효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

본 실험 절차의 전반적인 목표는 Candidatus Phytoplasma Malefactor 단백질과 Malus domestica 유래 숙주 단백질 간의 상호작용을 식별함으로써 병원성 전략과 숙주-병원균 시스템을 밝히는 것입니다. 이 방법은 다양한 생물학적 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 본 연구에서는 사과 증식병(Apple Proliferation Disease) 발생의 근저에 있는 분자적 기전을 규명하기 위해 식물 연구에 적용되었습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 병원균 이펙터를 수천 개의 잠재적 상호작용 단백질에 대해 스크리닝할 수 있다는 점이며, 따라서 이 방법은 감염 연구의 용이한 시작점이 될 수 있습니다.

먼저, 사과 증식병(Apple Proliferation)의 특이 증상을 보이는 감염 나무와 증상이 없는 대조군 나무를 식별합니다. 소독된 전정가위를 사용하여 뿌리 시스템의 서로 다른 세 지점에서 직경 0.5~1 cm, 길이 약 5 cm의 뿌리 샘플을 채취합니다. 채취한 뿌리 샘플을 적절히 라벨링된 플라스틱 백에 넣습니다.

그런 다음 샘플을 냉각 팩이 들어 있는 콜드 박스에 넣고 추가 처리 전까지 4 °C에서 보관하십시오. 뿌리 샘플을 물로 헹구어 흙을 제거합니다. 이어서 샘플을 멸균 페트리 접시에 옮기고 멸균된 메스를 사용하여 뿌리 표피와 피층을 제거하십시오.

보풀이 없는 깨끗한 티슈로 메스를 닦습니다. 그다음 기구를 70% ethanol에 담근 후, 개방된 불꽃 위에서 가열 멸균합니다. 메스를 사용하여 체관부를 긁어냅니다.

시료를 작은 조각으로 자른 후, 30-100 mg의 조각을 멸균된 2 mL 반응 튜브에 분주합니다. 시료를 -80 °C에서 보관하거나 즉시 사용하여 DNA를 분리하며, 이 DNA는 이펙터 유전자 증폭 및 이후 베이트 벡터로의 이펙터 클로닝을 위한 템플릿으로 사용됩니다. 감염된 나무에서 파이토플라스마 다특이적 DNA를 분리한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 베이트 벡터에 클로닝하고 자가 활성화 및 발현 여부를 테스트합니다.

효과물(effector)이 형질전환된 NMY51 ATP 00189를 신선한 SD-trp 플레이트에 스트리킹하고, 붉은색 콜로니가 나타날 때까지 30 °C에서 2~3일 동안 배양합니다. 한천 플레이트의 붉은색 콜로니를 사용하여 소형 진탕 플라스크에 담긴 3 mL의 SD-trp 배지에 접종하고, 30 °C에서 120-150 rpm으로 진탕하며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양한 배양액 1 mL를 진탕 플라스크의 20 mL SD-trp에 접종하고 8시간 동안 성장시킵니다.

SD-trp 배지를 사용하여 배양액의 OD600을 0.2로 조정하고, 배양액 10 mL를 사용하여 SD-trp 배지 100 mL가 담긴 플라스크 2개에 접종합니다. 배양액을 30 °C에서 overnight으로 진탕 배양합니다. 그다음, 배양액의 OD600을 측정하고 120 OD600 unit에 해당하는 세포를 펠렛화합니다.

예를 들어, OD600 수치가 1.2로 측정된 경우, 시료 100 milliliters를 원심 분리하여 상층액을 버리고, 미리 데워둔 2xYPAD 800 milliliters를 사용하여 펠렛을 두 개의 쉐이커 플라스크에 재부유시킨 후 30 degrees Celsius에서 배양합니다. 효모 배양액을 30 degrees Celsius, 120-150 rotations per minute 조건에서 배양하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 OD600 수치가 0.6에 도달할 때까지 약 1.5시간마다 OD600을 측정합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 연어 정자 DNA, Te Lithium OAc 및 PEG Lithium OAc를 준비한 후, 효모 배양액 800 milliliters를 700 x G에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 총 200 milliliters의 멸균 2중 증류수에 재현탁합니다. 그 후 세포를 다시 펠릿화하고 상층액을 버립니다.

펠릿을 16 milliliters의 Te Lithium OAc 혼합액에 다시 현탁하고 샘플을 다시 원심 분리합니다. 그 다음 상층액을 제거하고, 9.6 milliliters의 Te Lithium OAc를 사용하여 펠릿을 다시 현탁합니다. 적절한 크기의 반응 용기에 peak Add HAC DNA 라이브러리 벡터 7 micrograms, 2% salmon sperm DNA 100 microliters, 그리고 PEG Lithium OAc 혼합액 2.5 milliliters를 넣어 12개의 바이알을 준비합니다.

이전에 준비한 효모 세포 현탁액 600 µL를 12개의 바이알 각각에 넣고 1분 동안 격렬하게 혼합합니다. 그다음, 30 °C 항온 수조에서 45분 동안 반응시키며 15분마다 혼합합니다. 이어서, 모든 바이알에 DMSO 160 µL를 첨가하고 격렬하게 혼합합니다.

그 다음 바이알을 42 °C에서 20분 동안 추가로 배양합니다. 세포를 펠렛화한 후, 상층액을 제거하고 3 mL의 2xYPAD를 사용하여 각 펠렛을 재부유시킵니다. 12개 바이알의 모든 세포를 100 mL 흔들 플라스크에 모으고, 효모를 30 °C, 120 rpm에서 90분 동안 배양합니다.

배양 후, 세포를 펠렛화하여 상층액을 제거한 다음, 10 mL 세롤로지컬 피펫과 4.5 mL의 멸균 0.9% sodium chloride를 사용하여 조심스럽게 파이펫팅함으로써 펠렛을 완전히 재부유시킵니다. 현탁액 50 µL를 취하고 0.9% sodium chloride를 사용하여 1:10부터 1:1000까지 10배 단계 희석액을 준비합니다. 그다음, 각 희석액 100 µL를 SD-trp-leu agar가 포함된 90 mm 페트리 접시에 도말합니다.

희석하지 않은 나머지 효모 현탁액을 SD-trp-leu-His-ade 한천이 들어 있는 16x150 밀리미터 직경의 페트리 접시에 도말합니다. 플레이트를 30 degrees Celsius에서 배양하며, SD-trp-leu 플레이트는 3일 동안, SD-trp-leu-his-ade 플레이트는 4일 동안 배양합니다. SD-trp-leu 선택 플레이트에서 서로 다른 단계별 희석액의 콜로니 수를 세어 형질전환 효율을 결정합니다.

멸균된 피펫 팁을 사용하여 각 클론을 선택하고 새로운 SD-trp-leu-his-ade 선택 배지에 스트리킹하여 옮깁니다. 플레이트를 30 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 총 5회의 계대 배양이 완료될 때까지 매일 클론 전이 과정을 반복합니다.

클론을 분석하기 위해, 멸균 후드 아래에서 각 클론당 1 mL의 SD-trp-leu-his-ade가 담긴 멸균 2 mL 반응 튜브를 준비합니다. 가열된 바늘을 사용하여 각 튜브에 구멍을 뚫고, 가스 투과성 씰러로 구멍을 덮습니다. 각 바이알에 한 클론의 신선한 콜로니 물질을 접종하고, 30 °C, 150 rpm 조건에서 24시간 동안 바이알을 배양합니다.

세포를 펠렛화한 후 상층액을 제거하고, 펠렛을 적절한 완충액에 재현탁하여 새로운 2 mL 반응 튜브로 옮깁니다. 현탁액에 산 세척된 유리 비드 100 µL를 첨가하고 튜브를 5분 동안 격렬하게 혼합합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 정제합니다.

자가 활성화 분석의 예상 결과 및 그 해석에 대한 요약이 본 표와 그림에 제공됩니다. 약한 자가 활성화는 trp-leu-his 결핍 선택 배지에서는 성장을 유도하지만, trp-leu-his-ade 결핍 선택 배지에서는 성장을 유도하지 않습니다. 반면, 강한 자가 활성화 베이트(bait)가 형질전환된 효모는 trp-leu-his-ade 결핍 배지에서 성장합니다.

미끼(bait)와 먹이(prey)의 성공적인 공동 형질전환은 trp와 leu가 결핍된 선택 배지에서의 성장으로 확인됩니다. 미끼 단백질과 먹이 단백질의 상호작용은 NMY51의 his 및 ade 영양요구성(oxytrophy)의 상보 작용을 유도합니다. 여기 제시된 것은 효모 이중 하이브리드(Yeast 2 Hybrid) 실험에서 미끼와 먹이 사이의 상호작용 예시입니다. malus domestica의 숙주 상호작용 파트너인 MdTCP24와 MdTCP25가 확인되었으며, 이펙터(effector)를 이용한 de novo 원추 형질전환을 통해 상호작용이 입증되었습니다.

숙련된 경우, 필요한 모든 장비와 재료, 특히 효모를 사전에 적절히 준비한다면 효모 이중 하이브리드법을 하루 만에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 오염을 방지하는 것이 중요하며 항상 무균 상태에서 작업해야 합니다. 본 절차를 마친 후에는 발견된 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위해 예를 들어 이분자 형광 상보법(bimolecular fluorescence complementation)과 같은 또 다른 독립적인 방법을 수행해야 합니다.

효모나 하이브리드 그 자체는 위양성 결과를 생성하기 쉬우므로 이는 특히 중요합니다. 개발 이후, 이 기술은 많은 다양한 연구 분야의 연구자들이 단백질-단백질 상호작용, 특히 숙주-병원체 상호작용 및 기타 여러 생물학적 연구 분야와 관련된 분자적 원리를 더 잘 이해할 수 있는 길을 열어주었습니다. 또한, 이 방법은 적절한 설비를 갖춘 분자 생물학 실험실이라면 어디서든 쉽게 수행 가능하다는 것을 알게 될 것입니다.

특정 화학 물질, 메스 및 개방형 화염을 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행할 때는 항상 특정 예방 조치를 고려해야 한다는 점을 잊지 마십시오. 즉, 장갑 및 고글과 같은 개인 보호 장구와 일반 실험실 안전 장비를 사용해야 합니다.