. coli (예: MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td><td>C640003</td><td></td><td>효</td></tr><tr><td>모 리포터 균주(NMY51:MATahis3&Delta; 200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.e. NMY51)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>Y2H</td></tr><tr><td>플라스틱 파라핀 필름(예: Parafilm M)</td><td>효모 및 박테리아 배양용</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td></tr><tr><td>가스 투과성 실러(예: BREATHseal)</td>효모 배양용 <td>Greiner</td><td>676 051</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cycler (예: T100 Thermal Cycler)</td><td></td><td>PCR</td><td></td></tr> <tr><td>정량 PCR Cycler용 Bio-Rad 1861096 (예: CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>정<td>량 PCR</td><td></td> 마이크로 원심분리기용 <td>Bio-Rad</td> 1855195</tr> (<tr><td>예: Centrifuge 5417 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>일반 실험실 장비</td></tr><tr><td>원심분리기 (예: 원심분리기 5804 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>일반 실험실 장비</td></tr><tr><td>뉴클레아제 무함유 정제수 (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td><td>PCR 및 DNA 작업을 위한</td> <td>5Prime</td><td>2500010</td></tr><tr><td>DNA 준비를 위한</td><td>Scalpell</td><td>Swann-Morton</td><td>0301</td></tr><tr><td>멸균 필터(0.22 &micro; m; </td><td>VWR-International</td><td>514-0073 (유럽 카탈로그 번호)</td> <td>효모 및 박테리아 배양</td></tr><tr><td>페트리 접시 &Oslash; 90 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td>효모 및 박테리아 배양</td></tr><tr><td>페트리 접시 &Oslash; 150 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>효</td><td>모 배양을 위한</td></tr><tr><td>639161 광도계(예: BioPhotometer)</td><td>효모 배양을 위한</td> <td>Eppendorf</td><td>550507804</td></tr><tr><td>광도계 큐벳</td><td>효모 배양을 위한</td><td>브랜드</td><td>759015</td></tr><tr><td>수조(예: 수조(예: /em 수조: Memmert WB7</td> <td>효모 변형용</td> <td>Memmert</td><td>WB7</td></tr><tr><td>웨스턴 블롯 장비</td><td>단백질 2201210검출을 위한</td> <td>다양한 Bio-Rad</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker(Erlenmeyer) 플라스크(100 mL, 1,000 mL, 2,000 mL) 및 통기성 면 플러그(예: Duran Erlenmeyer 내로우넥 플라스크)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232793, Z232858,</td><td>효모 및 박테리아 배양을 위한</td>Z232866</tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터(예: GFL 3031)</td><td>GFL</td><td>3031</td><td>효모 및 박테리아 배양용</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>바인더</td><td>KB 53 (E3.1)</td><td>효모 및 박테리아 배양용</td></tr><tr><td>제빙기(<예: <>> 제빙기 IF 825)</td><td>Omniwash</td><td>IF 825</td><td>일반 실험실 장비</td></tr><tr><td>0.2 mL, 1.5 mL 및 2.0 mL 반응 바이알(폴리프로필렌)</td><td>Eppendorf</td><td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td><td>일반 실험 장비</td></tr><tr><td>피펫 및 일회용 피펫 팁(다양한 부피: 10 - 1,000 &마이크로; L)</td><td>Eppendorf</td><td>다양한</td><td>일반 실험 장비</td></tr><tr>효<td>모 및 박테리아 배양을 위한</td><td>스프레더</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SPR-L-S01</td></tr><tr><td>Vortex shaker(예: MS 3 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>일반 실험 장비</td></tr><tr><td>T4-Ligase</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0011</td><td>복제용</td></tr><tr><td>냉장고(4 &deg; C) (예: Liebherr Medline FKEX 5000)</td><td>Liebherr</td><td>81.767.580.4</td><td>일반 실험실 장비</td></tr><tr><td>냉동고 (-20 &deg; C) (예: Liebherr Comfort Professional G5216)</td><td>Liebherr</td><td>G5216</td><td>일반 실험실 장비</td></tr><tr><td>눈금 실린더 (eg 브랜드)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z327352; Z327417; Z327441&nbsp; &nbsp;</td><td>일반 실험실 장비</td></tr><tr><td>혈청학 피펫 (eg. Fisherbrand)</td><td>효모 및 박테리아 배양을 위한</td> <td>Thermo Fisher</td><td>S55701</td></tr><tr><td>기계식 피펫터(e. Pipetboy acu 2)</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155000</td><td>일반 실험실 장비</td></tr><tr><td>전기천공용 큐벳(1mm)</td><td>박테리아 변형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>을 위한 Molecular Bio Products 5510-11Electroporator (예: Eporator)</td><td>박테리아 형질전환용</td> <td>Eppendorf</td><td>4309000019</td></tr><tr><td>Gel and Blot imaging system (e. ChemiDoc MP System)</td><td>Bio-Rad</td><td>1708280</td><td>일반 실험실 장비</td></tr><tr><td>Conical centrifuge tube (Polypropylene) (50 mL)</td><td>VWR-International&nbsp;</td><td>525-0403 (유럽 카탈로그 번호)</td><td>일반 실험실 장비</td></tr><tr><td>원추형 원심분리기 튜브 (폴리프로필렌) (13 mL)</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>일반 실험실 장비</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT; 1 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>P2325</td><td>for ligation</td></tr><tr><td>adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))Ambion</td><td>&nbsp;</td><td>AM8110G(Thermo Scientific에서 배포)</td><td></td></tr><tr><td>히스티딘, 류신, 트립토판 및 아데닌이 없는 결찰 드롭아웃 믹스(DO, 예: 효모 합성 드롭아웃 매체 보충제)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2021 Sigma&nbsp;</td><td>효모 배양용(기성품 믹스)</td></tr></tbody></table>

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

질병 발현의 분자 메커니즘을 해결했습니다 것은 식물 과학 병리와 증상의 발전을 이해하는 것이 중요합니다. 박테리아는 자신의 이익을 위해 자신의 호스트 신진 대사를 조작하기 위해 다른 전략을 진화했다. 이 박테리아 조작은 종종 심각한 증상 개발 또는 영향을받는 식물의 죽음과 연결되어있다. 호스트 조작에 책임이있는 특정 박테리아 분자를 결정하는 것은 미생물 연구의 중요한 분야가되고있다. 불리는이 박테리아 분자의 식별 한 후 &quot;이펙터,&quot;그들의 기능을 규명하는 것이 중요하다. 직접적인 방법은 이펙터의 기능은 효모 두 하이브리드 (Y2H) 화면을 통해 자연 호스트에서의 단백질 바인딩 파트너를 식별하는 것입니다 결정합니다. 일반적으로 호스트는 실리 알고리즘의 모든 의해 충분히 예상 할 수없는 수많은 잠재적 인 바인딩 파트너를 항구. 따라서 PERFO 할 수있는 최선의 선택표현 호스트 단백질의 전체 라이브러리에 대한 가상 이펙터로 화면을 RM은. 원인이 에이전트가 피토 플라스마와 같은 uncultivable 경우는 특히 도전이다. 이 프로토콜은 피토 플라스마에 감염된 나무가 우거진 호스트 공장, 잠재적 인 이펙터의 증폭 및 Y2H 화면과 식물의 분자 상호 작용 파트너의 후속 식별에서 DNA 정제에 대한 단계별 지침을 제공합니다. Y2H 화면은 일반적으로 사용되는 경우에도, 비용의 Y2H 서비스를 제공 바이오텍 회사에이 기술을 조달하는 경향이있다. 이 프로토콜은 표준 실험실 기술을 사용하여 임의의 품위를 갖추고 분자 생물학 실험실에서 Y2H을 수행하는 방법에 대한 지침을 제공합니다.

실제 Y2H 화면이 수행 할 수 있습니다 전에 미끼 자기 활성화를 위해 테스트해야합니다. 이는 빈 먹이 라이브러리 벡터와 함께 베이트 발현 벡터 변환 선택적 접시에 성장을 확인함으로써 달성된다. 섹션 5. 베이트 플라스미드 TRP 보완하고 먹이 S. cerevisiae의 NMY51 40 레우 영양 요구 플라스미드에 설명 된대로 phytoplasmal 단백질 ATP_00189 자기 활성화를인지를 분석하기 위하여, 자기 활성화 시험을 수행 하였다. 성공적인 공동 변환 따라서 TRP와 레우가없는 선택적 판에 성장을 특징으로한다. 미끼와 먹이 단백질의 상호 작용 NMY51의 자신과 에이드 영양 요구의 보완에 연결됩니다. 상호 작용의 부재 미끼로 자기 활성화가 나타나면, 효모는 자신과 에이드가없는 선택적 접시에 성장한다. 강하고 약한 자기활성화가 발생할 수 있습니다. 미끼의 강한 자기 활성화 TRP-레우 - 그의 - 에이드 고갈 선택 접시에 공동 형질 전환 된 효모의 성장을 특징으로한다. 약한자가 활성화에 성장에 이르게 TRP-레우 - 그의하지만 TRP-레우 - 그의 - 에이드 고갈 선택 접시에. 적절한 양성 대조군에는 자기 활성화 분석의 결과를 해석 불가결하다. 상기 자기 활성화 분석의 예상 결과의 요약과 그 해석은 표 1에 제공 그림 1에서 시각화된다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> 그림 1 : Y2H 화면을 수행하기 전에 미끼의 미끼 자기 활성화 테스트의 예. , 약한자가 활성화 플러스 빈 먹이 천칭 자리 : S. cerevisiae의 NMY51은 양성 대조군 (교류 왼쪽 패널)와 같은 (플렉스-p53의) 먹이 (PACT-largeT) 미끼 상호 작용과 공동 형질 전환공예 벡터 (중간 패널 : DF) 및하지 자체 활성화 미끼 플러스 빈 먹이 라이브러리 벡터 (오른쪽 패널 : GI). , TRP, 레우와 그의 (중간 패널 : B, E, H) : 공동 형질 전환 된 효모가 TRP와 레우 (A, D, G, 상단 패널) 부족 SD 접시에 배양하고, TRP, 레우을, 자신과 에이드 (낮은 패널 : C, F, I). 미끼 벡터가 TRP의 영양 요구와 먹이 벡터 NMY51 (SD-TRP-레우에 성장)의 레우의 영양 요구를 보완으로 매체 부족한 TRP와 레우에 선택, 성공적인 공동 변환에 대한 긍정적 인 컨트롤입니다. 미끼 먹이 또는 미끼 자동 활성화의 상호 작용의 경우, NMY51의 리포터 발현은 켜져 있고 그와 ADE 영양 요구 (SD-TRP-의 Leu-그의 아데에 성장)를 보완한다. 약한자가 활성화는 SD-TRP-레우 - 자신의 접시에 성장이 특징입니다 (가운데 패널, DF). 미끼의 약한자가 활성화 전에 미끼를 분석 감소해야Y2H 화면에서 선택 배지에 3-AT를 첨가하여 예. 아미노산 고갈 함께 표시됩니다 &quot;-&quot;각 미디어의 이름으로. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> 없음 </td><td> 식민지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td></tr><tr><td> 없음 </td><td> pGAD-HA </td><td> 더 성장하지 </td><td> 식민지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> 없음 </td><td> 식민지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td><td&gt; 식민지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td></tr><tr><td> pLexA-p53의 </td><td> PACT-largeT </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 미끼 자기 활성화 분석에 예상 결과. S. cerevisiae의 NMY51의 변환은 공동 형질 전환 미끼 먹이의 특성에 따라 선택적 미디어에 차동 성장을 산출한다. 선택적 접시에 성장은 30 ° C에서 72 시간 배양 후 다른 벡터 조합 (AF)의 변화에 ​​따라 평가 하였다. 약한자가 활성화는에 효모의 성장을 특징으로 SD-TRP-레우 - 자신과 SD-TRP-레우 - 그의 - 에이드 선택 작은지면에 성장에 의해 강한 자기 활성화상호 작용 파트너의 부재하에 에스. pLexA-N 인코딩 phytoplasmal 이펙터 ATP_00189는 NMY51 자신과 에이드의 부재에서 성장하는 형질 전환 미끼 벡터의 무능력을 특징으로 자기 활성화를 발생하지 않습니다. 미끼에 따라 Y2H 화면이 선택적 접시에 성장하는 수많은 효모 클론을 얻을 수 있습니다. 모든 클론을 분석하고 가능한 중복 검사해야합니다. 정규화 된 cDNA 라이브러리가 사용 된 경우에도, 인터랙 많은 다른 클론 표현 가능성이 높다. 라이브러리 클로닝 기법에 따라, 전체 유전자의 단편을 일부 잡아 벡터에 삽입하는 것도 가능하다. (cDNA의부터) 증폭과 인터랙의 전체 길이 유전자를 서브 클로닝하고 일대일 Y2H 분석 (도 2)에서의 상호 작용을 시험하기 노보을 해제하는 것이 바람직하다. <img aLT = &quot;그림 2&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2 : Y2H 실험에서 미끼와 먹이 사이의 상호 작용의 예. 효모 두 하이브리드 (Y2H) 화면을 수행하고 긍정적 인 인터랙 클론의 플라스미드를 정제 하였다. 먹이 벡터는 서열하고, 아 X의 domestica에 호스트 상호 작용 파트너 MdTCP24 및 MdTCP25이 확인되었다. 부정적인 제어 MdTCP34 (있는 더 인터랙가 Y2H 라이브러리 화면에서 확인되지 않았다)으로 병렬로 서브 클로닝 하였다. 전장 유전자 먹이 벡터 (공동 cistronically 활성 도메인 AD 표현) 내로 서브 클로닝 사과의 cDNA로부터 증폭되었다 새로이 DNA의 결합 도메인 (BD)에 접속 세균 이펙터 ATP_00189 표현 베이트 벡터로 공동 - 형질 전환. 이 수치는 28에서 가져옵니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 버전입니다.

세균 이펙터 단백질 성공적인 감염의 확립에 중요하다. 이 프로토콜은 천연 식물 호스트에 세균 이펙터 단백질의 단백질 결합 파트너의 실험 식별을 설명합니다. 효모 두 하이브리드 화면을 통해 이러한 이펙터 상호 작용을 확인하는 분자 병원성 전략을 탈피하는 중요한 도구가되었습니다.

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 Candidatus Phytoplasma Malefactor 단백질과 Malus domestica 유래 숙주 단백질 간의 상호작용을 식별함으로써 병원성 전략과 숙주-병원균 시스템을 밝히는 것입니다. 이 방법은 다양한 생물학적 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 본 연구에서는 사과 증식병(Apple Proliferation Disease) 발생의 근저에 있는 분자적 기전을 규명하기 위해 식물 연구에 적용되었습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 병원균 이펙터를 수천 개의 잠재적 상호작용 단백질에 대해 스크리닝할 수 있다는 점이며, 따라서 이 방법은 감염 연구의 용이한 시작점이 될 수 있습니다.먼저, 사과 증식병(Apple Proliferation)의 특이 증상을 보이는 감염 나무와 증상이 없는 대조군 나무를 식별합니다. 소독된 전정가위를 사용하여 뿌리 시스템의 서로 다른 세 지점에서 직경 0.5~1 cm, 길이 약 5 cm의 뿌리 샘플을 채취합니다. 채취한 뿌리 샘플을 적절히 라벨링된 플라스틱 백에 넣습니다.그런 다음 샘플을 냉각 팩이 들어 있는 콜드 박스에 넣고 추가 처리 전까지 4 °C에서 보관하십시오. 뿌리 샘플을 물로 헹구어 흙을 제거합니다. 이어서 샘플을 멸균 페트리 접시에 옮기고 멸균된 메스를 사용하여 뿌리 표피와 피층을 제거하십시오.보풀이 없는 깨끗한 티슈로 메스를 닦습니다. 그다음 기구를 70% ethanol에 담근 후, 개방된 불꽃 위에서 가열 멸균합니다. 메스를 사용하여 체관부를 긁어냅니다.시료를 작은 조각으로 자른 후, 30-100 mg의 조각을 멸균된 2 mL 반응 튜브에 분주합니다. 시료를 -80 °C에서 보관하거나 즉시 사용하여 DNA를 분리하며, 이 DNA는 이펙터 유전자 증폭 및 이후 베이트 벡터로의 이펙터 클로닝을 위한 템플릿으로 사용됩니다. 감염된 나무에서 파이토플라스마 다특이적 DNA를 분리한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 베이트 벡터에 클로닝하고 자가 활성화 및 발현 여부를 테스트합니다.효과물(effector)이 형질전환된 NMY51 ATP 00189를 신선한 SD-trp 플레이트에 스트리킹하고, 붉은색 콜로니가 나타날 때까지 30 °C에서 2~3일 동안 배양합니다. 한천 플레이트의 붉은색 콜로니를 사용하여 소형 진탕 플라스크에 담긴 3 mL의 SD-trp 배지에 접종하고, 30 °C에서 120-150 rpm으로 진탕하며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양한 배양액 1 mL를 진탕 플라스크의 20 mL SD-trp에 접종하고 8시간 동안 성장시킵니다.SD-trp 배지를 사용하여 배양액의 OD600을 0.2로 조정하고, 배양액 10 mL를 사용하여 SD-trp 배지 100 mL가 담긴 플라스크 2개에 접종합니다. 배양액을 30 °C에서 overnight으로 진탕 배양합니다. 그다음, 배양액의 OD600을 측정하고 120 OD600 unit에 해당하는 세포를 펠렛화합니다.예를 들어, OD600 수치가 1.2로 측정된 경우, 시료 100 milliliters를 원심 분리하여 상층액을 버리고, 미리 데워둔 2xYPAD 800 milliliters를 사용하여 펠렛을 두 개의 쉐이커 플라스크에 재부유시킨 후 30 degrees Celsius에서 배양합니다. 효모 배양액을 30 degrees Celsius, 120-150 rotations per minute 조건에서 배양하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 OD600 수치가 0.6에 도달할 때까지 약 1.5시간마다 OD600을 측정합니다.텍스트 프로토콜에 따라 연어 정자 DNA, Te Lithium OAc 및 PEG Lithium OAc를 준비한 후, 효모 배양액 800 milliliters를 700 x G에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 총 200 milliliters의 멸균 2중 증류수에 재현탁합니다. 그 후 세포를 다시 펠릿화하고 상층액을 버립니다.펠릿을 16 milliliters의 Te Lithium OAc 혼합액에 다시 현탁하고 샘플을 다시 원심 분리합니다. 그 다음 상층액을 제거하고, 9.6 milliliters의 Te Lithium OAc를 사용하여 펠릿을 다시 현탁합니다. 적절한 크기의 반응 용기에 peak Add HAC DNA 라이브러리 벡터 7 micrograms, 2% salmon sperm DNA 100 microliters, 그리고 PEG Lithium OAc 혼합액 2.5 milliliters를 넣어 12개의 바이알을 준비합니다.이전에 준비한 효모 세포 현탁액 600 µL를 12개의 바이알 각각에 넣고 1분 동안 격렬하게 혼합합니다. 그다음, 30 °C 항온 수조에서 45분 동안 반응시키며 15분마다 혼합합니다. 이어서, 모든 바이알에 DMSO 160 µL를 첨가하고 격렬하게 혼합합니다.그 다음 바이알을 42 °C에서 20분 동안 추가로 배양합니다. 세포를 펠렛화한 후, 상층액을 제거하고 3 mL의 2xYPAD를 사용하여 각 펠렛을 재부유시킵니다. 12개 바이알의 모든 세포를 100 mL 흔들 플라스크에 모으고, 효모를 30 °C, 120 rpm에서 90분 동안 배양합니다.배양 후, 세포를 펠렛화하여 상층액을 제거한 다음, 10 mL 세롤로지컬 피펫과 4.5 mL의 멸균 0.9% sodium chloride를 사용하여 조심스럽게 파이펫팅함으로써 펠렛을 완전히 재부유시킵니다. 현탁액 50 µL를 취하고 0.9% sodium chloride를 사용하여 1:10부터 1:1000까지 10배 단계 희석액을 준비합니다. 그다음, 각 희석액 100 µL를 SD-trp-leu agar가 포함된 90 mm 페트리 접시에 도말합니다.희석하지 않은 나머지 효모 현탁액을 SD-trp-leu-His-ade 한천이 들어 있는 16x150 밀리미터 직경의 페트리 접시에 도말합니다. 플레이트를 30 degrees Celsius에서 배양하며, SD-trp-leu 플레이트는 3일 동안, SD-trp-leu-his-ade 플레이트는 4일 동안 배양합니다. SD-trp-leu 선택 플레이트에서 서로 다른 단계별 희석액의 콜로니 수를 세어 형질전환 효율을 결정합니다.멸균된 피펫 팁을 사용하여 각 클론을 선택하고 새로운 SD-trp-leu-his-ade 선택 배지에 스트리킹하여 옮깁니다. 플레이트를 30 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 총 5회의 계대 배양이 완료될 때까지 매일 클론 전이 과정을 반복합니다.클론을 분석하기 위해, 멸균 후드 아래에서 각 클론당 1 mL의 SD-trp-leu-his-ade가 담긴 멸균 2 mL 반응 튜브를 준비합니다. 가열된 바늘을 사용하여 각 튜브에 구멍을 뚫고, 가스 투과성 씰러로 구멍을 덮습니다. 각 바이알에 한 클론의 신선한 콜로니 물질을 접종하고, 30 °C, 150 rpm 조건에서 24시간 동안 바이알을 배양합니다.세포를 펠렛화한 후 상층액을 제거하고, 펠렛을 적절한 완충액에 재현탁하여 새로운 2 mL 반응 튜브로 옮깁니다. 현탁액에 산 세척된 유리 비드 100 µL를 첨가하고 튜브를 5분 동안 격렬하게 혼합합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 정제합니다.자가 활성화 분석의 예상 결과 및 그 해석에 대한 요약이 본 표와 그림에 제공됩니다. 약한 자가 활성화는 trp-leu-his 결핍 선택 배지에서는 성장을 유도하지만, trp-leu-his-ade 결핍 선택 배지에서는 성장을 유도하지 않습니다. 반면, 강한 자가 활성화 베이트(bait)가 형질전환된 효모는 trp-leu-his-ade 결핍 배지에서 성장합니다.미끼(bait)와 먹이(prey)의 성공적인 공동 형질전환은 trp와 leu가 결핍된 선택 배지에서의 성장으로 확인됩니다. 미끼 단백질과 먹이 단백질의 상호작용은 NMY51의 his 및 ade 영양요구성(oxytrophy)의 상보 작용을 유도합니다. 여기 제시된 것은 효모 이중 하이브리드(Yeast 2 Hybrid) 실험에서 미끼와 먹이 사이의 상호작용 예시입니다. malus domestica의 숙주 상호작용 파트너인 MdTCP24와 MdTCP25가 확인되었으며, 이펙터(effector)를 이용한 de novo 원추 형질전환을 통해 상호작용이 입증되었습니다.숙련된 경우, 필요한 모든 장비와 재료, 특히 효모를 사전에 적절히 준비한다면 효모 이중 하이브리드법을 하루 만에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 오염을 방지하는 것이 중요하며 항상 무균 상태에서 작업해야 합니다. 본 절차를 마친 후에는 발견된 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위해 예를 들어 이분자 형광 상보법(bimolecular fluorescence complementation)과 같은 또 다른 독립적인 방법을 수행해야 합니다.효모나 하이브리드 그 자체는 위양성 결과를 생성하기 쉬우므로 이는 특히 중요합니다. 개발 이후, 이 기술은 많은 다양한 연구 분야의 연구자들이 단백질-단백질 상호작용, 특히 숙주-병원체 상호작용 및 기타 여러 생물학적 연구 분야와 관련된 분자적 원리를 더 잘 이해할 수 있는 길을 열어주었습니다. 또한, 이 방법은 적절한 설비를 갖춘 분자 생물학 실험실이라면 어디서든 쉽게 수행 가능하다는 것을 알게 될 것입니다.특정 화학 물질, 메스 및 개방형 화염을 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행할 때는 항상 특정 예방 조치를 고려해야 한다는 점을 잊지 마십시오. 즉, 장갑 및 고글과 같은 개인 보호 장구와 일반 실험실 안전 장비를 사용해야 합니다.

unravelling-function-bacterial-effector-from-non-cultivable-plant

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는, 우리는 효모와 효과기 유발 성장 저해 phenotypes의 식별에 세균성 유형 III의 effectors의 표현을위한 절차를 설명합니다. 이러한 phenotypes는 이후 이펙터 기능과 목표를 명료하게하다에 악용될 수 있습니다.

성장 저해 Phenotypes의 확인은 효모에서 세균의 종류 III Effectors 표현에 의해 유도된

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

우리는 기존의 누룩 두 하이브리드 심사, 단백질 상호 작용을 식별하는 효과적인 유전자 도구를 수정했습니다. 이 수정은 현저하게, 과정을 단축 부하를 감소하고, 가장 중요한, 잘못된 반응의 수를 줄일 수 있습니다. 또한,이 방법은 재현성과 신뢰성이다.

성장 팩터 Progranulin와 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위해 수정된 효모 - 2 하이브리드 시스템

이 문서에서는 호스트와 두 개의 직교 방법의 조합을 사용 병원균의 단백질 사이의 높은 자신감 상호 작용 집합의 식별에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 HT-GPCA이라는 포유 동물 세포에서 높은 처리량의 상호 작용 분석에 의해 따랐다.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

여기에 설명된 방법은 anti-apoptotic bacterial effector 단백질의 활성을 해부하기 위해 정의된 단계에서 apoptotic signaling cascade를 유도하는 데 사용됩니다. 이 방법은 또한 pro-apoptotic 또는 독성 단백질의 유도성 발현 또는 다른 신호 경로와의 간섭을 해부하는 데 사용할 수 있습니다.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

효 모 2 잡종 스크린의 일괄 처리 먹이 융해 단백질의 매우 복잡 한 세트로 여러 미끼 단백질의 상호 작용 프로필의 직접 비교 가능합니다. 여기, 우리는 새로운 시 약, 세련 된 방법과 같은 화면에 대 한 그들의 사용을 구현 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

세균성 병원체는 중요한 생물학 프로세스를 표적으로 하는 호스트로 단백질을 은닉합니다. 세균성 이펙터 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로를 확인하는 것은 분자 병인을 해결하는 열쇠입니다. 여기서, 독성 세균 이펙터 단백질에 의해 표적화된 숙주 경로를 해명하기 위해 변형된 효모 억제기 및 독성 스크린을 사용하는 방법이 기재되어 있다.

효모 독성 및 억제기 스크린을 사용하여 세균 효과 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로의 확인

여기서, 우리는 식물 병원체에서 RNA 침묵 억제제를 신속하게 스크리닝하는 데 광범위하게 사용될 수 있는 변형된 스크리닝 방법을 제시한다.

식물 병원균의 분비 이펙터에서 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 식별

단백질-단백질 상호 작용과 같은 생체 분자의 상호 작용은 생물학적 기능의 분자 기초입니다. 특별히 관련 상호작용이 없는 상호작용 null/손상된 돌연변이를 분리할 수 있다면, 이 상호작용의 기능을 이해하는 데 크게 도움이 될 것입니다. 이 문서에서는 interaction-null/impaired mutant를 격리하는 효율적인 방법을 제시합니다.

Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

핵분열 효모는 FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질을 GFP와 함께 번역 융합 단백질로 발현하여 중합을 시각화하는 이종 숙주로 사용됩니다. 또한 중합에 영향을 미치는 화합물은 형광 현미경을 사용하여 이미징하여 식별합니다.

박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 항균 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서의 핵분열 효모

배우세요 효모 두 하이브리드 스크리닝을 사용하여 사과(Malus domestica)의 세균 이펙터와 숙주 단백질 상호작용을 식별하는 방법입니다. 이 기술은 병원성 메커니즘 연구에 필수적입니다.

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

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