효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

세균 이펙터 단백질 성공적인 감염의 확립에 중요하다. 이 프로토콜은 천연 식물 호스트에 세균 이펙터 단백질의 단백질 결합 파트너의 실험 식별을 설명합니다. 효모 두 하이브리드 화면을 통해 이러한 이펙터 상호 작용을 확인하는 분자 병원성 전략을 탈피하는 중요한 도구가되었습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 candidatus phytoplasma malefactor 단백질과 malus domestica의 숙주 단백질의 상호 작용을 식별하여 악성 전략과 숙주 병원체 시스템을 밝히는 것입니다. 이 방법은 다양한 생물학 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 사과 증식병 발병의 기저에 있는 분자 메커니즘을 밝히기 위해 식물 연구에 사용됩니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 병원체 효과기로 수천 개의 잠재적 상호작용 인자를 스크리닝할 수 있어 감염 연구에서 쉽게 실현 가능한 출발점이 될 수 있다는 것입니다.

먼저 Apple Proliferation 특정 증상이 있는 감염된 나무를 식별하고 증상이 없는 나무를 방제합니다. 깨끗한 전지가위를 사용하여 직경이 0.5-1cm이고 길이가 약 5cm인 뿌리 시스템의 세 가지 다른 부위에서 뿌리 샘플을 자릅니다. 뿌리 샘플을 적절하게 라벨이 붙은 비닐 봉지에 넣으십시오.

그런 다음 샘플을 냉각된 열 팩과 함께 차가운 상자에 넣고 추가 처리가 될 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다. 뿌리 샘플을 물로 헹구어 흙을 제거하십시오. 그런 다음 샘플을 멸균 페트리 접시에 옮기고 멸균된 메스를 사용하여 뿌리 표피와 피질을 제거합니다.

깨끗하고 보푸라기가 없는 티슈로 메스를 닦습니다. 그런 다음 기기를 70% 에탄올에 담그고 화염으로 열 살균합니다. 메스를 사용하여 체관부를 긁습니다.

샘플을 작은 조각으로 자르고 30-100 밀리그램의 조각을 멸균 2 밀리리터 반응 튜브에 분취합니다. 샘플을 섭씨 80도에서 보관하거나 즉시 사용하여 DNA를 분리할 수 있으며, 이는 effector 유전자 증폭 및 effector를 미끼 벡터로 복제하기 위한 템플릿 역할을 합니다. 감염된 나무에서 파이토플라스마 다중특이성 DNA를 분리한 후, 미끼 벡터로 복제하고 텍스트 프로토콜에 따라 자가 활성화 및 발현을 테스트합니다.

Streak plex A ATP 00189 effector는 NMY51을 새로운 SD-trp 플레이트에 변형시키고 붉은 집락이 나타날 때까지 2-3일 동안 섭씨 30도에서 배양했습니다. 한천 플레이트의 빨간색 콜로니를 사용하여 작은 진탕 플라스크에 3ml의 SD-trp 배지를 접종하고 분당 120-150회 회전으로 진탕하면서 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 1ml의 하룻밤 배양액으로 20ml의 SD-trp를 진탕 플라스크에 접종하고 8시간 동안 배양합니다.

SD-trp 배지를 사용하여 배양액을 0.2의 OD600으로 조정하고 10ml의 배양액으로 각각 100ml의 SD-trp 배지를 함유한 두 개의 플라스크를 접종합니다. 밤새 흔들면서 섭씨 30도에서 배양물을 배양합니다. 다음으로, 배양 및 펠릿 120 OD600 단위의 OD600을 측정합니다.

예를 들어, 1.2의 OD600을 측정한 경우 100ml의 샘플을 스핀다운하고 상층액을 버리고 800ml의 예열된 2xYPAD를 사용하여 펠릿을 두 개의 셰이커 플라스크에 재현탁하고 섭씨 30도에서 배양합니다. 효모 배양액을 섭씨 30도에서 분당 120-150회 회전으로 배양합니다. OD600이 0.6의 OD600에 도달할 때까지 텍스트 프로토콜에 따라 약 1.5시간마다 OD600을 측정합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 연어 정자 DNA, Te Lithium OAc 및 PEG Lithium OAc를 준비한 후 700 x G에서 800ml의 효모 배양을 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 총 200ml의 멸균 이중 증류수에 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 다시 펠렛화하고 상등액을 버립니다.

16ml의 Te Lithium OAc 혼합물에 펠릿을 재현탁하고 샘플을 다시 스핀다운합니다. 그런 다음 상등액을 버린 후 9.6ml의 Te Lithium OAc를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 적절한 크기의 반응 용기에서 7마이크로그램의 피크 Add HAC DNA 라이브러리 벡터, 100마이크로리터의 2% 연어 정자 DNA 및 2.5ml의 PEG 리튬 OAc 혼합물이 포함된 12개의 바이알을 준비합니다.

미리 준비된 효모 세포 현탁액 600마이크로리터를 12개의 바이알 각각에 넣고 1분 동안 세게 혼합합니다. 그런 다음 섭씨 30도의 수조에서 45분 동안 15분마다 혼합하여 반응을 배양합니다. 다음으로, 모든 바이알에 160마이크로리터의 DMSO를 넣고 격렬하게 혼합합니다.

그런 다음 바이알을 섭씨 42도에서 추가로 20분 동안 배양합니다. 세포를 펠렛화한 후 상등액을 버리고 3ml의 2xYPAD를 사용하여 각 펠릿을 재현탁합니다. 12개 바이알의 세포를 모두 100ml 셰이커 플라스크에 넣고 효모를 섭씨 30도에서 120회, 분당 120회 회전하며 90분 동안 배양합니다.

배양 후 세포를 펠릿화하고 상층액을 버린 후 10ml 혈청학 피펫과 4.5ml의 멸균 0.9% 염화나트륨을 사용하여 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 완전히 재현탁합니다. 현탁액 50 마이크로 리터를 인출하고 0.9 % 염화나트륨을 사용하여 1:10에서 1:1000까지 10 배 희석을 준비합니다. 그런 다음 SD-trp-leu 한천이 들어있는 90mm 페트리 접시에 각 희석액 100 마이크로 리터를 플레이트합니다.

16x150mm 직경의 페트리 접시에 희석되지 않은 효모 현탁액의 나머지 부분을 SD-trp-leu-His-ade 한천으로 펴 바릅니다. SD-trp-leu 플레이트의 경우 3일, SD-trp-leu-his-ade 플레이트의 경우 4일 동안 섭씨 30도에서 플레이트를 배양합니다. SD-trp-leu 선택 플레이트에서 서로 다른 연속 희석액의 콜로니를 계수하여 transfection 효율을 측정합니다.

멸균 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 선택하여 새로운 SD-trp-leu-his-ade 선택적 플레이트에 줄무늬를 만들어 각 클론을 옮깁니다. 플레이트를 섭씨 30도에서 24시간 동안 배양합니다. 총 5개의 계대에 도달할 때까지 매일 클론 전달을 반복합니다.

클론을 분석하려면 멸균 후드 아래에서 각 클론에 대해 1ml의 SD-trp-leu-his-ade가 포함된 멸균 2밀리리터 반응 튜브 1개를 준비합니다. 뜨거운 바늘을 사용하여 각 튜브에 구멍을 뚫고 가스 투과성 실러를 사용하여 구멍을 덮습니다. 각 바이알에 하나의 클론에서 추출한 새로운 콜로니 물질을 접종하고 바이알을 섭씨 30도에서 24시간 동안 분당 150회 회전으로 배양합니다.

세포를 펠릿화하고 상층액을 버린 후, 펠릿을 적절한 완충액에 재현탁시키고 새로운 2ml 반응 튜브로 옮깁니다. 100마이크로리터의 산성 세척 유리 구슬을 현탁액에 추가하고 튜브를 5분 동안 세게 혼합합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 정제합니다.

self-activation assay의 예상 결과와 그 해석에 대한 요약이 이 표와 그림에 제공됩니다. 약한 자기 활성화는 trp-leu-his에서 성장으로 이어지지만 trp-leu-his-ade 고갈 선택 플레이트에서는 성장하지 않습니다. 강력한 자체 활성화 미끼로 변형된 효모는 배지가 없는 trp-leu-his-ade에서 자랄 것입니다.

미끼와 먹이의 성공적인 동시 변형은 trp와 leu가 결핍된 선택적 플레이트에서의 성장이 특징입니다. 미끼와 먹이 단백질의 상호 작용은 NMY51의 His와 ade oxytrophy의 보완으로 이어집니다. 다음은 효모 2 하이브리드 실험에서 미끼와 먹이 사이의 상호 작용의 예입니다. malus domestica 숙주 상호작용 파트너인 MdTCP24 및 MdTCP25를 확인하고 effector를 사용한 denovo cone transformation에 의해 상호 작용을 확인했습니다.

일단 숙달되면 필요한 모든 장비와 재료, 특히 효모 가 사전에 적절하게 준비되면 효모 2 하이브리드를 하루 만에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 오염을 피하고 항상 멸균 상태에서 작업하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 예를 들어 발견된 단백질-단백질 상호 작용을 확인하기 위해 이중 분자 형광 보완과 같은 다른 독립적인 방법을 수행해야 합니다.

이는 효모 또는 하이브리드 자체가 위양성 결과를 생성하는 경향이 상대적으로 높기 때문에 특히 중요합니다. 개발 후 이 기술은 다양한 연구 분야의 연구자들이 특히 숙주-병원체 상호 작용 및 기타 여러 생물학 연구 분야에서 단백질-단백질 상호 작용과 관련된 분자 원리를 더 잘 이해할 수 있는 길을 열었습니다. 또한, 이 방법을 수행하는 것은 적절한 장비를 갖춘 분자 생물학 실험실에서 쉽게 실현 가능하다는 것을 이해하게 될 것입니다.

특정 화학 물질, 메스 및 화염으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행할 때 항상 특정 예방 조치를 고려해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 즉, 장갑과 고글과 같은 개인 안전 장비를 사용하고 일반 실험실 안전 장비를 사용하십시오.